Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Стабилизированное окно для прижизненной визуализации поджелудочной железы мышей

Published: October 6, 2023 doi: 10.3791/65498
Automatic Translation
*1,2,3, *4,5, 1,4, 6,7, 2,3,4,7,8,9, 1,3,4,7,8,9,10, 2,3,7, 1,2,3,7,8, 2,3,4,7,8,9
1Department of Surgery, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 2Department of Pathology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 3Integrated Imaging Program for Cancer Research, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 5Breast Center, Peking University People's Hospital, 6Department of Microbiology & Immunology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 7Montefiore Einstein Cancer Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 8Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 9Gruss-Lipper Biophotonics Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 10Department of Cell Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Представлен протокол хирургической имплантации стабилизированного постоянного оптического окна для субклеточной визуализации поджелудочной железы мышей, позволяющий проводить серийные и лонгитюдные исследования здоровой и больной поджелудочной железы.

Abstract

Физиология и патофизиология поджелудочной железы сложны. Заболевания поджелудочной железы, такие как панкреатит и аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC), характеризуются высокой заболеваемостью и смертностью. Прижизненная визуализация (ВВИ) — это мощный метод, позволяющий получать изображения тканей с высоким разрешением как в здоровом, так и в больном состоянии, что позволяет наблюдать за динамикой клеток в режиме реального времени. ИВИ поджелудочной железы мышей представляет собой серьезную проблему из-за глубокой висцеральной и податливой природы органа, что делает его очень подверженным повреждениям и артефактам движения.

Здесь описан процесс имплантации S-табилизированного W-индудля визуализациимышиного P-ancreas(SWIP). SWIP позволяет проводить внутривенное введение поджелудочной железы мышей в нормальном здоровом состоянии, во время трансформации здоровой поджелудочной железы в острый панкреатит, индуцированный церулеином, и при злокачественных состояниях, таких как опухоли поджелудочной железы. В сочетании с генетически мечеными клетками или введением флуоресцентных красителей, SWIP позволяет измерять динамику одиночных клеток и субклеток (включая одноклеточную и коллективную миграцию), а также получать последовательные изображения одной и той же области интереса в течение нескольких дней.

Способность улавливать миграцию опухолевых клеток имеет особое значение, поскольку основной причиной смертности, связанной с раком, при PDAC является подавляющее метастатическое бремя. Понимание физиологической динамики метастазирования при ОАК является критической неудовлетворенной потребностью и имеет решающее значение для улучшения прогноза пациента. В целом, SWIP обеспечивает улучшенную стабильность визуализации и расширяет область применения IVI при здоровых заболеваниях поджелудочной железы и злокачественных заболеваниях поджелудочной железы.

Introduction

Доброкачественные и злокачественные заболевания поджелудочной железы потенциально опасны для жизни, при этом существуют значительные пробелы в понимании их патофизиологии. Панкреатит – воспаление поджелудочной железы – является третьей по значимости причиной госпитализаций и повторных госпитализаций в связи с желудочно-кишечными заболеваниями в США и связан со значительной заболеваемостью, смертностью и социально-экономическим бременем. Протоковая аденокарцинома поджелудочной железы (PDAC), занимающая третье место среди основныхпричин смертности, связанной с раком, является причиной большинства злокачественных новообразований поджелудочной железы3 и предвещает низкую 5-летнюю выживаемость — всего 11%2. Основной причиной смертности, связанной с раком, при PDAC является чрезмерная метастатическая нагрузка. К сожалению, у большинства пациентов наблюдается метастатическое заболевание. Таким образом, понимание динамики метастазирования при PDAC является критической неудовлетворенной потребностью в области исследования рака.

Механизмы, лежащие в основе воспаления и метастатического каскада поджелудочной железы, плохо изучены. Основной причиной этого пробела в знаниях является невозможность наблюдать клеточную динамику поджелудочной железы in vivo. Непосредственное наблюдение за этой клеточной динамикой обещает выявить важнейшие мишени для использования и улучшения диагностики и лечения пациентов с заболеваниями поджелудочной железы.

