Summary
Hier beschrijven we de constructie van een basis driedimensionaal (3D) intestinale cellijnmodelsysteem en een paraffine-inbeddingsprotocol voor lichtmicroscopische evaluatie van vaste darmequivalenten. Kleuring van geselecteerde eiwitten maakt de analyse van meerdere visuele parameters van een enkel experiment mogelijk voor mogelijk gebruik in preklinische onderzoeken naar geneesmiddelen.
Abstract
Er is een toename in het gebruik van in vivo en in vitro darmmodellen voor het bestuderen van de pathofysiologie van inflammatoire darmziekten, voor de farmacologische screening van potentieel heilzame stoffen en voor toxiciteitsstudies op potentieel schadelijke voedingsbestanddelen. Relevant is dat er momenteel vraag is naar de ontwikkeling van celgebaseerde in-vitromodellen ter vervanging van diermodellen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een basis, "gezond weefsel" driedimensionaal (3D) intestinaal equivalente model met behulp van cellijnen met het dubbele voordeel van zowel experimentele eenvoud (gestandaardiseerd en gemakkelijk herhaalbaar systeem) als fysiologische complexiteit (Caco-2-enterocyten met een ondersteunende immuuncomponent van U937-monocyten en L929-fibroblasten). Het protocol omvat ook paraffine-inbedding voor lichtmicroscopische evaluatie van vaste darmequivalenten, waardoor het voordeel wordt geboden van het analyseren van meerdere visuele parameters uit een enkel experiment. Hematoxyline- en eosine-gekleurde (H&E) gekleurde secties die laten zien dat de Caco-2-kolomvormige cellen een strakke en regelmatige monolaag vormen in controlebehandelingen, worden gebruikt om de werkzaamheid van het model als experimenteel systeem te verifiëren. Door gluten als pro-inflammatoire voedselcomponent te gebruiken, omvatten de geanalyseerde parameters van secties een verminderde monolaagdikte, evenals verstoring en loslating van de onderliggende matrix (H&E), verminderde tight junction-eiwitexpressie zoals blijkt uit occludinekleuring (statistisch kwantificeerbaar) en immuunactivering van migrerende U937-cellen, zoals blijkt uit de cluster van differentiatie 14 (CD14)-kleuring en CD11b-gerelateerde differentiatie in macrofagen. Zoals aangetoond door lipopolysaccharide te gebruiken om darmontsteking te simuleren, zijn aanvullende parameters die kunnen worden gemeten verhoogde slijmkleuring en cytokine-expressie (zoals midkine) die voorafgaand aan fixatie uit het medium kunnen worden geëxtraheerd. Het driedimensionale (3D) basismodel van het darmslijmvlies en de vaste secties kunnen worden aanbevolen voor onderzoeken naar de ontstekingsstatus en de integriteit van de barrière, met de mogelijkheid om meerdere visueel kwantificeerbare parameters te analyseren.
Introduction
De intestinale epitheelbarrière, een eencellige dikke binnenbekleding die verschillende soorten epitheelcellen bevat, vormt de eerste fysieke verdedigingsbarrière of interface tussen de buitenkant en het interne milieu van het lichaam 1,2. Enterocyten van het zuilvormige type vormen het meest voorkomende type epitheelcellen. Deze zijn verantwoordelijk voor het handhaven van de integriteit van de epitheliale barrière door interacties tussen verschillende barrièrecomponenten, waaronder tight junctions (TJ's), die een belangrijke rol spelen bij het aanhalen van de barrière 1,3. De TJ-structuur bestaat uit intracellulaire plaque-eiwitten, zoals zonula occludens (ZO) en cinguline, die samenwerken met transmembraaneiwitten, waaronder occludines, claudines en junctionele adhesiemoleculen (JAM's) die een ritsachtige structuur vormen die de naburige cellen nauw met elkaar verbindt. De transmembraaneiwitten reguleren de passieve paracellulaire diffusie van kleine verbindingen en sluiten toxische grote moleculen uit.
Potentieel giftige voedselverbindingen en voedselcontaminanten stimuleren de productie van inflammatoire cytokines die de epitheliale permeabiliteit verstoort, immuuncellen activeert en chronische darmweefselontsteking veroorzaakt 5,6,7. Daarentegen is gemeld dat verschillende antioxiderende en ontstekingsremmende fytochemicaliën de expressie van inflammatoire cytokines verminderen en de integriteit van de intestinale TJ-barrière verbeteren door het herstel van de expressie en assemblage van TJ-eiwitten 4,6,8. Vandaar dat de regulering van de integriteit van de epitheliale barrière door zowel nuttige als schadelijke verbindingen heeft geleid tot een toename van het gebruik van zowel in vivo als in vitro modellen die gericht zijn op het nabootsen van de darmbarrière voor farmaceutische screening en toxiciteitsstudies. Dit is met name relevant gezien de toenemende belangstelling voor het begrijpen van de pathofysiologie van intestinale darmziekten (IBD), necrotiserende enterocolitis en kanker, die kunnen worden gesimuleerd in experimentele modellen 8,9,10.
Er is vraag naar de ontwikkeling van op cellen gebaseerde in-vitromodellen om de doelstelling van de "3V's" in dierproeven te bereiken. Deze omvatten vervangende alternatieven voor het gebruik van dieren, vermindering van het aantal gebruikte dieren en verfijning in het toepassen van methoden die het leed verlichten 11,12,13. Bovendien zijn de onderliggende moleculaire, cellulaire en fysiologische mechanismen tussen menselijke en muizenmodellen (knaagdieren zijn de meest gebruikte soorten) onderscheidend, wat leidt tot controverse over de werkzaamheid van de muizenmodellen als voorspellers van menselijke reacties12,13. Talrijke voordelen van in vitro menselijke cellijnmodellen zijn onder meer doelbeperkte experimenten, directe observatie en continue analyse13.
