Summary
Her presenterer vi en protokoll for utvikling og validering av god laboratoriepraksis i kompatibel påvisning av adeno-assosierte virale vektorer i humane tårer ved dråpe digital polymerasekjedereaksjon til støtte for klinisk utvikling av genterapivektorer.
Abstract
Bruken av virale vektorer for å behandle genetiske sykdommer har økt betydelig de siste årene, med over 2000 studier registrert til dags dato. Adeno-associated viral (AAV) vektorer har funnet særlig suksess i behandlingen av øyerelaterte sykdommer, som eksemplifisert ved godkjenning av voretigene neparvovec-rzyl. For å bringe nye terapier til markedet, ber reguleringsorganer vanligvis om kvalifiserte eller validerte biosheddingstudier for å evaluere frigjøring av vektoren i miljøet. Imidlertid har ingen offisielle retningslinjer for utvikling av molekylære baserte analyser for å støtte slike shedding studier blitt utgitt av USA Food and Drug Administration, slik at utviklere kan bestemme beste praksis for seg selv. Formålet med denne protokollen er å presentere en validerbar protokoll for påvisning av AAV-vektorer i humane rifter ved dråpedigital polymerasekjedereaksjon (ddPCR) til støtte for kliniske biosheddingstudier. Dette manuskriptet diskuterer dagens industrielle tilnærminger til molekylær analysevalidering og demonstrerer at metoden overgår akseptkriteriene for målanalysen som for tiden foreslås i hvitbøker. Til slutt diskuteres trinn som er kritiske i utførelsen av enhver ddPCR-analyse, uavhengig av applikasjon.
Introduction
Genterapidefinisjoner varierer, men induserer generelt en forsettlig og ofte forventet permanent veksling av en spesifikk DNA-sekvens av det cellulære genomet for å modifisere eller manipulere uttrykket av et gen eller for å endre de biologiske egenskapene til en levende celle for et klinisk formål 1,2. Virale vektorer blir i økende grad brukt som kjøretøy for genterapi på grunn av deres effektivitet av transduksjon, med en rapport som tyder på at over 70% av dagens kliniske genterapistudier bruker virale vektorer3. Interessen for virale vektorer for genterapi har økt jevnt. Kvartal 4 2022 kvartalsvis datarapport om gen-, celle- og RNA-terapilandskapet fra American Society of Gene and Cell Therapy rapporterte at i 2022 vokste gen-, celle- og RNA-terapirørledningen fra preklinisk til forhåndsregistrering med 7%, noe som brakte det totale antallet terapier under utvikling til 3,726, hvorav 2,053 (55%) var genterapier4. USA Food and Drug Administration (USA FDA) har for tiden godkjent 27 celle- og genterapier for klinisk bruk hos mennesker, hvorav fem spesifikt bruker virale vektorer5.
Adenoassosierte virus (AAV) har fått spesiell interesse som redskap for genterapi. En fersk metaanalyse viste at det har vært omtrent 136 kliniske studier som undersøker bruken av AAVs de siste to tiårene6. I tillegg er tre av de fem USA-godkjente genterapiene AAV-basert. Dette skyldes deres svært redigerbare natur, brede vertsområde som kan justeres basert på bruk av spesifikke naturlig forekommende eller kunstig konstruerte vektorer, lav patogenisitet og toksisitet hos mennesker, og generelt lav immunogenisitet 7,8. AAV har også med hell blitt brukt til å behandle øyesykdommer i en godkjent klinisk setting. Voretigene neparvovec-rzyl er en AAV2-basert terapi som ble godkjent av USAs FDA i 2017 og av European Medicines Agency (EMA) i 2018 for å behandle biallelisk RPE65-mutasjonsassosiert retinal dystrofi9.
Med økende interesse for utvikling av AAV-baserte terapier kommer behovet for regulatorisk veiledning på analyser. Nøyaktig påvisning og kvantifisering av enhver viral vektor er en integrert del av oppdagelsen, produksjonen og prekliniske/kliniske testfaser av produktutviklingen. USAs FDA har begynt å utstede noen veiledning for genterapier, blant annet om kjemi, produksjon og kontroll for human genterapiundersøkelsesapplikasjoner 10, langsiktig oppfølging etter administrering av genterapi 11, replikasjonskompetent retrovirustesting12 og anbefalinger for mikrobielle vektorer som brukes i genterapier 13. EMA har også gitt ut en rekke retningslinjer for utvikling av genterapiprodukter som generelt samsvarer med FDA-anbefalingene, selv om noen forskjeller eksisterer14. Det er viktig å merke seg at selv om disse retningslinjene ikke etablerer juridisk håndhevbare ansvar, bortsett fra der spesifikke forskrifter er referert, gir de klarhet i gjeldende tenkning fra reguleringsorganer om emnet og deres forventninger til analyser som kreves for narkotikaregistreringer og regulatorisk godkjenning.
FDA anbefaler spesifikt at studier bør utføres for å vurdere distribusjon, utholdenhet og clearance av en vektor fra administrasjonsstedet for å målrette okulært og ikke-okulært vev, intraokulære væsker og blod15. Disse tar form av biodistribusjon og shedding studier. Biodistribusjonsstudier evaluerer eksponering ved å undersøke hvordan et produkt spres gjennom en pasients kropp fra administrasjonsstedet. Shedding evaluerer spesifikt frigjøringen av produktet fra pasienten til miljøet og øker muligheten for overføring av vektoren til ubehandlede individer16. FDA gir anbefalinger for utforming av biodistribusjon og shedding studier med hensyn til hyppigheten av prøveinnsamling, varighet av prøveinnsamling, typer prøver samlet, og lagringsforhold.
I tillegg anbefaler FDA bruk av kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR, eller sanntids PCR) for kvantitativ påvisning av vektorgenomer på grunn av sin enkle ytelse, høyt gjennomstrømningsformat, raske behandlingstider og analysefølsomhet. Det er imidlertid en relativ mangel på anbefalinger for design og ytelsesvurdering av molekylære metoder sammenlignet med de som finnes for små og store molekyler. Mange av retningslinjene for slike studier er vanskelige å anvende på molekylære metoder på grunn av den unike og komplekse utformingen av både produktene og analysene selv, noe som reiser spørsmål om hensiktsmessigheten av de tilgjengelige plattformene for de anbefalte vurderingene og passende metoder for analysevalidering. Til dags dato har FDA ikke krevd formell validering av PCR-baserte analyser, selv om EMA har pålagt dette kravet17. I lys av dette tomrommet har ulike grupper og workshops utstedt stortingsmeldinger og anbefalinger som produsenter og oppdragsforskningsorganisasjoner har søkt å følge 18,19,20,21,22,23,24,25. De fleste av disse anbefalingene er skrevet spesifikt med qPCR-analyser i tankene, med forslag eller endringer for nye plattformer, for eksempel dråpedigital PCR (ddPCR), inkludert bare som anses relevant. Nyere anbefalinger har fokusert på hensyn til ddPCR-analyser, men har i stor grad fokusert på deres anvendelser på vektorgenomkvantifisering i en produksjonsinnstilling i stedet for i de komplekse biologiske matrisene som oppstår i biosheddingstudier.
Avhengig av klinisk anvendelse og mål, kan ddPCR foretrekkes fremfor qPCR til støtte for biodistribusjons- og utskillingsstudier på grunn av ddPCRs økte sensitivitet og evne til å håndtere matriksinterferens sammenlignet med qPCR. På grunn av oppdelingen av prøvene i ca. 20 000 dråper, kan man dessuten oppnå nøyaktig kvantifisering av kopinummeret uten bruk av en standardkurve ved hjelp av Poisson-statistikk, noe som forenkler metodeutviklingen og valideringen. Målet med denne protokollen er å beskrive en standardisert tilnærming for utvikling og validering av en ddPCR-basert metode for påvisning av AAV-vektorer i tårer samlet inn fra den okulære overflaten til støtte for kliniske biosheddingstudier.