Прижизненная визуализация (ВВИ) — это метод микроскопии, который позволяет исследователям визуализировать и изучать биологические процессы у живых животных в режиме реального времени. IVI позволяет с высоким разрешением напрямую визуализировать динамику внутриклеточной и микроокружающей среды in vivo и в естественной среде рассматриваемого биологического процесса. Таким образом, IVI позволяет in vivo наблюдать за здоровыми и патологическими процессами.

Современные методы визуализации всего тела, такие как МРТ, ПЭТ и КТ, обеспечивают превосходное изображение целых органов и могут выявлять патологии еще до появления клинических симптомов4. Однако они не способны достичь одноклеточного разрешения или выявить самые ранние стадии заболевания – панкреатита или злокачественных новообразований.

В предыдущих исследованиях для наблюдения за доброкачественными и злокачественными заболеваниями кожи5,6, молочной железы7, легких8, печени9, головного мозга10 и поджелудочной железы 11 использовалось одноклеточное разрешение, что привело к пониманию механизмов прогрессирования заболевания12. Тем не менее, поджелудочная железа мышей создает значительные препятствия для достижения разрешения одной клетки с помощью IVI, в первую очередь из-за ее глубокого висцерального расположения и высокой податливости. Кроме того, это разветвленный, диффузно распределенный орган в брыжейке, который соединяется с селезенкой, тонкой кишкой и желудком, что затрудняет доступ к нему. Ткань также очень чувствительна к движению, вызванному прилегающей перистальтикой и дыханием. Минимизация движения поджелудочной железы имеет важное значение для микроскопии с одноклеточным разрешением, поскольку артефакты движения даже в несколько микрон могут размывать и искажать изображения, что делает невозможным отслеживание динамики отдельных клеток13.

Для проведения ВВИ хирургическим путем должно быть имплантировано окно визуализации брюшной полости (AIW) 9,11. Для хирургической имплантации AIW в брюшную стенку вшивается металлическая оконная рама. После этого интересующий орган крепится к каркасу с помощью цианоакрилатного клея. Хотя этого достаточно для некоторых жестких внутренних органов (например, печени, селезенки, ригидных опухолей), попытки визуализации здоровой поджелудочной железы мышей нарушаются из-за неоптимальной латеральной и осевой стабильности из-за податливой текстуры ткани и сложной архитектуры14. Чтобы устранить это ограничение, Park et al.14 разработали окно визуализации, специально предназначенное для здоровой поджелудочной железы. Это окно визуализации поджелудочной железы (PIW) сводит к минимуму влияние кишечника и дыхания за счет горизонтальной металлической полки в оконной раме, прямо под покровным стеклом, стабилизируя ткань и поддерживая ее контакт с покровным стеклом. Несмотря на то, что PIW обеспечивает повышенную латеральную стабильность, мы обнаружили, что это окно по-прежнему демонстрирует осевой дрейф и дополнительно препятствует визуализации крупных солидных опухолей из-за узкого зазора между металлической полкой и покровным стеклом15.

Чтобы устранить эти ограничения, мы разработали S-табилизированный W-индудля визуализации мышиного P-ancreas(SWIP), имплантируемое окно визуализации, способное обеспечить стабильную долгосрочную визуализацию как здоровой, так и больной поджелудочной железы (рис. 1)15. Здесь мы предоставляем исчерпывающий протокол хирургической процедуры, используемой для имплантации SWIP. Хотя основной целью было изучение динамических механизмов, участвующих в метастазировании, этот метод также может быть использован для изучения различных аспектов биологии и патологии поджелудочной железы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры, описанные в этом протоколе, были выполнены в соответствии с руководящими принципами и правилами использования позвоночных животных, включая предварительное одобрение Институционального комитета по уходу за животными и использованию животных Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна (IACUC).

1. Пассивация окон

ПРИМЕЧАНИЕ: Пассивация нержавеющей стали очищает металл от загрязнений и создает тонкий оксидный слой, который значительно повышает биосовместимость металла с мягкими тканями, даже по сравнению с титаном16.

