Summary
Een op optische dichtheid gebaseerde microplaatmethode wordt beschreven om de bacteriële groei op lange termijn te kwantificeren in aanwezigheid van bacteriofagen, geschikt voor actinomyceten en andere langzaam groeiende bacteriën. Deze methode omvat aanpassingen om verdamping en dekselcondensatie te verminderen en R-code om virusinfectiestatistieken te berekenen, inclusief het gebied onder de curve, het groeimaximum en de relatieve virulentie.
Abstract
Bacteriofagen zijn een belangrijk onderdeel van natuurlijke omgevingen en ze hebben een krachtig vermogen om bacteriële populaties te vormen. Om te begrijpen hoe individuele fagen interageren met langzaam groeiende bacteriële gastheren zoals actinomyceten, is een eenvoudige en betrouwbare methode nodig voor het kwantificeren van bacteriële groei op lange termijn in de aanwezigheid van fagen. Spectrofotometrische microplaatlezers maken herhaalde metingen met een hoge doorvoer mogelijk, maar het incuberen van een klein volume voor een langere tijd kan technische uitdagingen opleveren. Deze procedure past een standaard 96-well microplaat aan om de co-kweek van fagen en bacteriën mogelijk te maken zonder subbemonstering gedurende 96 uur, waarbij de bacteriegroei elke 8 uur wordt geregistreerd met behulp van spectrofotometrische absorptiewaarden. Deze optische dichtheidswaarden worden geanalyseerd met behulp van R om infectiestatistieken op te leveren, waaronder de procentuele groeiremming, relatieve virulentie en de Stacy-Ceballos-index. De hier beschreven methoden bieden een effectieve manier om experimenten met de microplaatgroeicurve van langere duur uit te voeren en te analyseren en omvatten wijzigingen om verdamping en condensatie van het deksel te verminderen. Deze protocollen vergemakkelijken microplaatgebaseerde testen van interacties tussen langzaam groeiende bacteriële gastheren en hun bacteriofagen.
Introduction
Bacteriofagen of fagen zijn virussen die bacteriën infecteren. Ze zijn de meest talrijke biologische entiteiten op de planeet1, en het is algemeen aanvaard dat bacteriofagen de bacteriële evolutie en ecosysteemprocessen beïnvloeden 2,3,4. Er bestaan verschillende methoden om bacteriofaaggastheerbereik 8 en infectiedynamiek5,6 te beschrijven, te meten en te analyseren, waaronder op agar gebaseerde methoden zoals de dubbellaagse agarmethode7 en op optische dichtheid gebaseerde microplaatmethoden8,9,10,11,12. Elke methode heeft zijn eigen voor- en nadelen. Vanwege hun efficiëntie zijn platingtests met behulp van de dubbellaagse agar-methode de "gouden standaard" voor gastheerbereiktests, maar deze methode is tijd- en arbeidsintensief9. Snelle microplaatmethoden, die resultaten binnen 24 uur of minder retourneren, geven uitstekende resultaten voor snelgroeiende bacteriële gastheren zoals Escherichia coli 9,10,11,12, maar zijn te kort om bacteriofaaginfectieprogressie te laten zien in langzamer groeiende bacteriële gastheren zoals actinomyceten 7,13,14,15.
Een op optische dichtheid gebaseerde microplaattest die is ontworpen voor snelgroeiende bacteriën kan niet worden uitgevoerd gedurende de meerdere dagen die nodig zijn om de infectiedynamiek in een langzaam groeiende gastheerbacterie te karakteriseren zonder dat verdamping optreedt en kunstmatig hoge bacteriële dichtheden geeft. Het verkrijgen van vergelijkbare gegevens met een hoge doorvoer over bacteriofaaginfectiedynamiek voor langzaam groeiende bacteriesoorten vereist dus gespecialiseerde technieken die zijn aangepast aan deze bacteriën.
De hier gepresenteerde microplaatmethode vermindert de verdamping, waardoor langzaam groeiende bacteriën gedurende een langere periode van 96 uur samen met een faag kunnen worden gekweekt en onderzoek naar faaginfectiedynamiek en gastheerbereik mogelijk is. Deze methode toont ook de Stacy-Ceballos-index16, een op optische dichtheid gebaseerde metriek die virulentievergelijkingen tussen ongelijksoortige gastheer-virussystemen mogelijk maakt.