Protocol
1. Fremstilling av et syntetisk DNA-fragment
- Design og bestill et syntetisk DNA-fragment som inneholder målamplifikasjonsområdet for bruk som kvalitetskontroll.
- Sørg for at sekvensen inneholder hele ampliconsekvensen fra den fremre primeren til den omvendte primeren av målgenet av interesse, med en forlengelse på fire til seks basepar av sekvens ved 5' endene av hver primerbindingssekvens.
- Unngå homopolymerer av adenin og tymin større enn 12 basepar eller guanin- og cytosinbasepar større enn åtte basepar, så lenge homopolymerer kan forstyrre syntesen av genfragmentet.
MERK: Hvis forsterkere inneholder slike sekvenser, kan basesubstitusjoner gjøres så lenge glødestedene for primerne og sondene opprettholdes. - Alternativt kan du forberede et linearisert plasmid som inneholder amplikonet ved hjelp av typiske kloningsstrategier.
- Sentrifuge røret som inneholder det syntetiske DNA-fragmentet i en mikrosentrifuge i ~ 10 s for å sikre at materialet samles i bunnen av røret.
- Resuspender det syntetiske DNA-fragmentet ved hjelp av tris-EDTA (TE) buffer til en konsentrasjon på 1,0 × 1010 kopier/μL, eller etter behov basert på målanalyseområdet.
- Vortex kort, inkuber deretter ved 50 °C i 20 ± 5 min. Avkjøl på is.
- Forbered flere, ideelt engangsalikoter og oppbevar ved -70 til -90 °C til bruk.
MERK: Syntetiske DNA-fragmenter fremstilt på denne måten er vanligvis stabile i minst 24 måneder fra datoen for resuspensjon. - Hvis ønskelig, bestem den nøyaktige konsentrasjonen av den fremstilte syntetiske DNA-bestanden før bruk som kvalitetskontroll, eller estimere den nominelle konsentrasjonen basert på den benyttede resuspensjonen.
2. Klargjøring av primere og sonde
- Design og bestill primere og en hydrolysesonde for å målrette ønsket forsterkningsområde ved hjelp av typiske designstrategier26,27.
- Bruk et 5' fluorescerende reporterfargestoff (f.eks. FAM) og en 3' quencher (f.eks. Iowa Black dark quencher) som er kompatibel med ddPCR-systemet.
MERK: Det finnes mange PCR-analysedesignpakker, og alle kan benyttes. For eksempel er Primer-BLAST av National Center for Biotechnology Information28 mye brukt på grunn av de robuste alternativene for analysedesign og den enkle spesifisiteten som kan vurderes bioinformatisk for å identifisere mulige off-target effekter. Det skal bemerkes at utarbeidelsen av primere og sonder kan variere fra trinnene som er oppført her, avhengig av formatet de leveres i.
- Bruk et 5' fluorescerende reporterfargestoff (f.eks. FAM) og en 3' quencher (f.eks. Iowa Black dark quencher) som er kompatibel med ddPCR-systemet.
- Sentrifuge rørene som inneholder fremoverprimeren, omvendt primer og sonde i en mikrosentrifuge for ~ 10 s til pelletsmateriale til bunnen av røret.
- Resuspender primerne til 20 μM ved hjelp av TE-buffer. Vortex kort.
- Stopp sonden til 10 μM ved hjelp av TE-buffer. Vortex kort.
- Forbered flere, ideelt engangsalikoter og oppbevar ved minimum -20 °C til bruk.
MERK: Primere og sonder tilberedt på denne måten er vanligvis stabile i minst 24 måneder fra datoen for resuspensjon.
3. Tilberedning av prøvefortynningsbuffer
- Tine PCR-buffer og skjært laksesæd-DNA ved romtemperatur. Vortex grundig å blande.
- Klargjør en prøvefortynningsbuffer i henhold til tabell 1.
- Vortex grundig. Oppbevares ved 2-8 °C i opptil 1 måned etter tilberedning.
Tabell 1: Tilberedning av prøvefortynningsbuffer. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
4. Forberedelse av master mix
- Tine ddPCR-masterblandingen for sonder, fremovergrunning, reversprimer og sonde ved romtemperatur og la den varmes opp i minst 10 minutter etter tining før bruk. Oppbevares i romtemperatur inntil bruk.
MERK: Disse reagensene må bringes helt til romtemperatur for å sikre effektiv dråpedannelse. Ikke hold reagenser på is under tilberedning.- Vortex sentrifuge grundig og kort i en minisentrifuge før bruk.
MERK: Restriksjonsenzymer leveres vanligvis i glyserol og bør tas ut av lagring umiddelbart før bruk. Bland forsiktig. Ikke virvel.
- Vortex sentrifuge grundig og kort i en minisentrifuge før bruk.
- Forbered en PCR-masterblanding for hvert forsterkningsmål. Se tabell 2 for en foreslått PCR-masterblandingssammensetning og endre konsentrasjonene av primere og prober etter behov.
- Grundig virvel og kort sentrifuge før tilsetning av restriksjonsenzym. Tilsett restriksjonsenzymet og inverter for å blande.
MERK: I dette trinnet kreves 22 μL PCR-reaksjon for å oppnå et endelig volum på 40 μL PCR-reaksjon etter dråpedannelse (bestående av 15 μL PCR-masterblanding, 5,0 μL mal og 20 μL dråpegenereringsolje).
- Grundig virvel og kort sentrifuge før tilsetning av restriksjonsenzym. Tilsett restriksjonsenzymet og inverter for å blande.
- Tilsett 16,5 μL masterblanding til hver brønn i henhold til platekartet. Se figur 1 for et eksempel på platekart for valideringsnøyaktighet og presisjonskjøring.
- Forsikre deg om at en plate inneholder tre uavhengige preparater av kvalitetskontrollserien (QC), tre uavhengig testede endogene tårealikoter testet, pigget til et høyt og lavt nivå og unspiked, og tre uavhengige ingen malkontroller (NTC).
- Varier utformingen av disse brønnene over platen, der sett 1 lastes i rekkefølge etter synkende konsentrasjon, sett 2 lastes i rekkefølge etter økende konsentrasjon, og sett 3 lastes i tilfeldig rekkefølge for å vurdere om det er noen platestedsspesifikke effekter.
- Matriser prøvene for å fylle så mye av en kolonne som mulig, og fyll ubrukte brønner i en kolonne med kontrollbuffer. Inkluder flere endogene kontrollpartier (f.eks. flere dammer med tårer eller tårer samlet fra enkeltpersoner) i de gjenværende brønnene, om ønskelig.
- Forsegl platen med klar selvklebende film. Hold platen i romtemperatur under klargjøring av malen. Alternativt kan du holde platen i opptil 4 timer ved 2-8 °C, men bringe den tilbake til romtemperatur i minst 10 min før maltilsetting.
Tabell 2: Eksempel på PCR-masterblandingspreparat. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Figur 1: Eksempel på platekart for valideringsnøyaktighet og presisjonskjøring. Forkortelser: ULQC = øvre grense kvalitetskontroll; HQC = høy kvalitetskontroll; MQC = middels kvalitetskontroll; LQC = lav kvalitetskontroll; LLQC = nedre grense kvalitetskontroll; NTC = ingen malkontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5. Forberede QC-er
- Tine syntetiske DNA-fragmenter eller lineariserte plasmider ved romtemperatur og la det varmes opp i minst 10 minutter etter tining før bruk. Ta malene til romtemperatur for å sikre effektiv dråpedannelse.