  1. Начните процесс пассивации, промыв оптические оконные рамы 1% (w/v) раствором ферментативно-активного моющего средства.
  2. Погрузите рамы в 5%-ный раствор гидроксида натрия при температуре 70 °C на 30 минут в стеклянную банку.
  3. Выньте рамки и промойте их деионизированной водой.
  4. Погрузите рамы в 7%-ный раствор лимонной кислоты при температуре 55 °C на 10 минут в новую стеклянную банку.
  5. Снимите рамки и снова промойте их деионизированной водой.
  6. Повторите шаг 1.2 и, наконец, промойте оконные рамы деионизированной водой в последний раз.

2. Подготовка к имплантации опухоли или операции на окне

ПРИМЕЧАНИЕ: Для исследования опухолей поджелудочной железы опухолевые клетки должны быть имплантированы и позволить им вырасти в явные опухоли. Для визуализации опухолевых клеток in vivo рекомендуется использовать клетки, которые были генетически изменены для экспрессии флуоресцентных белков, таких как Dendra2. Использование флуоресцентных белковых меток, которые являются яркими, смягчит потенциальные проблемы с автофлуоресценцией тканей. Другие потенциальные флуоресцентные белки, красители и генетически кодируемые флуоресцентные модели мышей, которые могут быть использованы, обсуждались в других статьях17,18. Чтобы предотвратить загрязнение операционного поля, выполняйте хирургическую процедуру в вытяжке или ламинарном кабинете и убедитесь, что отдельные области используются для подготовки, операции и восстановления.

  1. Перед операцией простерилизуйте все хирургические инструменты в автоклаве и, при необходимости, используйте стерилизатор горячими шариками для последующих процедур. Убедитесь, что операция проводится только с помощью наконечников.
  2. Включите хирургическую прокладку с подогревом и стерилизатор шариков и подождите, пока они не достигнут соответствующей рабочей температуры. Температуру грелки следует контролировать с помощью поверхностного термометра, чтобы избежать возможных ожогов. Положите стерильную ткань на грелку, если температуру невозможно должным образом контролировать.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Температура тела во время коротких процедур (≤20 мин), таких как имплантация опухоли и окна, минимально снижается при использовании хирургической подушки с подогревом. Однако более длительные периоды анестезии, например, во время длительной таймлапс-визуализации, требуют, чтобы мышь была помещена в обогреваемую камеру для поддержания температуры тела.
  3. Обезболивайте мышь 5% изофлураном в наркозной камере.
  4. Критический шаг: Снизьте уровень анестезии до 2%, как только мышь потеряет сознание. Внимательно следите за уровнем анестезии и жизненно важными показателями мыши (например, с помощью пульсоксиметра)19.
  5. Нанесите маленькую каплю смазки для глаз на каждый глаз мыши, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
  6. Перед операцией обильно нанесите крем для депиляции на левую верхнюю часть живота, чтобы удалить волосы. Через 20 секунд используйте смоченную папиросную бумагу, чтобы плотно вытереть волосы и крем для депиляции. Повторяйте процесс по мере необходимости до тех пор, пока все волосы не будут удалены из области операции.
  7. Ввести 10 мкл бупренорфина (0,1 мг/кг), разведенного в 90 мкл PBS, подкожно, для обеспечения предоперационной анальгезии.