Protocol
Hoewel dit protocol is geschreven voor Gordonia terrae, is het ook met succes gebruikt voor Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta en Gordonia westfalica.
1. Bereiding van bacteriën
- Gebruik in een bioveiligheidskast goede microbiologische praktijken17 om een enkele kolonie Gordonia terrae CAG3 te enten in een steriele verbijsterde kolf van 1 L met 200 ml peptongistcalciumbouillon18 (PYCa) met 0,01 mg / ml cycloheximide (zie de tabel met materialen).
- Incubeer de kolf bij 30 °C met schudden bij 250 rpm tot de kweek verzadigd is of gedurende 3 dagen7.
- Verdun de verzadigde G. terrae-cultuur serieel in PYCa-bouillon en spreid 100 μL elk van de 10−4, 10−5 en 10−6 verdunningen op PYCa-platen19,20. Koel de onverdunde verzadigde cultuur bij 4 °C.
- Incubeer de spreidplaten omgekeerd gedurende 3 dagen bij 30 °C.
- Identificeer na incubatie een "telbare plaat", een plaat met 20-200 kolonies. Tel het aantal kolonies op die plaat en bereken de kolonievormende eenheden per milliliter (kve/ml)19,20.
- Verdun de verzadigde cultuur met PYCa-bouillon tot 4,0 x 106 kve/ml bacteriën.
2. Faagvoorbereiding
OPMERKING: De gerapporteerde representatieve resultaten werden verkregen met de Gordonia-faag DelRio21, een gematigde bacteriofaag geïsoleerd op G. terrae. Deze methoden zijn ook met succes gebruikt met andere Gordonia-fagen .
- Begin met een geïsoleerde bacteriofaag en verdun het faagmonster serieel in faagbuffer7 tot een verdunning van 1 x 10−8 . Voer een dubbellaagse agarfaagtitertest7 uit door 0,3 ml van de verzadigde G. terrae-cultuur te infecteren met 10 μL van elke faagverdunning. Na een incubatie van 5-10 minuten op kamertemperatuur, combineert u het bacterie-faagmengsel met 3 ml PYCa-topagar en giet u op PYCa-agarplaten.
- Incubeer de platen omgekeerd bij 30 °C gedurende 3 dagen of totdat plaqueszich 7 vormen.
- Identificeer na incubatie een "telbare plaat", een plaat met 20-200 plaques. Tel het aantal plaques op die plaat en bereken plaquevormende eenheden per milliliter (pfu/ml)7.
3. Microplaatvoorbereiding
OPMERKING: Voor deze methode moeten 96-puts microplaten met platte bodem (zie de materiaaltabel) worden gebruikt. Alle plaatvoorbereiding en -belading moeten in een bioveiligheidskast worden voltooid en er moeten goede microbiologische praktijken17worden toegepast.
- Bereid de anti-fog dekselcoatingoplossing door 100 μL Triton-X 100, 40 ml 100% isopropanol en 160 ml gedeïoniseerd water22 te combineren. Roer om te mengen en bewaar bij kamertemperatuur.
- Voeg in een bioveiligheidskast 6 ml dekselcoatingoplossing toe aan het binnenoppervlak van een steriel 96-well microplaatdeksel, houd het deksel bij de randen en draai het om ervoor te zorgen dat het door de oplossing wordt bedekt. Laat de oplossing 20 s op het deksel zitten, giet de oplossing eraf en keer het deksel onder een hoek om op een geautoclaveerde papieren handdoek totdat het deksel volledig droog is, wat meestal 35-45 minuten duurt. Zorg ervoor dat u het deksel bij de randen houdt.
- Bereid 20 ml 0,1% agarose in water voor elke 96-well microplaat, microwaving om de agarose te smelten.
- Zodra de agarose is afgekoeld tot 50-60 °C, pipet 100 μL van de 0,1% agarose in alle ruimten tussen de putjes van de plaat en 200 μL agarose in de putjes in rij A en rij H en kolom 1, kolom 2, kolom 11 en kolom 1223 (figuur 1).