- Oppbevares i romtemperatur inntil bruk. Vortex sentrifuge grundig og kort i en minisentrifuge før bruk.
- Forbered QC-fortynninger ved bruk av prøvefortynningsbufferen som fortynningsmiddel. Et eksempel på anbefalte konsentrasjoner for å forberede valideringsnøyaktighet og presisjonskjøring er presentert i tabell 3.
MERK: Etter vellykket gjennomføring av nøyaktighets- og presisjonskjøringer, må bare høy kvalitetskontroll (HQC), middels kvalitetskontroll (MQC) og lav kvalitetskontroll (LQC) kjøres på hver plate. For nøyaktighets- og presisjonskjøringer er minst tre uavhengige fortynninger av QC-ene inkludert for vurdering av nøyaktighet og presisjon i analysen. Etter nøyaktighets- og presisjonskjøringer trenger bare én fortynningsserie å inkluderes. - Etter tilberedning skal fortynningene oppbevares ved romtemperatur til de tilsettes platen.
- Oppbevar fortynningene på is eller ved 2-8 °C om nødvendig. Før etterfølgende bruk, la fortynningene varmes opp til romtemperatur i minst 10 minutter før bruk. Kast QC-ene på slutten av dagen.
Tabell 3: Eksempel på kvalitetskontroll (QC) ved bruk av syntetiske dobbeltstrengede DNA-fragmenter. Forkortelser: ULQC = øvre grense kvalitetskontroll; HQC = høy kvalitetskontroll; MQC = middels kvalitetskontroll; LQC = lav kvalitetskontroll; LLQC = nedre grense kvalitetskontroll; NTC = ingen malkontroll. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
6. Fremstilling av prøver
- Tine tåreprøver samlet fra en klinisk studie ved romtemperatur til de tines og la dem varmes i minst 10 minutter etter tining før bruk.
- Oppbevares i romtemperatur inntil bruk. Vortex sentrifuge grundig og kort i en mikrosentrifuge før bruk.
- Fortynn tåreprøver 1:10 (eller høyere) ved bruk av fortynningsbuffer som fortynningsmiddel i 0,2 ml PCR-rør eller 8-brønns PCR-strimler. Forsegl rørene.
MERK: Avhengig av forventet konsentrasjon av målet i tårer, kan det være nødvendig å fortynne prøvene ytterligere eller å teste flere fortynninger av hver prøve. - Varm prøvene i en termisk syklist ved 95 °C i 10 minutter, etterfulgt av å holde ved 4 °C i minst 5 minutter for å avkjøles. Bruk en rampefrekvens på 3 °C/s.
MERK: Prøvene kan holdes i termosyklisten ved 4 °C til de brukes samme dag eller de kan fryses ved -70 til -90 °C for lengre lagring. Dette trinnet tjener til å denaturere vektorkapsiden, frigjøre genomet. Siden QC syntetiske DNA-fragmenter eller lineariserte plasmider er dobbeltstrengede, bør de ikke gjennomgå dette oppvarmingstrinnet. - Sett prøvene etter avkjøling tilbake til romtemperatur (eller hvis de er frosne, tine ved romtemperatur) og la dem varme opp i minst 10 minutter.
MERK: Prøvene må bringes helt til romtemperatur for å sikre effektiv dråpedannelse.
7. Tillegg av mal
- Hent ddPCR-platen som inneholder masterblandingen. Vortex hver prøve eller QC fortynningsrør grundig og kort sentrifuge for å samle materialet.
- Fjern selvklebende film og tilsett 5,5 μL QC eller prøver til passende brønner på 96-brønnsplaten, i henhold til platekartet.
MERK: Se trinn 4.2.1 for forklaring av de nødvendige volumene - Tilsett 5,5 μL prøvefortynningsbuffer til NTC-brønnene.
- Dråpegenerering krever at alle brønner i en kolonne har en reaksjons- eller bufferkontroll. Hvis noen brønner i en kolonne ikke inneholder prøvereaksjoner, fortynn 2x ddPCR bufferkontroll 1: 2 ved bruk av nukleasefritt vann. Legg til 22 μL med 1x ddPCR-bufferkontroll til tomme brønner i en kolonne.
MERK: Hvis en hel kolonne ikke brukes, er det ikke nødvendig å legge til bufferkontroll i disse brønnene. - Legg en gjennomtrengelig folieforsegling på platen. Platen skal plasseres i plateforsegleren og forsegle den i 5 s ved 180 °C.
- Alternativt kan du forsegle platen i samsvar med ddPCR-systemprodusentens anbefalinger.
- Virv platen på maksimal hastighet i minst 30 s (bruk kontinuerlig vortexing-innstilling; ikke bruk berøringsvirvel) og sentrifuge kort i en platespinner.
MERK: Grundig og fullstendig blanding av platen på dette trinnet er avgjørende for riktig partisjonering av PCR-reaksjonen i dråper. Sørg for at det ikke er synlige bobler i brønnene. Om nødvendig kan platen holdes ved 2-8 °C før dråpegenerering i maksimalt 4 timer. Hvis den holdes, la platen komme til romtemperatur i minst 10 minutter før dråpegenerering.
8. Automatisert dråpegenerering, termisk sykling og dråpeavlesning
- Generer dråper i den automatiserte dråpegeneratoren som følger.
- På berøringsskjermen velger du kolonnene på platekartet som inneholder eksempler. Dekket på instrumentet vil lyse opp for å indikere hvilke forbruksvarer (DG32-kassetter, spisser, avfallsbeholder, dråpegenereringsolje) som kreves. Gule lys indikerer at det er nødvendig å legge til en forbruksvare, mens grønne lys indikerer tilstrekkelig forbruksvarer er tilgjengelige.
- Legg dråpegeneratoren fra bak til foran.
- For hydrolysesonder, sørg for at dråpegenereringsoljen for sonder er installert og tilstrekkelig olje for antall brønner gjenstår. Hvis alternative PCR-kjemikalier benyttes, må du sørge for at en kompatibel dråpegenereringsolje er installert.
- Plasser en kald blokk i dråpeplateholderen. Forsikre deg om at blokken er helt blåfarget og at ingen rosa er synlig. Plasser en ny 96-brønns ddPCR-plate i kaldblokken.
- Plasser den klargjorte PCR-platen i prøveplateholderen. Lukk lokket på maskinen. Trykk på start for dråpegenerering.
- Etter dråpedannelse overføres totalt 40 μL per reaksjon automatisk til den nye PCR-platen.
- Innen 30 minutter etter ferdigstillelse av dråpegenerering, fjern platen som inneholder dråpene fra kuldeblokken. Arbeid forsiktig da dråpene er mest skjøre på dette stadiet.
- Legg en gjennomtrengelig folieforsegling på platen. Platen skal plasseres i plateforsegleren og forsegle den i 5 s ved 180 °C.
- Alternativt kan du forsegle platen i samsvar med ddPCR-systemprodusentens anbefalinger.
- Plasser platen i en kompatibel termisk syklist. Angi sykkelforholdene (se tabell 4).
- Etter slutten av termisk syklus, hold platen i termisk syklisten, overført til 2-8 ° C, eller les den umiddelbart.
MERK: Å holde platen i 12 timer ved 4-12 °C kan forbedre dråpetellingen, men dette er ikke nødvendig. Tilstrekkelige dråper skal oppnås uten hold. - Legg platen i dråpeleseren, sørg for at nok leseroljerester og avfallsbeholderen har tilstrekkelig plass. Les dråpene. Utfør dråpeavlesning innen 24 timer etter oppstart av termisk sykling.
Tabell 4: Typiske termiske syklusforhold. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
9. Analyse av data
MERK: Minst 10 000 dråper per brønn er nødvendig for riktig beregning av konsentrasjon ved hjelp av Poisson-statistikk. Ikke forsøk å analysere brønner med færre enn 10 000 dråper.