3. Имплантация опухоли поджелудочной железы

  1. Готовят аликвоты опухолевых клеток в нужной концентрации (исходя из времени удвоения опухолевых клеток). Поместите клеточную суспензию в инсулиновый шприц и держите на льду. Для следования этому протоколу используют 106 сингенных опухолевых клеток KPC 20, взвешенных в максимуме 50 мкл PBS, в соответствии с протоколом ортотопической инъекции, адаптированным из Erstad etal.21
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта клеточная линия, введенная в такой концентрации, обычно вызывала пальпируемые или соответственно большие опухоли к 10-14 дням. Субклоны этой клеточной линии и других клеточных линий поджелудочной железы должны быть оценены на наличие соответствующих концентраций и сроков для получения опухолей соответствующего размера.
  2. Вымойте руки с использованием антисептического мыла.
  3. Перед каждой новой операцией надевайте новые стерильные перчатки.
  4. Перенесите мышь в стерильный хирургический капюшон и поместите ее в положение частичного правого бока пролежни.
  5. Закрепите конечности бумажной лентой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное использование инструментов важно на протяжении всей процедуры. Примеры того, как держать щипцы, ножницы Кастровьехо и вакуумный захват, показаны на рисунке 2A-C.
  6. Простерилизуйте брюшную полость антисептиком (рисунок 2D).
  7. Убедитесь, что животное полностью обезболино, выполнив тест на защемление пальца ноги.
  8. Сделайте левый подреберный разрез на коже диаметром 10-15 мм с помощью щипцов и ножниц Кастровьехо (рис. 2E).
  9. Контролируйте гемостаз с помощью ватных палочек или шприц-ручки для прижигания, когда это необходимо.
  10. Осторожно разделите нижележащую мышцу щипцами и ножницами Кастровьехо, чтобы войти в брюшину (Рисунок 2F).
  11. С помощью стерильных ватных тампонов атравматично экстернализовать поджелудочную железу и селезенку.
  12. Растопырите поджелудочную железу так, чтобы не было складок (рис. 2G).
  13. Определите желаемое место инъекции опухоли в теле или хвосте поджелудочной железы (вдали от кровеносных сосудов).
  14. Критический шаг: После тщательного позиционирования поджелудочной железы используйте щипцы, чтобы обеспечить натяжение ткани, и введите наконечник инсулинового шприца скосом вверх в нужный участок поджелудочной железы на глубину 4-5 мм (Рисунок 2H).
  15. Медленно вводят раствор опухолевых клеток. Найдите небольшой пузырь, подтверждающий успешную инъекцию (рисунок 2I).
  16. Осторожно верните поджелудочную железу в брюшную полость, не нарушая пузырь для инъекции опухолевых клеток (рис. 2J).
  17. Используя рассасывающиеся полидиоксаноновые нити 5-0, сначала закройте мышечный слой, а затем кожу прерывистыми швами (рис. 2K-N).
  18. Покройте разрез цианоакрилатным клеем (рис. 2O), затем верните мышь в чистую клетку под нагревательной лампой для восстановления. Добавляйте антибиотики в питьевую воду, чтобы предотвратить инфекцию. Наблюдайте за мышами и дайте им полностью восстановиться после операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Антибиотики назначаются в соответствии с требованиями протокола IACUC. Все животные размещаются индивидуально.
  19. Дайте опухоли развиваться в течение 10-14 дней, пока она не пропальпируется через брюшную стенку.