Monolagen van het eencellige type in tweedimensionale (2D) culturen hebben als krachtige modellen gediend. Deze kunnen echter niet precies de fysiologische complexiteit van menselijke weefsels reproduceren 8,13,14. Als gevolg hiervan worden 3D-kweeksystemen ontwikkeld met steeds grotere verbeteringen om de fysiologische complexiteit van zowel gezonde als zieke darmweefsels samen te vatten als toolboxen voor risicobeoordeling van de volgende generatie13,14. Deze modellen omvatten 3D Transwell-steigers met diverse cellijnen, organoïdeculturen en microfluïdische apparaten (darm-op-chip) met behulp van zowel cellijnen als organoïden (afkomstig van zowel gezonde als zieke weefsels)8,13,14.
Het 3D-protocol voor het equivalent van de darm "gezond weefsel" dat in de huidige studie werd gepresenteerd, was gebaseerd op het vinden van een evenwicht tussen fysiologische complexiteit en experimentele eenvoud13. Het model is representatief voor een 3D Transwell-steiger, bestaande uit drie cellijnen (enterocyten [de gouden standaard colonadenocarcinoom Caco-2-lijn] met een ondersteunende immuuncomponent [U937-monocyten en L929-fibroblasten]), die een gestandaardiseerd en gemakkelijk herhaalbaar systeem vormen dat van toepassing is op de voorlopige screening van voedingsmoleculen die van belang zijn voor de integriteit van de darmepitheliale barrière en de immuunrespons. Het protocol omvat paraffine-inbedding voor lichtmicroscopische evaluatie van de integriteit van de epitheliale barrière met behulp van vaste intestinale equivalenten. Het voordeel van de huidige aanpak is dat meerdere delen van de ingebedde weefsels kunnen worden gekleurd voor meerdere parameters uit een enkel experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van het 3D-gereconstrueerde darmslijmvliesmodel
OPMERKING: De hele procedure moet worden uitgevoerd in een steriele laminaire stroomkap. Alle stappen in de procedure waarbij de celincubator wordt gebruikt, betekenen dat culturen worden geïncubeerd bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer die 5% CO2 bevat (tenzij anders vermeld in het protocol).
- Voorafgaande voorbereiding van de cellijnen die worden gebruikt in het darmmodelsysteem
- Zaad L929 fibroblastcellen van muizen in een concentratie van 5 x 105 in 5 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 2 mM L-glutamine, 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (pen-streptomycine) in een F25-kolf en kweek het 4 dagen voor de constructie van de darmmodellen in een incubator. Verwijder na 48 uur het medium met behulp van een pipet. Voeg vervolgens vers medium (5 ml) toe en incubeer de cellen verder gedurende 48 uur.
NOTITIE: De cellen moeten voor 80% samenvloeiend zijn voordat ze worden gebruikt. - Zaad Caco-2-cellen (concentratie van 2 x 106) in 10 ml DMEM-medium (met 10% FBS en 1% Pen-Streptokokken) in een F75-celkolf en kweek deze 4 dagen voor de constructie van het darmslijmvliesmodel in een incubator. Vervang na 48 uur het medium zoals beschreven in stap 1.1.1 en incubeer verder gedurende 48 uur tot een confluentie van 80%.
OPMERKING: De cellen moeten zich in een actieve proliferatiefase bevinden: niet te schaars en niet te confluent. Een samenvloeiing van 50-60% wordt aanbevolen. De cellen mogen niet de dag voor het maken van het model worden gezaaid, omdat dit de proliferatieve capaciteit van de cellen zou kunnen vertragen, die dan niet perfect wortel zou schieten in het gereconstrueerde 3D-model. - Voeg U937-cellen die groeien in suspensie (concentratie van 1 x 106) toe aan 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-medium (met 2 mM L-glutamine, 1% natriumpyruvaat, 10% FBS en 1% pen-streptokokken) in een F75-celkolf 2 dagen voorafgaand aan de modelopstelling en plaats gedurende 48 uur in een incubator.
- Zaad L929 fibroblastcellen van muizen in een concentratie van 5 x 105 in 5 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 2 mM L-glutamine, 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (pen-streptomycine) in een F25-kolf en kweek het 4 dagen voor de constructie van de darmmodellen in een incubator. Verwijder na 48 uur het medium met behulp van een pipet. Voeg vervolgens vers medium (5 ml) toe en incubeer de cellen verder gedurende 48 uur.
- Voorbereiding van de Transwell co-culture plaatinzetstukken
- Kies een plaat met 24 putjes met inzetstukken met filters van 0,4 μm.
OPMERKING: Het 0,4 μm-filter is een standaardkeuze in onderzoeken naar geneesmiddelentransport. De filtergroottes van 3 μm en 8 μm worden niet aanbevolen om mogelijke verliezen van de in collageen ingebedde cellen te voorkomen. - Hydrateer met behulp van een pipet de Transwell-filters (hierna membrane-inserts genoemd) met 500 μL Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) onder en boven het filterinzetstuk.
- Sluit de multiwell-plaat en plaats deze minimaal 2 uur in een incubator.
OPMERKING: De membraaninzetstukken kunnen maximaal 24 uur in de HBSS blijven. Deze bewerking kan de dag voor het bouwen van het model worden uitgevoerd. Het is belangrijk dat de membraaninzetstukken volledig gehydrateerd zijn en dat het filter niet uitdroogt, omdat dit het voor het monster moeilijker kan maken om goed te hechten. - Haal de platen na 2 uur (of 24 uur) uit de couveuse. Zuig de HBSS voorzichtig van boven en onder de membraaninzetstukken op met een pipet en laat deze 10 minuten drogen.
- Kies een plaat met 24 putjes met inzetstukken met filters van 0,4 μm.
- Bereiding van de celvrije collageen lamina propria van het basis 3D darmmodelsysteem (DAG 1)
- Bereid een celvrije collageenoplossing in een steriel buisje van 50 ml op ijs dat de volgende componenten in DMEM bevat: 10% foetaal runderserum (FBS), 200 mM L-glutamine, 1% natriumbicarbonaat en 1,35 mg/ml type 1 rattenstaartcollageen.
OPMERKING: Al deze componenten moeten op ijs worden bewaard en met gekoelde pipetpunten aan de DMEM worden toegevoegd. Het Type 1 rattenstaartcollageen moet als laatste worden toegevoegd, omdat dit polymeriseert bij toenemende temperatuur en pH. De hoeveelheid celvrije collageenoplossing die wordt bereid, hangt af van het aantal benodigde darmequivalenten. - Voeg 250 μL van de oplossing toe aan elk plaatinzetstuk (boven het membraanfilter) voor het aantal geselecteerde darmequivalenten en plaats het deksel over de plaat met meerdere putjes. Laat de collageenoplossing polymeriseren bij kamertemperatuur (RT) onder de laminaire stroomkap.