4. De plaat laden met bacteriën en faag
OPMERKING: Alle plaatvoorbereiding en -belading moeten in een bioveiligheidskast worden voltooid en er moeten goede microbiologische praktijken17 worden toegepast.
- De 96-well plaat bevat 75 μL van 2,0 x 106 kve / ml bacteriën in elke put9. Verdun de 4,0 x 10 6 kve/ml bacteriecultuur 1:1 met 2x PYCa bouillon tot 2,0 x 106 kve/ml. Bereid 5 ml per plaat met 96 putten.
- Verdun het faaglysaat met behulp van faagbuffer7 om 1 ml elk van 2,0 x 106 pfu/ml, 2,0 x 105 pfu/ml en 2,0 x 104 pfu/ml concentraties te maken. Dit zorgt voor een multipliciteit van infectie (MOI) van 1, 0,1 en 0,01 binnen de microplaat9.
- Om de microplaat te laden, neemt u een plaat die is bereid met een anticondensoplossing en agarose en pipet u 75 μL van de 2,0 x 106 kve / ml bacteriën in kolommen 3-10, volgens figuur 1.
- Voeg aan kolom 3 en kolom 4 75 μL steriele faagbuffer toe aan elke put om te dienen als een niet-faagpositieve controle, overeenkomstig figuur 1, en pipet op en neer om na elke toevoeging te mengen. Voeg 75 μL van de faag van 2,0 x 10 6 pfu/ml toe aan kolom 5 en kolom6 , 75 μl van de faag van 2,0 x 105 pfu/ml aan kolom 7 en kolom 8, en 75 μl van de faag van 2,0 x 104 pfu/ml aan kolom 9 en kolom 10, pipetterend op en neer om na elke toevoeging te mengen.
- Plak beide korte zijden van de plaat af met 0,5 in etiketteertape om de plaat gedeeltelijk af te dichten en tegelijkertijd gasuitwisseling mogelijk te maken.
5. Incubatie- en absorptiemeting
- Zodra de platen zijn geladen met bacteriën en fagen, plaatst u ze op een microplaatschudder bij 250 tpm en incubeert u ze bij 30 °C.
- Incubeer de platen gedurende 96 uur en neem een optische dichtheidsmeting bij 600 nm op een microplaatlezer om de 8 uur vanaf uur 16. Breng de platen tussen de metingen door terug naar de schudder.
OPMERKING: Meetperioden van 4, h 6 h, 8 h en 12 h werden beoordeeld, beginnend bij uur 0, en er werd vastgesteld dat een bemonsteringsperiode van 8 uur beginnend op 16 h na infectie de Gordonia-faaginteracties het best vastlegde. - Controleer het deksel tijdens het experiment op condensatie. Als condensatie wordt waargenomen, vervangt u het deksel door een ander deksel dat is gecoat volgens stap 3.2.
- Genereer controle- en geïnfecteerde groeicurven volgens protocolsectie 6.
6. Data-analyse
- Gebruik een spreadsheetprogramma om de gemiddelde en standaarddeviatie voor elke faagverdunning te berekenen, volgens de spreadsheetlay-out in de Stacy-Ceballos-Index GitHub-opslagplaats (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
- Maak controle- en geïnfecteerde groeicurven en bereken infectiestatistieken met behulp van R (zie de materiaaltabel) met de pakketten DescTools24, dplyr25, ggplot2 26 en readxl27 en volg het R-script in de Stacy-Ceballos-Index GitHub-repository (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
- AUCcon is het gebied onder de niet-geïnfecteerde controlecurve, terwijl AUCinf het gebied onder de geïnfecteerde curveis 16. Bereken de AUC en bereken vervolgens de procentuele groeiremming op basis van het gebied onder de curvewaarden, PIAUC16, met behulp van de volgende vergelijking:
(1 - [AUCinf/AUCcon]) × 100 - De onderbroken horizontale lijnen op elke curve tonen de piekgroei, met de niet-geïnfecteerde groeipiek gelabeld N asymptoot (con) en de geïnfecteerde groeipiek gelabeld Nasymptoot (inf). Identificeer deN-asymptootwaarden en bereken vervolgens het percentage groeiremming op basis van deze piekgroeiwaarden, PImax16, met behulp van de volgende vergelijking:
(1 - [N asymptoot(inf)/ Nasymptoot(con)]) × 100 - Bereken de Stacy-Ceballos-index, ISC16, als volgt uit de PIAUC - en PImax-waarden :
(PIAUC × PImax) 0,5
Bereken de relatieve virulentie door de Stacy-Ceballos-index in de loop van de tijd16 te integreren.