- En terskel er nødvendig for å definere dråpene som positive eller negative. ddPCR-analyseprogramvaren bruker automatisk en terskel som kan variere mellom brønner. Sett imidlertid manuelt en terskel for alle brønner på platen litt over den fluorescerende intensiteten til NTC-brønnene for mer konsistente, nøyaktige og presise resultater.
MERK: Riktig plassering av terskelen kan kreve optimalisering avhengig av separasjonen av de positive og negative dråpene og hvor mye dråperegn som finnes (se figur 2). I dette eksemplet viser dråpeamplitudegrafen eksempelbrønner på hvert QC-nivå og NTC. Den lilla linjen indikerer en terskel på 1000, satt litt over den negative dråpepopulasjonen. - Poissons statistiske modellering krever minst tre positive dråper for å beregne konsentrasjonen med 95 % sikkerhet. Vurder alle brønner som inneholder null, en eller to positive dråper for å være negative og satt til en konsentrasjon på null27.
- Beregn kopinummeret i hver tåreprøve på nytt.
- Konsentrasjonen, i kopier/μL, er angitt i datarapporten. Bruk denne verdien til å bestemme konsentrasjonen i kopier/μL av den opprinnelige prøven (dvs. i tåreprøven).
- For å beregne ddPCR-reaksjonsfortynningen, del det opprinnelige PCR-reaksjonsvolumet før dråpedannelse med volumet av tilsatt mal. Når volumene som presenteres i denne metoden benyttes, gir dette en verdi på 4.
- Bestem seriefortynningsfaktoren fra originalprøven (trinn 6.2).
- For å bestemme kopiene/μL i prøven, multipliser kopiene/μL med ddPCR-reaksjonsfortynningen, deretter med seriefortynningsfaktoren. For eksempel var konsentrasjonen i kopier/μL generert i datarapporten 966; 5,5 μL mal ble tilsatt per 22 μL reaksjon. En 1:50 000 seriell fortynning av prøven ble benyttet.
- Hvis flere fortynninger av samme prøve ble testet, analyser alle gyldige fortynninger i området og beregne gjennomsnittet.
- For hver QC beregnes forventede kopier/μL PCR-reaksjon ved å dividere konsentrasjonen av den gitte QC-fortynningen (i kopier/μL) med ddPCR-reaksjonsvolumet (20 μL). Dette gjør det mulig å sammenligne denne nominelle verdien direkte med kopiene/μL-verdien gitt i datarapporten uten ytterligere beregninger.
MERK: Denne tilnærmingen ble også brukt til analyse av de piggete tåreprøvene som ble brukt i de representative resultatene. - Bestem middelverdi, standardavvik, variasjonskoeffisient (%CV) og prosentvis relativ feil i forhold til den nominelle konsentrasjonen (% RE) av prøven eller QC-verdien ved hjelp av replikasjonsbrønnene (inkluder flere fortynninger hvis aktuelt).
- For vurdering av interbrønnpresisjon, bestem dette for hver av brønnduplikatene, hvis inkludert.
- For vurdering av intraanalysenøyaktighet og presisjon, bestem dette for hver fortynningsserie eller alikot som brukes i et parti.
- For vurdering av nøyaktighet og presisjon mellom analyser, bestem dette ved hjelp av intraanalysemetodene for hver av de inkluderte batchene.
Figur 2: Eksempel på innstilling av terskel. Forkortelser: ULQC = øvre grense kvalitetskontroll; HQC = høy kvalitetskontroll; MQC = middels kvalitetskontroll; LQC = lav kvalitetskontroll; LLQC = nedre grense kvalitetskontroll; NTC = ingen malkontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
10. Analyser akseptkriterier
- Bruk følgende spesifikasjoner til de beregnede dataene for hver gruppe for å finne ut om partiet er akseptabelt. Hvis disse betingelsene ikke er oppfylt, må du ugyldiggjøre og gjenta batchen.
MERK: Disse kriteriene ble fastsatt som konsensus fra publiserte hvitbøker om PCR-basert analysevalidering 18,19,20,21,22,23,24,25. Det kan være nødvendig å endre målkriteriene etter behov for klinisk anvendelse. - Ingen malkontroll (NTC)
- Sørg for at hver NTC-brønn har minst 10 000 dråper.
- Sørg for at hver NTC-brønn har mindre enn 3 positive dråper.
- QC og analyseområde
- Sørg for at hver QC-brønn har minst 10.000 dråper.
- Sørg for at presisjonen av replikerende brønner med en QC-konsentrasjon er ≤25,0% CV, unntatt ved øvre og nedre kvantifiseringsgrense, hvor ≤30,0% er akseptabelt. Vurder dette uavhengig for hvert QC-sett og konsentrasjonsnivå.
- Sørg for at den relative feilen ved den tilbakeberegnede konsentrasjonen ved hvert gjennomsnittlige QC-nivå er innenfor ±25,0 % RE av den nominelle konsentrasjonen (kopier/PCR-reaksjon), unntatt ved øvre og nedre kvantifiseringsgrense, der ±30,0 % RE er akseptabelt. Vurder dette uavhengig for hvert QC-sett og konsentrasjonsnivå.
- Forsikre deg om at minst 2/3 av QC-prøvene (f.eks. fire av seks resultater) og 50% av QC-prøvene på hvert nivå (lav, middels, høy) oppfyller disse retningslinjene.
- Prøver
- Sørg for at prøvebrønnene som skal analyseres har minst 10 000 dråper.
- Forsikre deg om at presisjonen til replikerende brønner i en prøvefortynning som skal analyseres, er ≤25,0 % CV.
- Sørg for at minst én inkludert fortynning av den gitte prøven er innenfor det definerte kvantifiseringsområdet for analysen, som definert ovenfor basert på øvre og nedre grense-QC.
- Hvis alle inkluderte fortynninger gir større utbytteresultater enn den definerte øvre kvantifiseringsgrensen, og hvis det gjenstår et tilstrekkelig prøvevolum, gjenta analysen med en høyere fortynning av prøven.
- Hvis alle inkluderte fortynninger gir et resultat som er lavere enn den nedre kvantifiseringsgrensen, og hvis det gjenstår et tilstrekkelig prøvevolum, gjenta analysen med en lavere fortynning av prøven.
MERK: Prøver som inneholder mer enn tre positive dråper, men som har en konsentrasjon under den nedre kvantifiseringsgrensen, kan beskrives som detekterbare, men ikke kvantifiserbare.
Representative Results
For demonstrative formål ble det utviklet en analyse designet for å oppdage et kommersielt tilgjengelig, forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) -uttrykkende AAV2-vektor, med et syntetisk dobbeltstrenget DNA-fragment som inneholder eGFP som kvalitetskontroll. For tiden er det pågående debatt om vektoren selv eller et syntetisk DNA-fragment eller linearisert plasmid er mest hensiktsmessig for bruk som QC. Generelt kan et syntetisk DNA-fragment eller linearisert plasmid brukes hvis ekvivalens med vektoren er demonstrert i metodeutvikling (data ikke vist). Primere og sonder ble designet og optimalisert for å oppdage eGFP-transgenet. Se tilleggstabell S1 for sekvensene som er brukt i dette arbeidet. Konsentrasjonen av QC-fragmentbestanden ble empirisk bestemt ved bruk av ddPCR. Alle analyser ble utført ved bruk av konsentrasjoner og PCR-betingelser gitt som eksempler i protokollavsnittet.