OPMERKING: Afgezien van de overgang naar een meer vaste fase, blijkt polymerisatie ook uit een kleurverandering van geel naar roze. De polymerisatie is meestal binnen 10-15 minuten voltooid.
- Bereid een celvrije collageenoplossing in een steriel buisje van 50 ml op ijs dat de volgende componenten in DMEM bevat: 10% foetaal runderserum (FBS), 200 mM L-glutamine, 1% natriumbicarbonaat en 1,35 mg/ml type 1 rattenstaartcollageen.
- Voorbereiding, celtelling en toevoeging van fibroblast (L929) en monocyten (U937) cellen aan het modelsysteem (DAG 1)
- Verwijder de L929-celkweek (stap 1.1.1) uit de incubator. Zuig het medium met behulp van een vacuümpomp op, vervang het door 5 ml steriele fosfaatbufferzoutoplossing (PBS; zonder Ca en Mg) en spoel de cellen.
- Zuig de PBS op met behulp van een vacuümpomp. Voeg 2 ml van een vooraf bereide trypsine-EDTA-oplossing toe (0,05% trypsine en 0,02% EDTA in PBS) en plaats 3-5 minuten in een incubator.
- Gebruik een omgekeerde microscoop (bijvoorbeeld een Eclipse Ts2, Nikon) om vast te stellen of de cellen loskomen van het adhesieoppervlak. Als dit gebeurt, voeg dan onmiddellijk 2 ml DMEM (met 10% FBS) toe om de trypsinereactie te blokkeren en spoel de cellen.
- Breng de celoplossing over in een steriele buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 645 x g . Gebruik een vacuümpomp om het supernatant op te zuigen.
NOTITIE: Zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort. Het effect van DMEM werd getest op de L929- en U937-cellen en er werd niet aangetoond dat het nadelige effecten had op de groei. - Voeg 1 ml DMEM toe aan de pellet en suspendeer de cellen.
OPMERKING: De cellen moeten homogeen in de oplossing worden gesuspendeerd. - Verwijder 20 μL van de cellen in DMEM en voeg 20 μL Trypan blauwe oplossing toe. Verwijder 20 μL van het mengsel en evalueer de celdichtheid microscopisch met behulp van een celtelkamer.
- Verwijder de U937-celkweek (stap 1.1.3) uit de incubator. Centrifugeer de celoplossing bij 645 x g gedurende 5 minuten. Gebruik een vacuümpomp om het supernatans op te zuigen om verstoring van de pellet te voorkomen.
- Suspendeer de cellen in 1 ml RPMI. Net als bij de L929-cellen, moet u ervoor zorgen dat de cellen homogeen in de oplossing zijn gesuspendeerd.
- Bepaal op dezelfde manier de celdichtheid zoals gerapporteerd in stap 1.4.6.
- Bereid een collageenoplossing zoals beschreven in stap 1.3.1.
OPMERKING: Bij de hoeveelheid oplossing die moet worden gemaakt, moet rekening worden gehouden met 450 μL voor elk inzetstuk (of model). - Bereid een oplossing van DMEM voor die een telling bevat van respectievelijk 50.000 L929-cellen en 15.000 U937-cellen in een volume van 50 μL voor elk te construeren darmequivalente model.
OPMERKING: Het aantal cellen is een kritische factor. Te veel van beide celtypen zouden resulteren in een lamina propria die te vol zit met cellen die niet adequaat georganiseerd zouden zijn. Een inferieur aantal fibroblasten (die collageen genereren) zou resulteren in een minder compacte lamina propria, terwijl te weinig monocyten de immuunrespons op prikkels zouden belemmeren. Op voorwaarde dat het juiste aantal cellen aanwezig is binnen elk aliquot van 50 μL, kan een totaal volume van 600 μL worden bereid voor de 12 filterinzetstukken die in elke plaat met 24 putjes aanwezig zijn. - Voeg in stap 1.4.10 elk aliquot van 50 μl met de cellen toe aan 450 μl collageenoplossing. Meng.
- Bedek de voorgecoate celvrije collageenlamina propria met 500 μL van de collageenbevattende celoplossing voor elk model.
OPMERKING: Het is belangrijk om de volumes snel aan elke bijsluiter toe te voegen, en daarom is het raadzaam om het aantal gereconstrueerde darmslijmvliesmodellen te beperken tot 12 of minder tegelijk. - Sluit de plaat en plaats deze gedurende 2 uur in een incubator om de oplossing te laten opstijven.
- Voorbereiding, celtelling en toevoeging van epitheliale Caco-2-cellen aan het darmmodel (DAG 1)
- Haal de Caco-2 celkweek (stap 1.1.2) uit de incubator. Herhaal de procedures uit stap 1.4.1 met 10 ml PBS voor de eerste spoeling. Voeg vervolgens 5 ml van een vooraf bereide trypsine-EDTA-oplossing toe (0,05% trypsine en 0,02% EDTA in Ca- en Mg-vrij PBS) en plaats gedurende 5-8 minuten in een incubator.
- Herhaal stap 1.4.3 (maar gebruik 5 ml DMEM om de trypsinereactie te blokkeren) tot en met 1.4.6 om de cellen te tellen met behulp van de celtelkamer.
- Bereid een oplossing van DMEM met een telling van 150.000 Caco-2-cellen in 50 μL.
OPMERKING: Het aantal gebruikte cellen is een kritiek punt. Het overschrijden van 150.000 cellen kan resulteren in een compacte, ongeorganiseerde epitheellaag, terwijl met te weinig (minder dan 100.000) de cellen moeite hebben om te groeien en het basale membraan niet voldoende bedekken, waardoor een discontinue darmepitheellaag ontstaat. Zorg ervoor dat de cellen effectief zijn opgehangen. De punt van een pipet van 200 μl kan worden gebruikt om een homogene verdeling te garanderen. Aangezien er op elk moment 12 modellen kunnen worden geconstrueerd, kan een celoplossing van 600 μL worden bereid. - Voeg na de in stap 1.4.14 vereiste 2 uur 50 μl Caco-2-cellen gesuspendeerd in DMEM toe aan het midden van elk basaalmembraan. Sluit het deksel van de multi-well plaat.