- AUCcon is het gebied onder de niet-geïnfecteerde controlecurve, terwijl AUCinf het gebied onder de geïnfecteerde curveis 16. Bereken de AUC en bereken vervolgens de procentuele groeiremming op basis van het gebied onder de curvewaarden, PIAUC16, met behulp van de volgende vergelijking:
Representative Results
Een experiment is succesvol als de resulterende groeicurve een toename van de positieve controlebacteriepopulatie in de loop van de tijd laat zien zonder plotselinge fluctuatie in absorptie. Voorbeelden van een succesvol experiment bij een MOI van 1 met en zonder een productieve faaginfectie zijn weergegeven in respectievelijk figuur 2 en figuur 3. Een productieve infectie bij een MOI van 0,01 is weergegeven in figuur 4. Het positieve controlegroeipatroon (groene curve) in alle drie de figuren geeft aan dat de bacteriën groeien, dat ze tijdens de groei niet klonteren en dat er geen verontreinigingen aanwezig zijn. Klontering en verontreiniging worden aangegeven door een ongewoon hoge absorptie op een enkel tijdstip. Standaarddeviaties nemen doorgaans toe in de loop van het tijdsverloop van een experiment; Een drastische toename of standaardafwijkingen die overlappen tussen de controle- en geïnfecteerde curven kunnen echter wijzen op besmetting of klontering in een of meer putten.
De groeicurve die een productieve faaginfectie weergeeft, weergegeven door figuur 2, toont een verminderde bacteriële absorptie in de loop van de tijd in putten met de faag toegevoegd. Deze vermindering van de bacteriële dichtheid zal niet worden gezien als de bacterie zich buiten het gastheerbereik van de faag bevindt, zoals weergegeven in figuur 3.
Infectiestatistieken worden getoond voor alle representatieve experimenten, met een relatief grote I SC voor de productieve infecties in figuur 2 en figuur 4 en een zeer kleine ISC in figuur 3 voor de faag die de gastheerbacterie niet efficiënt infecteerde.
Figuur 1: Microplate lay-out. De grijze gebieden zijn gevuld met 0,1% agarose. De blanco putjes in kolom 3 en kolom 4 zijn no-phage positieve controleputten die alleen faagbuffer en 2,0 x 106 kve/ml bacteriën bevatten. De gestippelde putten bevatten faag en 2,0 x 106 kve/ml bacteriën; de grote stippen in kolom 5 en kolom 6 duiden op een MOI van 1 met 2,0 x 106 pfu/ml faag; de middelste stippen in kolom 7 en kolom 8 duiden op een MOI van 0,1 met 2,0 x 105 pfu/ml faag; en de kleine stippen in kolom 9 en kolom 10 geven een MOI van 0,01 aan met 2,0 x 104 pfu/ml faag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een succesvol groeicurve-experiment met een faag bij een MOI van 1 die de gastheerbacterie productief infecteert. De gemiddelde absorptiewaarden (± standaarddeviatie) worden weergegeven voor niet-geïnfecteerde bacteriën (groen) en bacteriën waaraan de faag is toegevoegd (blauw). Afkortingen: AUC = oppervlakte onder de curve; PIAUC = procent groeiremming berekend vanaf het gebied onder de curve; Nasymptoot = piekgroeiwaarde; PImax = procent groeiremming berekend op basis van de piekgroeiwaarden; ISC = Stacy-Ceballos-index. Deze grafiek geeft de gematigde Gordonia-faag DelRio weer die G. terrae infecteert, de bacterie waarop het werd geïsoleerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Een succesvol groeicurve-experiment met een faag bij een MOI van 1 die de gastheerbacterie niet efficiënt infecteert. De gemiddelde absorptiewaarden (± standaarddeviatie) worden weergegeven voor niet-geïnfecteerde bacteriën (groen) en