4. Операция на окне поджелудочной железы

  1. Когда животные будут готовы к визуализации, начните операцию по имплантации окна. Для начала вымойте руки с антисептическим мылом.
  2. Перед каждой новой операцией надевайте свежие стерильные перчатки.
  3. На хирургической подставке с подогревом поместите мышь в положение правого бокового пролежня, чтобы обнажить левый живот.
  4. Прикрепите передние и задние конечности мыши к нагретому операционному этапу краниально и каудально с помощью бумажной ленты. Убедитесь, что селезенка (под кожей) видна в пределах операционного поля (Рисунок 3A).
  5. Для сохранения стерильности распакуйте все хирургические инструменты в капюшоне.
  6. Продезинфицируйте место операции, промыв кожу мыши обильным антисептиком.
  7. Убедитесь, что животное полностью обезболино, выполнив тест на защемление пальца ноги.
  8. Критический шаг: Приподнимите кожу левого верхнего квадранта живота щипцами и сделайте круговой разрез на коже и мускулатуре диаметром ~10 мм с помощью ножниц Кастровьехо (рис. 3B, C).
  9. Остановите кровотечение и поддерживайте гемостаз с помощью ватных палочек или шприца, если это необходимо.
  10. Локализовать поджелудочную железу, которая прикреплена к селезенке, и определить направление, в котором поджелудочная железа лежит внутри разреза, чтобы решить, где следует разместить поддерживающую вышивку крестом.
  11. Используя шелковый шов 5-0, поместите первый стежок в нужном месте в мышечном слое. Завяжите этот конец 3-5 узлами. (Рисунок 3D,E)
  12. Продолжайте накладывать швы непосредственно поперек разреза. Отрежьте и оставьте хвостик ~5 см (Рисунок 3F).
  13. Повторите шаги 4.11 и 4.12 перпендикулярно первому стежку (рис. 3G,H).
  14. Критический шаг: Осторожно приподнимите и расположите поджелудочную железу над вышивкой крестиком (рис. 3I, J). Следите за тем, чтобы не повредить поджелудочную железу во время манипуляции.
  15. Критический этап: Используя шелковый шов 5-0, выполните кисетный стежок на расстоянии ~1 мм от отверстия по окружности, переплетая слой кожи и мышц (Рисунок 3K).
  16. Расположите оконную раму так, чтобы края круглого разреза находились в пазе окна (Рисунок 3L).
  17. Закрепите имплантированное окно, плотно завязав шелк 5-0.
  18. В шприц объемом 1 мл налить 100 мкл жидкого цианоакрилатного клея.
  19. Высушите ткань, применяя деликатный поток сжатого воздуха в течение ~10 с.
  20. Обхватите оконную раму за внешний край щипцами и осторожно приподнимите, чтобы обеспечить отделение поджелудочной железы от нижней поверхности оконной рамы.
  21. Критический шаг: Нанесите тонкий слой жидкого цианоакрилатного клея вдоль ниши окна (Рисунок 3M). Следите за тем, чтобы клей не попал на ткани поджелудочной железы.
  22. С помощью вакуумных звукоснимателей поднимите 5-миллиметровый покровный щиток.
  23. Осторожно поместите защитное стекло внутрь углубления в центре оптической оконной рамы. Удерживайте с легким давлением, позволяя цианоакрилатному клею схватиться (~25 с).
  24. Отделите покровный листок от вакуумных пикапов с помощью щипцов.
  25. Затяните швы для вышивки крестиком, чтобы поджелудочная железа плотно прилегала к покровному стеблю (Рисунок 3N, O). Примечание: Не перетягивайте вышивку крестиком, так как это может привести к повреждению и ишемии поджелудочной железы.
  26. Обрежьте концы шва.
  27. Снимите скотч с мыши.
  28. Выключите испаритель изофлурана.
  29. Переместите мышь в чистую клетку или непосредственно к прижизненному микроскопу.
  30. Поместите животных в индивидуальное жилище после операции на окне и наблюдайте за ними до полного выздоровления.
  31. Затем визуализация выполняется на двухлазерном многофотонном микроскопе, как мы описали ранее 22,23,24 Для длительных сеансов визуализации мышь помещается в обогреваемую камеру для поддержания температуры тела и снабжается поддерживающими жидкостями в соответствии со стандартами IACUC.

5. Церулеин для индукции панкреатита

  1. Чтобы исследовать начало панкреатита, лечат здоровых мышей церулеином после имплантации SWIP. Убедитесь, что мышей голодают в течение 14-18 ч и дают им воду вволю перед введением церулеина.
  2. Вводят 50 мкг/кг церулеина в 100 мкл стерильного 1x DPBS внутрибрюшинно с интервалом в 1 ч до восьми инъекций. Вводят контрольным мышам эквивалентный объем 1x DPBS, вводимый внутрибрюшинно.
  3. После визуализации жертвуют мышей через 24 ч после первой инъекции при вывихе шейки матки в соответствии со стандартами IACUC.
  4. Выполните визуализацию на двухлазерном многофотонном микроскопе, как описано ранее 22,23,24. Во время длительных сеансов визуализации поместите мышь в обогреваемую камеру, чтобы поддерживать температуру тела и обеспечить ее поддерживающими жидкостями в соответствии со стандартами IACUC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1, адаптированном из Du et al.15, показаны кадры из покадрового видеоролика IVI мышиной поджелудочной железы. Некоторое движение тканей можно наблюдать в течение начального периода успокоения (первый час визуализации, рис. 1А). Однако при продолжении визуализации после этого периода успокоения (>75 мин) мы наблюдали увеличение латеральной и осевой стабильности (рис. 1B). Сравнение стабильности SWIP с предыдущими окнами визуализации AIW и PIW показывает, что все окна требуют начального периода для усадки. Тем не менее, SWIP показал самый низкий уровень дрейфа в целом и лучше всего подходит для долговременной визуализации (рис. 1C-K). Изображения генерировались на специально изготовленном многофотонном микроскопе24 с длиной волны 880 нм и получением z-stack-t lapse (размер поля зрения [FOV] = 340 x 340 мкм, размер пикселя 0,67 мкм) с интервалом между кадрами 1,7 мин, 11 срезов с шагом 2 мкм, глубиной изображения 20 и ~1 срезом/с. Мощность лазера и усиление фотоумножителя (ФЭУ) были выбраны для максимизации сигнала при минимизации фотообесцвечивания и фотоповреждения.