- Incubeer gedurende 10 minuten onder de steriele laminaire stroomkap. Breng vervolgens over naar de couveuse gedurende 30 minuten.
- Bereid een DMEM-oplossing met 10% FBS en 1% Pen/Streptokokken.
NOTITIE: Bereid een oplossing voor die voldoende is om een volume van 1 ml per model te gebruiken. - Voeg 500 μL van het medium toe boven het gereconstrueerde model en 500 μL onder het filter.
NOTITIE: Voorzichtigheid is geboden bij het toevoegen van het medium boven het filter om te voorkomen dat de cellen losraken of worden belast. - Sluit het platensysteem met meerdere putjes en plaats het in de couveuse.
- Modelvoorbereiding/vorming en gebruik (DAG 2 tot DAG 6)
- DAG 2: Verwijder de oplossing voorzichtig zowel boven het gereconstrueerde model als onder het filter met behulp van een pipet. Vervang door verse 500 μL verse DMEM (10% FBS en 1% Pen/Streptokokken) boven en onder het filter.
- DAG 3: Herhaal zoals hierboven in stap 1.6.1.
- DAG 4: Herhaal zoals hierboven in stap 1.6.1.
OPMERKING: Dit darmmodel is een statisch cellulair model; Om de afgifte van moleculen en de groei en stimulatie van cellen te bevorderen, is het daarom erg belangrijk dat het medium elke dag wordt vervangen. - DAG 5: Op dit punt is het model volledig gevormd/ontwikkeld. Gebruik deze modellen voor verdere studies.
NOTITIE: De beste tijd om het model te gebruiken is na 5 dagen. Hoewel de cellen langer in een incubator kunnen worden gehouden, is de kans groter dat de epitheelcellen ongecontroleerd groeien naarmate er meer tijd verstrijkt, wat resulteert in een ongeorganiseerde en compacte laag die moeilijk te gebruiken is. - Incubeer de modellen na 5 dagen met toxische (gluten of lipopolysaccharide [LPS]) of heilzame componenten (polyfenolen) die van belang zijn. Voeg deze toe aan het bovenste gedeelte van het gereconstrueerde model dat in het DMEM-medium is opgehangen.
OPMERKING: De geschikte concentratie van elke component van belang moet worden berekend en gesuspendeerd in een DMEM-medium. Niet-behandelde controles die alleen DMEM-medium bevatten, moeten worden opgezet voor vergelijking met de experimentele modellen. - Incubeer de controle- en experimentele modellen gedurende 24 uur in een incubator.
- DAG 6: Verwijder het medium boven en onder het filter met een pipet.
OPMERKING: Het medium kan worden opgeslagen voor volgende enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-type tests om de afgifte van inflammatoire cytokines te meten. Hiervoor moet het medium worden toegevoegd aan steriele injectieflacons en worden bewaard bij -20 ° C voor verdere analyse.
2. Paraffine-inbedding van de gereconstrueerde darmslijmvliesmodellen
NOTITIE: De hele procedure moet worden uitgevoerd onder een chemische zuurkast. Elke stap en de respectieve tijdsbesteding moeten strikt worden nageleefd. Om deze reden is het belangrijk om alle reagentia van tevoren klaar te hebben.
- Stel de paraffinemachine in op 58 °C zodat deze klaar is voor gebruik.
- Breng de membraaninzetstukken over naar schone putjes met behulp van een tang in een steriele plaat met 24 putjes.
- Voeg 500 μL 37% gebufferde formaline in PBS toe boven het filter en 1 ml onder het filter. Sluit het deksel en laat het 2 uur onder de chemische zuurkast staan bij RT.
OPMERKING: Als alternatief kan 4% gebufferde formaline gedurende 1 uur bij RT worden gebruikt. - Verwijder de formaline en voeg HBSS-oplossing zowel boven als onder het filter toe. Verwijder vervolgens de HBSS.
- Maak de lamina propria los van het membraaninzetstuk.
OPMERKING: De cellen van het darmslijmvlies komen meestal heel gemakkelijk los van het membraaninzetstuk, omdat ze niet aan het laatste vastzitten. Bovendien blijven de twee monstercompartimenten (apicaal en basaal) bevestigd, waardoor de 3D-structuur behouden blijft. Als ze om de een of andere reden niet gemakkelijk kunnen worden losgemaakt, is het belangrijk om een steriel wegwerpscalpelmesje te gebruiken om het darmslijmvlies uit het membraaninzetstuk te verwijderen. Het membraaninzetstuk kan worden doorgesneden, waardoor het loskomt van het plastic. Zorg ervoor dat u het monster nooit met het scalpel aanraakt. Het motief voor het verwijderen van het membraaninzetstuk uit de in collageen ingebedde cellen is dat dit filter kan losraken in de daaropvolgende fixatie- of paraffine-inbeddingsfasen, waardoor vergelijkingen tussen darmslijmvliesmodellen onevenredig worden. Bovendien hebben de membraaninzetstukken in het ingebedde gedeelte een andere consistentie, wat het snijden kan verstoren. - Plaats de bekers van 100 ml onder de chemische zuurkast, elk correct geëtiketteerd om één gereconstrueerd darmslijmvliesmodelsysteem op te nemen. Voeg 25 ml 35% ETOH toe aan elk bekerglas en voeg vervolgens het gereconstrueerde darmslijmvlies toe. Incubeer gedurende 10 min.
- Vervang de 35% ethanol door 25 ml 50% ethanol en incubeer gedurende 10 minuten.
- Vervang de 50% ethanol door 25 ml 70% ethanol en incubeer gedurende 10 minuten.
- Vervang de 70% ethanol door 25 ml 80% ethanol en incubeer gedurende 10 minuten.
- Vervang de 80% ethanol door 25 ml 95% ethanol en incubeer gedurende 10 minuten.
- Vervang de 95% ethanol door 25 ml 100% ethanol en incubeer gedurende 10 minuten.
- Vervang de 100% ethanol door nog eens 25 ml 100% ethanol en incubeer gedurende 10 minuten.