For qPCR-analyser anbefales det å evaluere lineariteten, følsomheten, det dynamiske området, nøyaktigheten og presisjonen til standardkurven. Siden ddPCR ikke er avhengig av en standardkurve for målkvantifisering, må disse anbefalingene endres. I stedet ble QC-er bestående av syntetiske dobbeltstrengede DNA-fragmenter fortynnet til forskjellige konsentrasjoner for å spenne over det forventede kvantifiserbare området for en ddPCR-reaksjon basert på Poissons statistiske modellering, benyttet 29,30,31,32 for å definere det dynamiske området og følsomheten og for å evaluere nøyaktighet og presisjon. Valget av QC-konsentrasjoner var hovedsakelig basert på forventet forhold mellom positive og totale dråper i en brønn ved en gitt konsentrasjon. Matematisk er ddPCR teoretisk mest nøyaktig når omtrent 80% av partisjonene positivt forsterkes. Når forholdet mellom positiv og total dråpe øker over 0,8, reduseres nøyaktigheten på grunn av metning av partisjonene, og kvantifisering er ikke mulig når 100% av dråpene er positive. I den lave enden, teoretisk, kan så lite som en positiv dråpe oppdages og kvantifiseres, selv om nøyaktigheten er dårligere og analysen er gjenstand for falske positiver på lavt nivå. Vanligvis må minst tre dråper være positive for at et resultat skal beregnes med 95% sikkerhet, som er terskelen for å beregne en konsentrasjon vi brukte her.
En serie på fem forskjellige QC-konsentrasjoner ble utarbeidet, med målkopiantall/μL PCR-reaksjonsvolum beregnet forventet å gi positive til totale dråperatioer som spenner over det kvantifiserbare området for ddPCR, som vist i tabell 5. Disse ble brukt til å evaluere nøyaktigheten og presisjonen av analysen. I vurderingen her ble øvre og nedre kvantifiseringsgrenser ikke presset til det teoretiske maksimumet som er mulig i ddPCR. Nøyaktig kvantifisering kan være mulig på høyere og lavere nivåer enn demonstrert her. Området skal utvikles i samsvar med nedstrømsapplikasjonene til denne metoden.
Totalt tre uavhengig tilberedte fortynningsserier av disse QC-ene ble fremstilt i fortynningsbuffer for prøvetaking for hver batch for å evaluere nøyaktigheten og presisjonen i analysen. Dupliserte brønner av hver QC-fortynning ble inkludert. For å simulere en faktisk valideringsprotokoll ble totalt seks nøyaktighets- og presisjonspartier utført av flere analytikere over flere dager. Resultatene fra disse seks partiene ble analysert for å definere nøyaktigheten og presisjonen av metoden mellom analysene og analysens nøyaktighet og presisjon og for å definere analysens dynamiske område.
Intra-analyseytelsen ble vurdert for hver batch på hvert QC-nivå. Vi forventet at alle QC- og NTC-brønner ville ha minst 10 000 dråper. Dette ble oppfylt i 216 av 216 brønner som ble testet på tvers av alle seks batchene, med et gjennomsnittlig dråpetall på 19 748 dråper/brønn (tabell 6). Deretter ble inter-well %CV for hvert sett med dupliserte brønner for hver QC forventet å være ≤25,0%, bortsett fra øvre og nedre grense QC, hvor ≤30,0% var forventet. Dette ble oppfylt i sett med 90 av 90 brønner som ble testet på tvers av alle seks batchene for QC-ene, med en gjennomsnittlig interbrønn% CV på 3,9 % på tvers av alle QC-nivåene (tabell 7). Alle QCer ga gjennomsnittlig positiv til total dråperatio innenfor de forventede områdene skissert ovenfor (tabell 6).
Innenfor hver batch ble intraanalysegjennomsnittet og standardavviket beregnet for hvert av de uavhengig preparerte fortynningsseriepunktene, og disse ble brukt til å beregne et intraanalysegjennomsnitt for hver konsentrasjon i hver analyse. Dette ble brukt til å vurdere nøyaktigheten og presisjonen av analysen (tabell 8). Presisjon refererer til variabiliteten i dataene fra replikater av den samme homogene prøven under normale analyseforhold og evalueres ved å beregne %CV for de mange inkluderte alikotene. Vi forventet at de tre alikotene som ble testet i hver batch ville gi en intra-analyse% CV ≤25,0%, bortsett fra øvre og nedre grense QC hvor ≤30,0% var forventet. Dette ble oppfylt for alle fem QC-nivåene i hver av de 60 batchene (30 av 30 forestillinger totalt). Generelt kan større intra-analysepresisjon enn målkriteriene oppnås, med en gjennomsnittlig intra-analyse% CV på 7,7% på tvers av alle QC-nivåer. Nøyaktighet refererer til nærhet av avtale mellom eksperimentelt bestemt verdi og nominell verdi. Dette vurderes ved å beregne prosentvis relativ feil (%RE, eller %Bias) mellom de beregnede konsentrasjonene av hver QC og deres teoretisk forventede nominelle konsentrasjoner. Det var forventet at intraanalysegjennomsnittet for de tre alikotene ville være ±25,0 % RE av den nominelle konsentrasjonen, bortsett fra øvre og nedre grense QC hvor ±30,0 % var forventet. Dette ble oppfylt for alle fem QC-nivåene i hver av de 60 batchene (30 av 30 forestillinger totalt). Generelt kan større nøyaktighet intra-analyser enn målet vårt oppnås, med en gjennomsnittlig absolutt intra-analyse% RE på 4,2 % på tvers av alle QC-nivåer. I alle forestillinger av NTC (30 totalt) var ingen positive dråper detekterbare.
Interanalysenøyaktighet og presisjon ble også beregnet ved hjelp av intraanalysegjennomsnittet for hvert QC-nivå i hver batch. Interanalysepresisjonen var forventet å være ≤25,0 % CV, bortsett fra øvre og nedre grense QC hvor ≤30,0 % var forventet. På samme måte, for nøyaktighet mellom analyser, var det forventet ±25,0 % RE, bortsett fra øvre og nedre grense QC hvor ±30,0 % var forventet. En signifikant større nøyaktighet og presisjon mellom analyser enn disse målene ble observert (tabell 9), med en presisjon mellom analyser fra 4,0 % til 8,5 % og en absolutt nøyaktighet mellom analyser fra 1,0 % til 3,2 %. Samlet viser disse resultatene at denne metoden kan oppnå tilstrekkelig intra- og inter-assay nøyaktighet og presisjon godt innenfor dagens bransjemål. Et dynamisk område av denne analysen på 2,500-2,5 kopier per μL PCR-reaksjon kan defineres basert på disse resultatene, med en samlet analysefølsomhet på 2,5 kopier per μL PCR-reaksjon. Som tidligere nevnt kan det være mulig å validere bredere dynamiske områder.
Deretter var det nødvendig å evaluere analysenøyaktighet og presisjon i målmatrisen - i dette tilfellet tårer. Vanligvis valideres analyser før oppstart av kliniske studier, noe som betyr at tårer samlet inn fra vektorbehandlede pasienter sannsynligvis ikke er tilgjengelige for valideringsformål. Dette kan kunstig skapes ved å pigge mål-AAV-vektoren i tårer samlet inn fra frivillige givere for å lage matrise-pigget QC. Samlede menneskelige tårer ble samlet inn av en tredjepart (BioIVT). For prinsippbevis ble en eGFP-uttrykkende AAV2-vektor anskaffet fra en kommersiell kilde benyttet. Konsentrasjonen av AAV2-vektorstokken ble empirisk bestemt ved bruk av ddPCR, uten bruk av DNA-isolasjonstrinn, som beskrevet i denne protokollen. I hver runde ble AAV2 uavhengig av hverandre pigget inn i de tre tårealikotene ved et høyt (forventet 1,41 x 103 kopier/μL PCR-reaksjon) og lavt (28,2 kopier/μL PCR-reaksjon) nivå. Unspiked alikoter ble inkludert som en kontroll for å demonstrere metodens spesifisitet.