bacteriën waaraan de faag is toegevoegd (blauw). Afkortingen: AUC = oppervlakte onder de curve; PIAUC = procent groeiremming berekend vanaf het gebied onder de curve; Nasymptoot = piekgroeiwaarde; PImax = procent groeiremming berekend op basis van de piekgroeiwaarden; ISC = Stacy-Ceballos-index. Deze grafiek geeft G. rubripertincta infectie door DelRio weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Een succesvol groeicurve-experiment met een faag bij een MOI van 0,01. De gemiddelde absorptiewaarden (± standaarddeviatie) worden weergegeven voor niet-geïnfecteerde bacteriën (groen) en bacteriën waaraan de faag is toegevoegd (blauw). Afkortingen: AUC = oppervlakte onder de curve; PIAUC = procent groeiremming berekend vanaf het gebied onder de curve; Nasymptoot = piekgroeiwaarde; PImax = procent groeiremming berekend op basis van de piekgroeiwaarden; ISC = Stacy-Ceballos-index. Deze grafiek geeft G. terrae infectie door DelRio weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Deze op optische dichtheid gebaseerde microplaatmethode maakt onderzoek mogelijk naar bacteriofaaggastheerbereik en infectiedynamiek11 en toont het nut van de Stacy-Ceballos-index16 als een maat voor bacteriofaagvirulentie. Hoewel deze methode kan worden gebruikt met elk bacteriofaag-gastheersysteem, is het specifiek ontworpen om snelle microplaatgroeitests 9,10,11 aan te passen voor gebruik met langzamer groeiende bacteriën zoals actinomyceten. Snelle microplaattests kunnen niet worden gebruikt voor langzaam groeiende bacteriën zonder aanpassingen om verdamping en dekselcondensatie aan te pakken. Deze methode beschrijft deze noodzakelijke wijzigingen en demonstreert voor het eerst het gebruik van de Stacy-Ceballos-index en gerelateerde statistieken16 om bacteriofaaginfectie te beschrijven.
Verdamping kan een aanzienlijke uitdaging zijn in meerdaagse 96-well plaatgroeicurve-assays; Deze methode lost dat probleem op door Agarose toe te voegen aan de grensputten en de ruimtes tussen de putten. De agarose marge, gecombineerd met de anti-fog dekselbehandeling22, zorgt voor de nodige vochtigheid in de microplaat en maakt betrouwbare optische dichtheidsmetingen mogelijk. Zonder de toegevoegde vochtigheid treedt aanzienlijke randeffectverdampingop 23 tijdens de vereiste lange incubatietijd, wat leidt tot kunstmatig hoge optische dichtheidsmetingen. De anti-condens dekselbehandeling is een noodzakelijke aanpassing omdat dekselcondensatie ook de optische dichtheidswaarden kunstmatig kan verhogen. Het schudden van de platen tijdens de incubatietijd is een aanbevolen modificatie, omdat actinomycete-bacteriën tijdens de groei kunnen klonteren, kunstmatig hoge optische dichtheidswaarden geven en de veelheid van infecties effectief verminderen.
De verhouding tussen bacteriën en fagen in experimenten die de infectiedynamiek karakteriseren, is van cruciaal belang, omdat er voldoende faag moet zijn om een infectie-effect te laten zien, maar niet zo veel dat de bacteriepopulatie van de gastheer onmiddellijk crasht9 of de frequentie van lysogenie dramatisch wordt verhoogd28. In deze methode was de verhouding die het meest effectief bleek voor het verkrijgen van consistente resultaten een MOI van 1, maar bruikbare resultaten werden ook verkregen met MOI's van 0,1 en 0,01. Bij het implementeren van deze methode wordt aanbevolen om één concentratie bacteriën te kiezen en meerdere faagconcentraties te testen in het MOI-bereik van 0,01-1 9,10,11.