- Plaats bekers van 100 ml onder de zuurkast, elk correct geëtiketteerd om één model te bevatten dat wordt onderzocht. Voeg 50 ml xyleen of een histologisch klaringsmiddel toe gedurende 10-20 minuten.
OPMERKING: Histo-Clear (histologisch klaringsmiddel) wordt aanbevolen omdat het middel de helderheid en levendigheid van acidofiele vlekken verbetert. De opruimtijd kan variëren van het ene gereconstrueerde darmslijmvliesmonster tot het andere en moet elke 2-3 minuten worden gecontroleerd op transparantie in uiterlijk. - Zodra de monsters transparant zijn, plaatst u ze in een metalen cassettehouder die vervolgens gedurende 45 minuten in vloeibare paraffine in de verwarmde machine wordt ondergedompeld.
- Vervang de paraffine en laat de monsters nog 45 minuten in de verwarmde machine staan.
- Verwijder de houder van de tissuecassette en plaats deze op ijs om af te koelen. Wanneer de gekoelde monsterblokken loskomen van de metalen houder, kunnen deze verder worden gekoeld bij kamertemperatuur.
- Sla de blokken op bij RT.
NOTITIE: Als het doel is om secties onmiddellijk voor te bereiden, kunnen de blokken bij 4 ° C worden geplaatst, zodat ze bij gebruik goed gekoeld zijn. - Snijd secties van 4 μm met behulp van een microtoom.
- Leg de gesneden delen op glaasjes en droog ze 24 uur in een oven op 37 ° C.
- De dia's zijn klaar voor gebruik. Bewaar ze bij RT totdat H&E histologische kleuring of immuunhistochemische reactie kleuring (antigeen-antilichaamtype) wordt uitgevoerd.
- Voor histochemische kleuring van het immuunsysteem, selecteert u de antilichamen die van belang zijn (hetzij voor de studie van TJ-eiwitten zoals occludine, hetzij voor activering, migratie en differentiatie van monocyten) en detecteert u expressie (via kleuring) met behulp van commerciële kits.
- Meet op dezelfde manier slijm met behulp van de Alcian blue en periodic acid-Schiff (PAS) kleuringskit.
- Kwantificeer de gekleurde TJ-eiwitten van belang, zoals occludine, door het percentage positieve pixels te berekenen op microfoto's die met de microscoop zijn genomen.
- Analyseer foto's van de cellen met behulp van beeldanalysesoftware (bijv. ImageJ2-software [Wayne Rasband, versie 2.9.0/1.53t]).
- Om de analyse van de pixels uit te voeren, verwerkt u de digitale afbeeldingen tot 300 pixels/inch en converteert u ze naar 8 bits. Verwerk vervolgens de binaire afbeeldingen met de plug-in Color Deconvolution om de kleuring van het eiwit van belang te analyseren, in dit geval de permanente rode kleuring van occludine.
- Sla de geselecteerde afbeelding op als een tiff en onderwerp deze aan een "opschonen"-procedure om artefacten te verwijderen met een grafische editor (bijv. Adobe PhotoshopCC [versie 20.0.4]).
- Meet daarna alle interessegebieden met de toepassing Analyseer deeltje van ImageJ2 en rapporteer de gegevens als het aantal pixels.
OPMERKING: Elk experiment moet in drievoud worden uitgevoerd, waarbij voor elke replicatie drie interne replicatievelden worden geanalyseerd. Voor het kwantificeren van slijm kan hetzelfde principe van het meten van de pixels worden toegepast op de beelden die worden gemaakt van respectievelijk het paars-magenta gekleurde neutrale mucines en het helderblauw gekleurde zure slijm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het eerste belangrijke aspect is het bepalen van de aanvaardbaarheid van het basale 3D-darmequivalente slijmvlies voor experimentele doeleinden. Dit wordt uitgevoerd met de meest gebruikte kleuring in histologie- en histopathologielaboratoria, namelijk hematoxyline (kleurt nucleair materiaal diepblauw-paarse kleur) en eosine (kleurt cytoplasmatisch materiaal in verschillende tinten roze). De H&E-kleuring wordt eerst uitgevoerd op een onbehandelde controlegroep, die wordt gekweekt onder dezelfde omstandigheden en hetzelfde tijdsbestek als de experimentele behandelingen. Door het patroon, de vorm en de structuur van cellen te visualiseren, wordt het succes van dit intestinale celmodelsysteem bepaald door de Caco-2-cellen die na 5 dagen een strakke en regelmatige monolaag vormen boven de extracellulaire matrix (ECM)-rijke lamina propria (Figuur 1A). Voorbeelden van modelsystemen die onaanvaardbaar zouden worden geacht voor verdere analyses zijn onder meer systemen die overmatige groei vertonen met ongeorganiseerde epitheellagen, zoals weergegeven na 10 dagen (Figuur 1B). Een bijkomend voorbeeld is een epitheellaag die te dik en ongeorganiseerd is (Figuur 1C), veroorzaakt door het zaaien van overtollige Caco-2-cellen of een overmatige incubatie. Misvorming (figuur 1D), toe te schrijven aan zaaiende cellen die zich niet in een actieve fase van proliferatie bevonden, of aan problemen bij de bereiding van de lamina propria of tijdens fixatie met paraffine (cellen raakten los/geruïneerd), is ook een voorbeeld van een onaanvaardbaar gereconstrueerd darmslijmvlies. Eveneens onaanvaardbaar is het ontbreken van epitheellaagvorming (figuur 1E), wat wijst op het zaaien van te weinig Caco-2-cellen of problemen bij de bereiding van de lamina propria. Met behulp van acceptabele 3D-darmequivalenten, waaruit meerdere secties kunnen worden gegenereerd, kunnen vervolgens verschillende parameters uit één experiment worden onderzocht.