Intraanalyseytelsen ble vurdert for hver batch ved hvert piggnivå. Det var forventet at alle tåreprøver ville ha minst 10.000 dråper. Dette ble oppfylt i 108 av 108 brønner som ble testet på tvers av alle seks batchene, med et gjennomsnittlig totalt dråpeantall på 20 208 dråper/brønn (tabell 10). Deretter ble inter-well %CV for hvert sett med dupliserte brønner i hver QC forventet å være ≤25,0% for høye og lave piggnivåer. Dette ble oppfylt i 36 av 36 sett med brønner som ble testet på tvers av alle seks batchene for QC-ene, med en gjennomsnittlig interbrønn% CV på 3,2 % (tabell 11).
Innenfor hver batch ble intraanalysegjennomsnittet og standardavviket beregnet for hver av de uavhengig forberedte tårepiggene, og disse ble brukt til å beregne et intraanalysegjennomsnitt for hver konsentrasjon i hver analyse. Dette ble brukt til å vurdere nøyaktigheten og presisjonen av analysen i matrise (tabell 12). Vi forventet at intra-analyse% CV skulle være ≤25,0% og høye og lave piggnivåer. Dette ble oppfylt i seks av seks omganger for hvert nivå. Generelt kunne større intraanalysepresisjon i matrise enn målet oppnås, med en gjennomsnittlig intra-analyse% CV på 3,7 % på høyt nivå og 12,2 % på lavt nivå (samlet 8,0 %). Det var også forventet at intra-analyse% RE ville være ±25,0% ved begge piggnivåer. Dette ble oppfylt i seks av seks omganger for hvert nivå. Likeledes ble det generelt funnet at større intra-analysenøyaktighet i matrise enn målet kunne oppnås, med en gjennomsnittlig intra-analyse absolutt %RE på 8,1 % på lavt nivå og 11,3 % på høyt nivå (totalt 9,7 %). For den ikke-piggete kontrollen var det ikke noe eGFP-signal detekterbart i noen av alikotene (tabell 12), noe som demonstrerer metodens spesifisitet i den menneskelige tårematrisen.
Interanalysenøyaktighet og presisjon i tårematrise ble også beregnet ved hjelp av intraanalysegjennomsnittet for hvert piggnivå i hver batch. Det var forventet at interanalysepresisjonen ville være ≤25,0 % CV, og for nøyaktighet mellom analyser forventet vi ±25,0 % RE. En signifikant større nøyaktighet og presisjon mellom analysene enn disse målene ble observert (tabell 13), med en analysepresisjon på 5,5 % på høyt nivå og 7,1 % på lavt nivå, og med absolutt nøyaktighet mellom analyser på 11,3 % på høyt nivå og 8,1 % på lavt nivå. Samlet demonstrerer disse resultatene nøyaktigheten, presisjonen og spesifisiteten til metoden i tårematrise.
Tabell 5: Kvalitetskontroller som brukes til å definere analysens dynamiske område. Forkortelser: ULQC = øvre grense kvalitetskontroll; HQC = høy kvalitetskontroll; MQC = middels kvalitetskontroll; LQC = lav kvalitetskontroll; LLQC = nedre grense kvalitetskontroll; NTC = ingen malkontroll. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 6: Totalt antall dråper og positive til totale dråpeforhold for syntetisk dobbeltstrenget DNA-kvalitetskontroll og NTC. Forkortelser: ULQC = øvre grense kvalitetskontroll; HQC = høy kvalitetskontroll; MQC = middels kvalitetskontroll; LQC = lav kvalitetskontroll; LLQC = nedre grense kvalitetskontroll; NTC = ingen malkontroll. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 7: QC-statistikk mellom brønner (kopimål/μL PCR-reaksjon). Forkortelser: ULQC = øvre grense kvalitetskontroll; HQC = høy kvalitetskontroll; MQC = middels kvalitetskontroll; LQC = lav kvalitetskontroll; LLQC = nedre grense kvalitetskontroll; NTC = ingen malkontroll. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 8: Nøyaktighet og presisjon av QC intra-assay (kopimål/μL PCR-reaksjon). Forkortelser: ULQC = øvre grense kvalitetskontroll; HQC = høy kvalitetskontroll; MQC = middels kvalitetskontroll; LQC = lav kvalitetskontroll; LLQC = nedre grense kvalitetskontroll; NTC = ingen malkontroll. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 9: Nøyaktighet og presisjon av QC mellom analyser (kopimål/μL PCR-reaksjon). Forkortelser: ULQC = øvre grense kvalitetskontroll; HQC = høy kvalitetskontroll; MQC = middels kvalitetskontroll; LQC = lav kvalitetskontroll; LLQC = nedre grense kvalitetskontroll; NTC = ingen malkontroll. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 10: Totalt antall dråpesmittede i tåreprøver. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 11: Riveprøvestatistikk mellom brønner (kopimål/μL PCR-reaksjon). Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 12: Nøyaktighet og presisjon av tåreprøver intraanalyser (kopimål/μL PCR-reaksjon). Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 13: Interanalysenøyaktighet og presisjon av tåreprøver (kopimål/μL PCR-reaksjon). Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende tabell S1: Sekvenser av primer, prober og syntetisk dobbeltstrenget DNA-kvalitetskontroll benyttet i denne studien. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
Det er flere trinn i ddPCR-protokollen som er avgjørende for riktig ytelse av analysen. Det første kritiske trinnet er design og optimalisering av primere og sonde. Generelt anbefales bruk av hydrolysesondebasert kjemi over fargestoffbasert kjemi (f.eks. SYBR Green) i en preklinisk eller klinisk setting på grunn av deres overlegne spesifisitet. I tillegg er valget av forsterkningsmål kritisk. Vanligvis er transgenet av interesse for vektoren målrettet. I tidligere prekliniske stadier eller i vektorer der det kanskje ikke er mulig å skille vektortransgen versus genomisk DNA, kan det imidlertid være hensiktsmessig å bruke standardiserte vektormål. For eksempel kan man målrette mot den inverterte terminalrepetisjonsregionen, promotoren, poly-A-halen eller kryssene mellom segmentene mellom disse vektorkomponentene. Valg av mål vil variere basert på vektordesign. Tradisjonelle qPCR-primer- og sondedesignstrategier og programvare er vanligvis passende for ddPCR. Designparametere som forventes å gi en konsistent glødetemperatur (for eksempel 60 °C), bør velges for å redusere mengden optimalisering som kreves. Det har også blitt anbefalt å designe, bestille og evaluere minst tre forskjellige sett for hvert mål. Man bør deretter velge settet som viser størst spesifisitet (ingen amplifikasjon i den negative kontrollbrønnen eller i en matrise av relatert mål-DNA) og sensitivitet (dvs. deteksjonsgrense)20.
Hvis det er fordelaktig å kunne overføre analysen mellom qPCR og ddPCR, anbefales det å optimalisere analyseforholdene ved hjelp av qPCR først, og å identifisere forhold for det valgte settet som resulterer i amplifikasjonseffektivitet på 90%-110% med en R2 ≥ 0,98. Imidlertid er ddPCR som en endepunktsmetode vanligvis mindre følsom enn qPCR på grunn av varianser i amplifikasjonseffektivitet. Som et minimum anbefales det å kjøre en termisk temperaturgradient i glødnings- / forlengelsestrinnet for å dekke temperaturer over og under de forventede glødetemperaturene og å evaluere regn- og fluorescerende amplitudeseparasjon mellom de negative og positive dråpeklyngene som en funksjon av temperaturen. Hvis arbeidsområdet tillater det, anbefales det å ha individuelle dedikerte arbeidsstasjoner for klargjøring av masterblanding, tillegg av maler og forsterkning. Der det er mulig, bør disse fysisk atskilles av en ensrettet arbeidsflyt med innebygde tekniske kontroller, for eksempel kontrollert tilgang og differensielt lufttrykk, for å redusere risikoen for krysskontaminering og falske positiver. Hvis dette ikke er mulig, må det utvises ekstrem forsiktighet for å forhindre krysskontaminering.