Met deze hier beschreven techniek kunnen bacteriofaag-gastheerinteracties worden beoordeeld op langzaam groeiende bacteriën in microplaattests met hoge doorvoer in plaats van met subbemonstering uit een grotere kweekkolf bij elk meetinterval29. Verder, door aan te tonen hoe microplaatgroeitests 9,10,11 kunnen worden aangepast, verhoogt deze techniek het nut van andere op microplaten gebaseerde bacteriofaagtests voor langzamer groeiende bacteriën, waaronder faagkarakterisering 5,6,12 en evolutiestudies 30,31. Ten slotte demonstreert deze methode het gebruik van de Stacy-Ceballos-index16 om bacteriofaaginfectie te beschrijven. Deze metriek is oorspronkelijk ontwikkeld met gegevens van een archaeaal virusmodelsysteem en wordt berekend op basis van optische dichtheidswaarden, waardoor het wijdverspreide nut heeft voor ongelijksoortige virussystemen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een NSF DBI Biology Integration Institute (BII) subsidie (toekenning nr. 2119968; PI-Ceballos) en door het Arkansas INBRE-programma, met een subsidie van het National Institute of General Medical Sciences , (NIGMS), P20 GM103429 van de National Institutes of Health. De auteurs waarderen ook de steun van het Patterson Summer Undergraduate Research Program aan de Ouachita Baptist University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Omni-Pur | 2090 | for filling border wells of microplate |
| Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch | Corning | 3931 | replacement microplate lid |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A461-4 | for lid coating |
| Microplate reader | Tecan Spark 20M | ||
| Microplate Shaker with 4-Place Platform | Thermo Fisher Scientific | 88-861-023 | to shake plates during incubation |
| Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well | Falcon (a Corning Brand) | 351172 | microplate for growth curve assay |
| Peptone yeast calcium (PYCa) agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 15 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide |
|
| Peptone yeast calcium (PYCa) broth | Homemade, from Reference 16 | 1 g peptone 15 g yeast extract 990 mL dd H2O 4.5 ml 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide |
|
| Peptone yeast calcium (PYCa) top agar | Homemade | 1 g peptone 15 g yeast extract 4 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose |
|
| Petri plates | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | for determination of bacterial concentration and phage titer assay |
| Phage Buffer | Homemade, from Reference 7 | 10 mL 1 M Tris, pH 7.5 10 mL 1 M MgSO4 4 g NaCl 980 ml dd H2O |
|
| R software | https://www.r-project.org/ | version 4.3.0 | |
| Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure | Thermo Fisher Scientific | 4116-1000 | for bacterial culture |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | for lid coating |
References
- Mushegian, A. R. Are there 1031 virus particles on Earth, or more, or fewer. Journal of Bacteriology. 202 (9), e00052-e00020 (2020).
- Chevallereau, A., Pons, B. J., van Houte, S., Westra, E. R. Interactions between bacterial and phage communities in natural environments. Nature Reviews Microbiology. 20 (1), 49-62 (2022).
- Olszak, T., Latka, A., Roszniowski, B., Valvano, M. A., Drulis-Kawa, Z. Phage life cycles behind bacterial biodiversity. Current Medicinal Chemistry. 24 (36), 3987-4001 (2017).
- Weitz, J. S., et al.
- Turner, P. E., Draghi, J. A., Wilpiszeski, R. High-throughput analysis of growth differences among phage strains. Journal of Microbiological Methods. 88 (1), 117-121 (2012).
- Storms, Z. J., Teel, M. R., Mercurio, K., Sauvageau, D. The virulence index: A metric for quantitative analysis of phage virulence. PHAGE. 1 (1), 27-36 (2020).
- Poxleitner, M., Pope, W., Jacobs-Sera, D., Sivanathan, V., Hatfull, G. Phage Discovery Guide. , Available from: https://seaphagesphagediscoveryguide.helpdocsonline.com/home (2012).
- Martinez-Soto, C. E., et al. PHIDA: A high throughput turbidimetric data analytic tool to compare host range profiles of bacteriophages isolated using different enrichment methods. Viruses. 13 (11), 2120-2137 (2021).
- Rajnovic, D., Muñoz-Berbel, X., Mas, J. Fast phage detection and quantification: An optical density-based approach. PLoS One. 14 (5), e0216292 (2019).