Van de verschillende parameters die kunnen worden geanalyseerd, kan de barrière-integriteit als reactie op pro-inflammatoire inductoren worden gevisualiseerd en kan TJ-eiwitten worden gekleurd en gekwantificeerd en vergeleken met onbehandelde controlemodelsystemen. Hier demonstreren we het pro-inflammatoire effect van 40 μg/ml totaal tarwe-eiwit uit een bron van durumtarwe met een hoog glutengehalte7, zowel op de cellulaire integriteit als op het TJ-occludine-eiwitgehalte (Figuur 2A). Met behulp van H&E histologische kleuring toont het controlemodelsysteem de Caco-2 kolomvormige cellen die een strakke en regelmatige monolaag vormen. Daarentegen bleek het effect van het glutenbevattende eiwitmonster verstoring van de monolaag te veroorzaken, met meer niet-specifieke eosinekleuring (Figuur 2A). Bovendien kan de dikte van de epitheellaag worden gemeten en blijkt deze aanzienlijk te zijn verminderd na blootstelling aan pro-inflammatoire gluten (Figuur 2A,B). Met behulp van een antilichaam tegen occludine (geconjugeerd tot rode chromogeenkleuring) kon occludine-eiwit worden gevisualiseerd en gekwantificeerd. Een significant hoger occludine-eiwitgehalte was duidelijk in de controlegroep in vergelijking met het darmslijmvlies dat gedurende 24 uur werd blootgesteld aan gluteneiwit (Figuur 2A,C).
De intestinale equivalenten die bestaan uit een immuuncomponent (vertegenwoordigd door U937-monocyten) zijn ook ideaal voor het onderzoeken van de effecten van pro-inflammatoire inductoren op de activering, migratie en differentiatie van monocyten in macrofagen. Nogmaals, met behulp van 40 μg/ml totaal tarwe-eiwit geëxtraheerd uit een tarwebron met een hoog glutengehalte, was pro-inflammatoire activering van U937-monocyten in de lamina propria duidelijk uit snelle rode gekoppelde CD14-kleuring (Figuur 3A). Activering wordt gedetecteerd door de verhoogde expressie van dit rood gekleurde membraanglycoproteïne op monocyten en macrofagen. Verhoogd CD14-eiwit werd ook gedetecteerd met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), dat groen kleurt onder immunofluorescentie. Migratie werd aangetoond door de aanwezigheid van geactiveerde U937-cellen in de buurt van de Caco-2-monolaag. Waar de monolaag was gescheurd, bleken de U937-cellen de Caco-2-celmonolaag te zijn binnengedrongen (Figuur 3A). Er was geen bewijs van CD14-gekleurde monocytenmigratie in de controlegroep (Figuur 3A). De differentiatie van monocyten in macrofagen is herkenbaar aan de hand van de marker CD11b. Er was geen CD11b-kleuring zichtbaar in de controlegroep met rood chromogeen of FITC (Figuur 3B). In plaats daarvan werden in de weefsels die aan gluten waren blootgesteld, CD11b-macrofagen waargenomen, zowel in de ECM-rijke lamina propria als in de gescheurde Caco-2-monolaag (Figuur 3B).
Door LPS te gebruiken om darmontsteking te simuleren, laten we hier zien dat het ook mogelijk is om dit modelsysteem te gebruiken om zure mucine en mucopolysacchariden geproduceerd door de Caco-2-cellen in respectievelijk de onbehandelde controle en de LPS-behandeling te onderzoeken (Figuur 4A). Met behulp van Alcian-blauw en PAS-kleuring wordt zuur slijm helderblauw gekleurd en neutrale mucines respectievelijk paars-magenta gekleurd. De mate van slijmkleuring kan op dezelfde manier worden gekwantificeerd en blijkt significant te worden geïnduceerd onder 1 ng/ml LPS-provocatie (Figuur 4B). Bovendien kan het medium voorafgaand aan de fixatie worden verwijderd om de pro-inflammatoire cytokineproductie te onderzoeken. Hoewel er talrijke excretiecytokines kunnen worden gemeten, werd in dit specifieke geval midkine (MDK) geselecteerd. MDK is een endogene ontstekingsmarker die wordt geïnduceerd door de transcriptiefactor, nucleaire factor kappa-light-chain-enhancer van geactiveerde B-cel (NF-κB)-route, en wordt ook geassocieerd met ontstekingsziekten van darmcellen15. Onder de LPS-uitdaging wordt MDK significant geïnduceerd in vergelijking met de controle (figuur 5).
Figuur 1: Onbehandelde controle 3D intestinale equivalenten. Hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuring van onbehandelde 3D-darmequivalenten voor controle (Caco-2 /U937/L929-coculturen) gedurende 24 uur als verificatie van de werkzaamheid van het basismodel van het 3D-darmslijmvlies voor experimentele doeleinden. (A) Een acceptabel experimenteel model wordt vergeleken met onacceptabele modellen, die na 10 dagen overmatige (B) epitheelgroei en ongeorganiseerde lagen laten zien, (C) overmatige dikte en desorganisatie van het epitheel, (D) misvorming en (E) geen epitheelcellaag. De schaalbalk in elke afbeelding is gelijk aan 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Behandelde 3D-darmequivalenten. (A) Hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuring en occludine-expressie van 3D-darmequivalenten (Caco-2 /U937/L929-coculturen) gedurende 24 uur blootgesteld aan 40 μg/ml totaal eiwit uit een modern tarwemengsel met een hoog glutengehalte in vergelijking met de controlegroep (CTRL). De schaalbalk in elke afbeelding is gelijk aan 50 μm. (B) Kwantificering van de dikte van Caco-2-cellen en (C) occludine-rode chromogeenkleuring. Significante verschillen werden bepaald door eenrichtingsvariantie (ANOVA) en weergegeven als *** 0,0001< P < 0,001. De zwarte stippen staan voor het aantal replicaten. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Truzzi et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: CD14- en CD11B-kleuring. CD14-kleuring van U937-monocyten en CD11B U937-gedifferentieerde macrofagen in 3D-darmequivalenten (Caco-2/U937/L929-coculturen) blootgesteld aan geen toegevoegd eiwit (controle [CTRL]) of 40 μg/ml totaal eiwit uit een glutenrijk bevattend modern tarwemengsel na een periode van 24 uur. Voor CD14- en CD11b-kleuring werd snel rood gebruikt als chromogeen en werden kernen tegengekleurd met eosine. De schaalbalk in elke afbeelding is gelijk aan 20 μm. CD14- en CD11b-kleuring met fluoresceïne-isothiocyanaat (groen) werd ook aangetoond onder immunofluorescentie. De kernen werden tegengekleurd met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI). De schaalbalk in elke afbeelding is gelijk aan 50 μm. Pijlen geven de aanwezigheid van monocyten (CD14-positieve cellen) en macrofagen (CD11b-positieve cellen) aan. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Truzzi et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) en slijmexpressie van Alcian Blue/Periodic Acid-Schiff Stain (PAS)-kleuring. (A) Caco-2-cellen in basale 3D-darmequivalenten (Caco-2 /U937/L929 co-culturen) na 24 uur in de onbehandelde equivalente en gereconstrueerde darmslijmvliesmodelsystemen die zijn blootgesteld aan 1 ng/ml lipopolysacharide. De schaalbalk in elke afbeelding is gelijk aan 50 μm. (B) Kwantificering van slijmexpressie werd bepaald door eenrichtingsvariantie (ANOVA) met significantie gerapporteerd als **** P < 0,0001. De zwarte stippen staan voor het aantal replicaten. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Truzzi et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Midkine expressie. Midkine-expressie in het medium van 3D-intestinale equivalenten (Caco-2 /U937/L929 co-culturen) na 24 uur in de onbehandelde controle- (CTRL) en darmslijmvliesmodelsystemen blootgesteld aan 1ng/ml lipopolysaccharide. Kwantificering van midkine-expressie werd bepaald door eenrichtingsvariantie (ANOVA) met significantie gerapporteerd als **** P < 0,0001. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Truzzi et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Schematisch diagram van de constructie en het experimentele gebruik van intestinale equivalenten, alsmede de fixatie en microscopische analyses van parameters uit weefselcoupes. Het schematische diagram geeft een overzicht van de constructie van de intestinale equivalenten en mogelijke experimentele behandelingen die aan deze modellen kunnen worden toegediend. Het genereren van meerdere weefselsecties uit een enkel experiment maakt de analyse mogelijk van talrijke structurele en immuunaspecten van het darmslijmvlies, zoals geïllustreerd in Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3 en Figuur 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier gepresenteerde gereconstrueerde modelsysteem voor het gereconstrueerde darmslijmvlies (figuur 6) combineert fysiologische complexiteit (meer fysiologisch relevante 3D-celculturen met een Caco-2-monolaag met een ECM-rijke lamina propria-ondersteuning die fibroblasten en monocyten bevat) met experimentele eenvoud (het gebruik van commerciële menselijke cellijnen om een gestandaardiseerd en gemakkelijk herhaalbaar systeem te produceren)13. Als zodanig wordt dit modelsysteem beschouwd als een geschikt alternatief voor muizenmodellen die gericht zijn op het evalueren van het effect van potentiële geneesmiddelen/voedselcomponenten op de integriteit van de darmbarrière. In dit verband onderbouwen eerdere artikelen de werkzaamheid van het huidige celkweekmodel bij het testen van zowel potentieel heilzame verbindingen (plus dosisafhankelijkheid) als schadelijke voedselcomponenten 7,16,17. Bovendien kunnen LPS of alternatieve pro-inflammatoire reagentia (2,4,6-trinitrobenzeensulfonzuur of dextraansulfaatnatrium) worden toegevoegd aan het huidige darmslijmvliesmodel om IBD-symptomen te simuleren. Op die manier is het mogelijk om de etiologie van darmziekten te bestuderen vanuit een structureel aspect en vanuit de expressie van cytokines, zoals pro-inflammatoire MDK, een marker van IBD15. Dit basismodelsysteem heeft ook het uiteindelijke potentieel voor drugsscreening voor de bredere bevolking. Hoewel het modelsysteem fysiologisch complexer is dan 2D-modellen13,14, omvatten de beperkingen bij het reproduceren van complexe menselijke fysiologie de afwezigheid van zowel een microfluïdisch systeem (fluïdische perfusie van een continue toevoer van voedingsstoffen en verwijdering van afvalproducten als mechanische stimuli)8,14 en het microbioom (evaluatie van gastheer-microbioominteracties bij darmziekten)8, 14. okt.
Het voordeel van het gebruik van het huidige fundamentele 3D-darmslijmvliesmodel in combinatie met paraffine-inbedding voor lichtmicroscopische evaluatie van de integriteit van de epitheliale barrière is dat verschillende weefselsecties kunnen worden gemaakt van een enkel experiment, waardoor de analyse van talrijke parameters mogelijk wordt. Transepitheliale elektrische weerstand (TEER)3 is een veelgebruikte methode om de integriteit van de darmbarrière te beoordelen en is gebruikt in combinatie met macromoleculaire permeabiliteitsstudies 3,18, evenals breed gerapporteerde onderzoeken naar Western blot-evaluatie van TJ-eiwitexpressie. Western blot-evaluatie biedt kwantitatief inzicht in algemene veranderingen in eiwitexpressie, en TEER dient als een kwantitatieve maatstaf voor de integriteit van de barrière. In plaats daarvan biedt microscopische evaluatie een waardevol hulpmiddel voor de kwalitatieve visualisatie en beoordeling van lokale eiwitveranderingen en -interacties18.
Microscopische evaluatie van een model met een immuuncomponent maakt het mogelijk om immuunresponsen te visualiseren, zoals de differentiatie van monocyten in macrofagen en de migratie van geactiveerde monocyten in de ECM, zoals hier aangetoond door CD14- en CD11b-kleuring. Identificatie kan worden gedaan via immunohistochemie en/of immunofluorescentiekleuring op individuele weefselsecties, zoals werd getoond voor CD14 en CD11b in figuur 3. Immunohistochemie maakt de structurele visualisatie van het gereconstrueerde darmslijmvliesweefsel als geheel mogelijk. Bovendien is het mogelijk om zowel de kernen als het cytoplasma in cellen te identificeren. Confocale immunofluorescentie daarentegen maakt het niet mogelijk om het weefsel als een geheel te zien (alleen de markers van belang en DAPI-gekleurde kernen). Het levert echter een zeer schoon beeld op waarbij de achtergrondkleur wordt geëlimineerd. Het voordeel hiervan is dat het een grotere precisie mogelijk maakt bij het aantonen van de positiviteit of negativiteit van de markers en als zodanig de berekening van eventuele verschillen in kleurintensiteit (bijvoorbeeld een marker die meer tot uiting komt in de ene cel dan in de andere). Mogelijk kan de mate van migratie van de CD14-monocyten vanuit de lamina propria naar de Caco-2-monolaag ook worden geschat op basis van meerdere replicatiebeelden die op verschillende tijdstippen zijn gemaakt. Desalniettemin waren er aanwijzingen voor ontsteking door de aanwezigheid van zowel CD14- als CD11b-gekleurde cellen.