Det er to trinn i denne protokollen som kan virke uvanlige for de som er mer vant til utvikling av qPCR-analyser. Den første er inkluderingen av et restriksjonsenzym i PCR-masterblandingen. Under ddPCR-forsterkning termosykles hver dråpe til endepunktet. I en riktig optimalisert analyse resulterer dette i to populasjoner av dråper, ett sett som viser et konsekvent høyt nivå av fluorescerende signaler - de positive - og et annet som konsekvent viser et lavt nivå av fluorescerende signal - negativene. Hvis PCR-interferens oppstår, kan det desynkronisere initiering av PCR-amplifikasjon, noe som resulterer i at dråpen ikke når et forsterkningsplatå, og dermed inkonsistente fluorescerende endepunkter. I dette tilfellet vil dråpene fordeles mellom de negative og positive, noe som resulterer i et fenomen som kalles ddPCR-regn. Dette kan føre til unøyaktig kvantifisering av målet og inkonsekvente og subjektivt anvendte terskler. Vår anbefaling om å sette terskelen litt over signalet fra NTC, noe som bør minimere effekten av regn i den endelige kvantifiseringen, da alle dråper fortsatt anses som positive, selv om de ikke er fullt syklet til endepunktet. AAV-er har en svært kompleks sekundærstruktur som, avhengig av amplifikasjonsmålet, kan redusere tilgjengeligheten til primere og sonder, noe som resulterer i PCR-interferens og dermed regn. Inkluderingen av restriksjonsenzymet i masterblandingen spalter denne sekundære strukturen for å øke tilgangen til primere og sonder, redusere regnet, noe som dermed kan forbedre nøyaktigheten av analysen. Effektene av inkludering av et restriksjonsenzym i ddPCR-reaksjonen er beskrevet tidligere25,32. Ethvert restriksjonsenzym kan brukes, så lenge det er bekreftet å ikke kutte innenfor målamplifikasjonsområdet. Ingen forfordøyelsestrinn eller alternative buffersammensetninger er nødvendig.
Det andre uvanlige trinnet er fremstilling av tåreprøven som inneholder AAV. I denne protokollen ble et 1:10 (eller høyere) forhold mellom tårer benyttet og deretter ble prøven oppvarmet. Vanligvis, når tårer samles via et kapillærrør, som er en mye brukt oppsamlingsmetode, kan i gjennomsnitt ca. 10,0 μL samles33. Fortynningen bidrar til å håndtere det begrensede prøvevolumet og gir nok materiale til duplikatbrønntesting. Selv om dette reduserer den teoretiske deteksjonsgrensen, bør den robuste følsomheten til ddPCR fortsatt resultere i deteksjon av alle, men et ekstremt få antall vektorpartikler. Denne tilnærmingen skaper i tillegg en "backup" godt hvis man skulle uventet mislykkes. I dette tilfellet, eller i tilfeller med utilstrekkelig prøvevolum til å drive to brønner, kan Poisson-feilen brukes til å vurdere presisjonen. Videre, i tilfeller der konsentrasjonen er under deteksjonsgrensen, skaper det en mulighet til å slå sammen brønndata for å bestemme en konsentrasjon. Det er nødvendig å frigjøre AAV-vektorene fra viruskapsidene for ddPCR-deteksjon. Noen metoder for kvantifisering av AAV har inkludert et proteinase K-fordøyelsestrinn for å fjerne viruskapsid34,35,36. Alle naturlig forekommende AAV-serotyper har smeltetemperaturer på eller under ca. 90 °C, og de fleste faller under 80 °C. Derfor synes dette å være en unødvendig inkludering37. Oppvarming alene ser ut til å være tilstrekkelig til å frigjøre vektor-DNA.
Videre er ddPCR generelt mindre utsatt for PCR-hemmere som kan være tilstede i en prøve som kan påvirke en qPCR-analyse. Hvis et spesifikt DNA-isolasjonstrinn er inkludert, vil dette også kreve spesifikk validering, noe som unngås i denne protokollen. Prøvene fortynnes før oppvarming på grunn av kinetikken til diffusjon av vektorgenomene i en væske. Under oppvarming og påfølgende avkjølingsprosess kan de positive og negative sansestrengene i det enkeltstrengede DNA-genomet gløde sammen for å produsere et dobbeltstrenget mellomprodukt hvis konsentrasjonene er tilstrekkelig høye. Fortynning før oppvarming reduserer konsentrasjonene og gjør det matematisk usannsynlig at det dannes nok dobbeltstrengede mellomprodukter til å ha en negativ effekt på kvantifiseringens nøyaktighet. Det skal bemerkes at de syntetiske DNA-fragmentene eller lineariserte plasmider som brukes som kvalitetskontroller, ikke må gjennomgå dette oppvarmingstrinnet. Siden disse er dobbeltstrengede, vil oppvarming resultere i konvertering til enkeltstrengede mellomprodukter. Etter uavhengig partisjonering av disse enkeltstrengede QCene i dråper, forventes dette å resultere i en dobling i QC-konsentrasjonen i forhold til den nominelle konsentrasjonen. Alternativt, hvis QC skal varmes opp for å standardisere metoden, må dette tas med i rekonstitueringen og tildelingen av en nominell konsentrasjon.
Til slutt, med hensyn til prøvepreparering, anbefaler mange protokoller også inkludering av et DNase-behandlingstrinn for å fjerne uinnkapslet vektor-DNA. Dette trinnet er kritisk i tilfeller der det ikke er ønskelig å kvantifisere fritt DNA assosiert med vektorpreparatet (for eksempel under kvantifisering for doseringsformål). Men i sammenheng med biodistribusjon og bioshedding studier, ønsker man vanligvis å vite hvor noen vektor DNA har reist, uavhengig av om det er innkapslet eller ikke. Derfor anbefales det å vanligvis ikke utføre et DNase-behandlingstrinn under slike studier. Hvis det fastslås at det er nødvendig å inkludere et DNase-trinn, bør dette trinnet være før fortynning og oppvarming.
I denne artikkelen presenteres data som er representative for tilnærmingen til vurdering av metodens dynamiske område, følsomhet, nøyaktighet og presisjon innenfor rammen av en hensiktsmessig, god laboratoriepraksis-kompatibel validering. Den nåværende mangelen på veiledning om dette emnet etterlater validerende laboratorier for å bestemme målanalysekriterier for seg selv, i tråd med dagens bransjetenkning. Ulike grupper har stilt både høyere og lavere målkriterier enn brukt i denne studien: 19,20,21,22,23,24,25. Målanalysekriteriene, inntil de er strengere definert, bør velges før validering basert på de tiltenkte kliniske anvendelsene av metoden. Avhengig av nedstrømsbeslutningene som skal tas på grunnlag av dataene, kan det være behov for høyere nivåer av nøyaktighet og presisjon. Omvendt kan et enkelt positivt versus negativt resultat være tilstrekkelig.