- Xie, Y., Wahab, L., Gill, J. J. Development and validation of a microtiter plate-based assay for determination of bacteriophage host range and virulence. Viruses. 10 (4), 189-204 (2018).
- Sørensen, P. E., et al. Classification of in vitro phage-host population growth dynamics. Microorganisms. 9 (12), 2470-2486 (2021).
- Konopacki, M., Grygorcewicz, B., Dołęgowska, B., Kordas, M., Rakoczy, R. PhageScore: A simple method for comparative evaluation of bacteriophages lytic activity. Biochemical Engineering Journal. 161, 107652 (2020).
- Holt, J. G., Krieg, N. R., Sneath, P. H. A., Staley, J. T., Williams, S. T. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology., 9th edition. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (1994).
- Fusconi, R., Godinho, M. J. L., Bossolan, N. R. S. Culture and exopolysaccharide production from sugarcane molasses by Gordonia polyisoprenivorans CCT 7137, isolated from contaminated groundwater in Brazil. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (7), 937-943 (2007).
- Bujold, A. R., Lani, N. R., Sanz, M. G. Strain-to-strain variation of Rhodococcus equi growth and biofilm formation in vitro. BMC Research Notes. 12 (1), 519 (2019).
- Ceballos, R. M., Stacy, C. L. Quantifying relative virulence: When µmax fails and AUC alone just is not enough. Journal of General Virology. 102 (1), 001515 (2021).
- Siddiquee, S. The basic concept of microbiology. Practical Handbook of the Biology and Molecular Diversity of Trichoderma Species from Tropical Regions. , Springer. Cham, Switzerland. 1-15 (2017).
- Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Genome sequence and characterization of the Tsukamurella bacteriophage TPA2. Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1389-1398 (2011).
- Van Alst, A. J., LeVeque, R. M., Martin, N., DiRita, V. J. Growth curves: Generating growth curves using colony forming units and optical density measurements. JoVE Science Education Database. Microbiology. , Available from: https://www.jove.com/v/10511/growth-curvesgenerating-growth-curves-using-colony-forming-units (2023).
- Wise, K. Preparing spread plates protocols. American Society for Microbiology. , Available from: https://asm.org/ASM/media/Protocol-Images/Preparing-Spread-Plates-Protocols.pdf (2006).
- Mathes, H. N., et al. Complete genome sequences of Chop, DelRio, and GrandSlam, three Gordonia phages isolated from soil in Central Arkansas. Microbiology Resource Announcements. 12 (5), e0002323 (2023).
- Krishnamurthi, V. R., Niyonshuti, I. I., Chen, J., Wang, Y. A new analysis method for evaluating bacterial growth with microplate readers. PLoS One. 16 (1), 0245205 (2021).
- Evoluted New Media. Beating the edge effect. Laboratory News. , Available from: http://www.labnews.co.uk/article/2028052/beating_the_edge_effect (2011).
- Signorell, A. DescTools: Tools for descriptive statistics, R package version 0.99.49. DescTools. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=DescTools (2023).
- Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K., Vaughan, D. dplyr: A grammar of data manipulation, R package version 1.1.2. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2023).
- Wickham, H., et al. ggplot2: Create elegant data visualisations using the grammar of graphics, R package version 3.4.2. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggplot2 (2023).
- Wickham, H., Bryan, J. readxl: Read excel files, R package version 1.4.2. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=readxl (2023).
- Yao, T., Coleman, S., Nguyen, T. V. P., Golding, I., Igoshin, O. A. Bacteriophage self-counting in the presence of viral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (51), 2104163118 (2021).
- Fang, Q., Feng, Y., McNally, A., Zong, Z. Characterization of phage resistance and phages capable of intestinal decolonization of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in mice. Communications Biology. 5, 48 (2022).
- Burrowes, B. H., Molineux, I. J., Fralick, J. A. Directed in vitro evolution of therapeutic bacteriophages: The Appelmans protocol. Viruses. 11 (3), 241 (2019).
- Shapiro, J. W., Williams, E. S. C. P., Turner, P. E. Evolution of parasitism and mutualism between filamentous phage M13 and Escherichia coli. PeerJ. 4, e2060 (2013).