Een bereik van 20-40 μg totaal eiwit wordt door de meeste laboratoria gebruikt voor western blotting19. De kwantificering van talrijke gap junction-eiwitten (occludine, claudine, zonuline en E-caderine) kan worden uitgevoerd door immunohistochemische en/of fluorescerende kleuring op individuele weefselsecties, waardoor respectievelijk aanzienlijk minder eiwit nodig is. Tegelijkertijd, uit hetzelfde experiment, kan de integriteit van de epitheellaag in reactie op verbindingen ook worden gevisualiseerd aan de hand van het patroon, de vorm en de structuur van cellen met H&E-kleuring.
De werkzaamheid van een basis 3D-gereconstrueerd darmslijmvlies voor gebruik bij het kleuren van slijmproductie, TJ-eiwitten en eiwitten geproduceerd uit immuunresponsen is afhankelijk van het overwinnen van kritieke stappen, met name in de constructie van het modelsysteem en tijdens weefselfixatie. Wat betreft de modelconstructie is het van fundamenteel belang om respectievelijk de juiste samenvloeiing te gebruiken en het juiste aantal Caco-2-cellen te zaaien (aangegeven door de opmerkingen in het protocol). Te veel cellen of een verkeerde samenvloeiing zou resulteren in een dikke en ongeorganiseerde epitheellaag. In plaats daarvan zouden te weinig cellen resulteren in een verminderde of een gebrek aan epitheellaagvorming. Even fundamenteel bij het zaaien is de juiste celsamenvloeiing en het juiste aantal L929- en U937-cellen in de ECM, evenals de juiste behandeling van het collageen tijdens de bereiding. Overtollige cellen of snelle polymerisatie van het collageen zouden resulteren in een compacte en misvormde ECM, die op zijn beurt de structuur van de epitheelcellen erboven beïnvloedt. Evenzo zouden te weinig collageenvormende L929-cellen resulteren in een onjuiste consistentie van de ECM, terwijl te weinig U937-monocyten een immuunrespons niet zouden bevorderen. Ook belangrijk is dat cellen na 5 dagen worden gebruikt voor experimenten, omdat een langdurige incubatie zou resulteren in overmatige celgroei, wat resulteert in een compacte epitheellaag. Bovendien, gezien het feit dat het huidige ontwerp geen microfluïdisch systeem heeft en representatief is voor een statisch intestinaal cellulair model, is het erg belangrijk dat het medium elke dag wordt vervangen om de afgifte van moleculen en de groei en stimulatie van cellen te bevorderen. Wat het fixatieprotocol betreft, is de opruimingsfase van cruciaal belang en aangezien de tijd die nodig is om de weefsels transparant te worden in paraffine kan variëren, moet elk darmslijmvliessysteem tijdens deze fase nauwlettend in de gaten worden gehouden. Tijdens de fixatieprocedure moet voorzichtig worden omgegaan met deze modellen om beschadiging te voorkomen.
Concluderend, op voorwaarde dat strikte naleving wordt besteed aan de kritieke punten in de constructie en fixatie van de basale 3D-darmequivalenten, kunnen de modellen tal van weefselsecties bieden voor de evaluatie van meerdere parameters in farmaceutische screening- en toxiciteitsstudies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Met dank aan de Umberto Veronesi Foundation voor een fellowship ter ondersteuning van het werk van onderzoekers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue/PAS kit | ScyTek Laboratories, Inc. | APS-1, APS-2 | kit for immunohistochemical staining |
| Blue Trypan solution | Thermo Fisher | 15250061 | cell count analyses |
| Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells | ATCC | ATCC HTB-37 | cell line |
| Citro-Histo-Clear Limonene based | Histoline laboratories | R0050CITRO | reagent for paraffin embedding |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO | 11965092 | cell colture reagent |
| Embedding Center | Histoline laboratories | TEC2900 | instrument for paraffin embedding |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | A5256701 | cell colture reagent |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 12350039 | cell colture reagent |
| Human Midkine ELISA kit | Cohesion Biosciences | CEK1270 | kit ELISA |
| Inverted microscope | Eclipse Ts2, Nikon | MFA34100 | microscope |
| L929 mouse fibroblasts | ATCC | ATCC ®-CCL1 | cell line |
| LC3-II | Novus Biologicals | NB910-40752SuperNovusPack | antibody |
| L-Glutamine | GIBCO | A2916801 | cell colture reagent |
| Occludin | Novus Biologicals | NBP1-87402 | antibody |
| Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C | Histoline laboratories | R0040 PLUS | instrument for paraffin embedding |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| rat tail collagen type I | GIBCO | A1048301 | cell colture reagent |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) | GIBCO | 21870076 | cell colture reagent |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360070 | cell colture reagent |
| Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher | TF-CACC2FL | cell counting instrument |
| Transwell | Costar Corning | 3413 | plastic for cell colture |
| Trypsin | GIBCO | 15090046 | cell colture reagent |
| U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell line | ATCC | ATCC CRL-1593.2 | cell line |
| UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain Kit | ScyTek Laboratories, Inc. | AMH080 | kit for immunohistochemical staining |
References
- Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (1909).
- Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).
- Suzuki, T. Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions. Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).
- Guibourdenche, M., et al. Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium. Toxics. 9 (6), 135 (2021).
- Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes. Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).
- Truzzi, F., et al. Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).
- Fedi, A., et al. In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review. Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell & Bioscience. 12 (1), 155 (2022).
- Russell, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. Available online. , http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (2023).
- Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
- Jung, S. M., Kim, S. In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases. Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).
- Nitsche, K. S., Müller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review. Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).
- Kekilli, M., et al. Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease. Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).
- Truzzi, F., et al. Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).
- Truzzi, F., et al. Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models. Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).
- Buckley, A. G., et al. Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells. Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