Tilnærmingen omhandlet også anbefalinger for vurdering av spesifisitet og matriseeffekt. En pool av tårer samlet fra ubehandlede individer klarte ikke å gi et positivt resultat i denne analysen, mens målet kunne oppdages når vektoren ble pigget inn i tårene ved høy og lav konsentrasjon innenfor anbefalte utvinningsrater. Ideelt sett ville matriks som inneholder endogen vektor (f.eks. samlet inn etter behandling med viral vektor) også bli inkludert i disse vurderingene. Det er imidlertid lite sannsynlig at slike prøver vil være tilgjengelige for bruk i en validering. For å øke robustheten til valideringen, kan flere tårebassenger, eller tårer samlet fra en rekke individer, vurderes for å avgjøre om en pasientspesifikk matriseeffekt oppstår. Til slutt anbefales det å evaluere stabiliteten. I arbeidsflyter der DNA-ekstraksjon skjer ut av den biologiske matrisen, kan det være nødvendig å evaluere stabiliteten til både prøven og det ekstraherte DNA. I denne arbeidsflyten testes prøven direkte i analysen uten behov for DNA-ekstraksjon. Derfor, i betraktning av evalueringen av stabiliteten for denne metoden, må man vurdere stabiliteten til tårprøvene. Vanligvis anbefales benkeplate, kjøleskap, frysing/tining og langsiktige stabilitetsvurderinger. Disse ble ikke utført som en del av denne studien, men metodene som er utviklet her kan brukes i denne vurderingen, etter manipulasjoner til inngangsprøvene.
Samlet sett har denne metoden vist seg å være en robust, repeterbar og validerbar analyse for å oppdage AAV-baserte vektorer i tåreprøver. Det kan tjene som en plattform som skal tilpasses spesifikke vektorer for å støtte kliniske studier og gir grunnlag for validering av en analyse i samsvar med god laboratoriepraksis.
Disclosures
Alle forfattere er ansatte i KCAS Bioanalytical and Biomarker Services, en oppdragsforskningsorganisasjon som tilbyr omfattende Good Laboratory Practices/Good Clinical Practices-kompatible utviklingstjenester fra tidlig oppdagelsesstøtte til produktregistrering, inkludert støtte for AAV-baserte analyser, som beskrevet i denne protokollen. KCAS finansierte dette prosjektet og publiseringen av denne protokollen. Selv om det ikke finnes noen nåværende FDA-retningslinjer for utforming og validering av eksperimentene som presenteres i dette papiret, har eksperter og tankeledere som utvikler slike studier ved KCAS, vedtatt denne tilnærmingen som grunnlinjetilnærming. Ytterligere kriterier og parametere diskuteres fra prosjekt til prosjekt og kan inkluderes basert på den tiltenkte bruken.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Nick Russell og Brandon McKethan fra Bio-Rad for deres nyttige diskusjoner under utviklingen av denne metoden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV-eGFP Vector | Charles River Laboratories | RS-AAV2-FL | Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector |
| AutoDG Droplet Digital PCR system | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
| AutoDG Oil for Probes | Bio-Rad | 1864110 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad | 1863052 | Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 1863004 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Piercable Foil Seals | Bio-Rad | 1814040 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted | Bio-Rad | 12001925 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863023, 1863024, or 1863025 | Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system. |
| DG32 AutoDG Cartidges | Bio-Rad | 1864108 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Droplet Reader | Bio-Rad | QX200 | Alternative ddPCR system may be used following manufacturer’s protocol. |
| GeneAmp PCR Buffer | Applied Biosystems | N8080129 | N/A |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9906 | N/A |
| PCR Plate Sealer | Bio-Rad | PX1 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Pipet Tips for AutoDG | Bio-Rad | 1864120 | Or use material compatible with ddPCR system. |
| Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant | Gibco | 24040 | N/A |
| Primer and Hydrolysis Probes | Various | Various | Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system. |
| Restriction Enzyme | Various | Various | Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence |
| Sheared salmon sperm DNA | ThermoFisher | AM9680 | N/A |
| Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid | Various | Various | Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control |
| TE Buffer | Teknova | T0224 | Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0 |
| Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | C1000 | Or use material compatible with ddPCR system. |
References
- Sherkow, J. S., Zettler, P. J., Greeley, H. T.
- Ginn, S. L., Amaya, A. K., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: an update. The Journal of Gene Medicine. 20 (5), 3015 (2018).
- Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral vector systems for gene therapy: a comprehensive literature review of progress and biosafety challenges. Applied Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
- Gene, Cell, & RNA therapy landscape, Q4 2022 quarterly data report. American Society for Gene & Cell Therapy. , Available from: https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx (2022).
- Approved Cellular and Gene Therapy Products. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products (2022).
- Au, H. K. E., Isalan, M., Meilcarek, M. Gene therapy advances: a meta-analysis of AAV usage in clinical settings. Frontiers in Medicine. 8, 809118 (2022).
- Lundstrom, K.
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31, 317-334 (2017).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomized, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drugs (INDs). United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug (2020).
- Long term follow-up after administration of human gene therapy products. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products (2020).
- Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during (2020).
- Recommendations for microbial vectors used in gene therapy. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy (2016).
- Multidisciplinary: gene therapy. European Medicines Agency. , Available from: https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy (2023).
- Human gene therapy for retinal disorders. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders (2020).
- Design and analysis of shedding studies for virus or bacterial-based gene therapy and oncolytic products. United States Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products (2015).
- Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products. European Medicines Agency. , Available from: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf (2018).
- Kaur, S. white paper on recent issues in bioanalysis: mass spec of proteins, extracellular vesicles, CRISPR, chiral assays, oligos; nanomedicines bioanalysis; ICH M10 section 7.1; non-liquid & rare matrices; regulatory inputs (part 1A - recommendations on endogenous compounds, small molecules, complex methods, regulated mass spec of large molecules, small molecule, PoC & part 1B - regulatory agencies' inputs on bioanalysis, biomarkers, immunogenicity, gene & cell therapy and vaccine). Bioanalysis. 14 (9), 505-580 (2022).
- Hays, A., Islam, R., Matys, K., Williams, D. Best practices in qPCR and qPCR validation in regulated bio analytical laboratories. The AAPS Journal. 24 (2), 36 (2022).
- Ma, H., Bell, K. N., Loker, R. N. qPCR and qRT-PCR analysis: Regulatory points to consider when conducting biodistribution and vector shedding studies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 17 (20), 152-168 (2020).
- Wissel, M. Recommendations on qPCR/ddPCR assay validation by GCC. Bioanalysis. 14 (12), 853-863 (2022).
- Expectations for biodistribution (BD) assessments for gene therapy (GT) products. International Pharmaceutical Regulators Programme. , Available from: https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf (2018).
- Pinheiro, L., Emslie, K. R. Basic concepts and validation of digital PCR measurements. Methods in Molecular Biology. 1768, 11-24 (2018).
- Tzonev, S. Fundamentals of counting statistics in digital PCR: I measured two target copies-what does it mean. Methods in Molecular Biology. 1768, 25-43 (2018).
- Prantner, A., Marr, D. Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR. PLoS One. 18, 0280242 (2023).
- Primer-BLAST. National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information. , Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/ (2023).
- Koressaar, T., Remm, M. Enhancements and modifications of primer design program Primer 3. Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).
- Ye, J. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Droplet Digital PCR Application Guide. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf (2023).
- Qian, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
- Basu, A. Digital assays part I: portioning statistics and digital PCR. SLAS Technology. 22 (4), 369-386 (2017).
- Sanmiguel, J., Gao, G., Vandeberghe, L. H. Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration. Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).
- Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing. Scientific Reports. 11, 10064 (2021).
- Martinez-Fernandez de la Camara, C., McClements, M. E., MacLaren, R. E. Accurate quantification of AAV vector genomes by quantitative PCR. Genes. 12 (4), 601 (2021).
- Ai, J., Ibraheim, R., Tai, P. W. L., Gao, G. A scalable and accurate method for quantifying vector genomes of recombinant adeno-associated viruses in crude lysate. Human Gene TherapyMethods. 28 (3), 139-147 (2017).
- Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).
- Bennett, A., et al. Thermal stability as a determinant of AAV serotype identity. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 6, 171-182 (2017).