Этапы хирургических процедур, описывающих имплантацию опухоли поджелудочной железы и последующую установку окна поджелудочной железы, изображены на рисунке 2 и рисунке 3 соответственно. Важно отметить, что обе операции являются операциями выживания. После правильной имплантации поджелудочная железа остается прикрепленной к оптическому окну, которое теперь интегрировано в брюшную стенку. Это обеспечивает комфортное выживание мыши и позволяет получать непрерывную визуализацию до 12 часов, как это разрешено протоколом. Кроме того, серийная визуализация может проводиться в течение нескольких дней подряд (до 2 недель, предусмотренных протоколом) для мониторинга интересующих областей с течением времени. Прижизненная визуализация (ИВИ) может быть выполнена через окно способом, аналогичным другим окнам, описанным ранее22,25,26.

SWIP может быть использован для изучения динамики в начале острого панкреатита, индуцированного церулеином. Церулеин представляет собой олигопептид со структурой и функцией, сходными со структурой и функцией холецистокинина (ХКК), и широко используется для экспериментального индуцирования острого панкреатита у грызунов27. Лечение церулеином приводит к сокращению гладкой мускулатуры желудочно-кишечного тракта и стимулирует желудочную секрецию и секрецию поджелудочной железы28. Кроме того, внутрибрюшинное введение церулеина приводит к отеку и увеличению поджелудочной железы29.

На рисунке 4 показана серийная визуализация поджелудочной железы мышей после лечения церулеином с использованием протокола SWIP. Поджелудочная железа мышей визуализируется с одноклеточным разрешением с помощью генетического флуоресцентного мечения (трансгенные мыши, меченные ECFP эпителией-MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP) и введения высокомолекулярных красителей (декстран-TMR 155 кДа) для определения локальной сосудистой сети, обозначенной сплошными желтыми линиями. Конструкция окна, ранее использовавшаяся для визуализации легкихмышей 8, включает в себя три выгравированные линии на раме (рис. 4, врезка), которые действуют как реперные маркеры, позволяющие использовать микрокартографию30. Микрокартография позволяет получать последовательные изображения одной и той же области поджелудочной железы мышей в течение нескольких дней. Здесь одна и та же долька поджелудочной железы (желтые пунктирные линии) визуализируется на 1-й день и релокализуется на 2-й день, о чем свидетельствует наличие тех же местных кровеносных сосудов (рис. 4). Изображения были получены каждый день в виде одного z-стека с 11 срезами и шагом 2 мкм со скоростью ~1 срез/с, сделанных при освещенности 880 нм и разрешении 0,67 мкм/пиксель (FOV = 340 x 340 мкм). Мощность лазера и усиление ФЭУ были выбраны таким образом, чтобы максимизировать сигнал при минимизации фотообесцвечивания и фотоповреждения.

В дополнение к серийной визуализации, SWIP хорошо подходит для долгосрочной продольной визуализации, позволяя точно отслеживать и измерять динамику субклеточных структур (таких как вакуоли) в условиях контроля и лечения. Здесь вакуоли представляют собой области, в которых цитоплазматические флуоресцентные белки исключены, что приводит к появлению темных немеченых дырок (рис. 5А). Маркировка вакуолей с помощью программного обеспечения, такого как ROI Tracker24, позволяет визуализировать подвижность вакуолей, (рис. 5A, B) и количественно оценить многочисленные параметры подвижности. Например, средняя скорость вакуолей в поджелудочной железе мышей увеличилась примерно на 10% после лечения церулином для индуцирования панкреатита по сравнению с лечением PBS (0,37 ± 0,07 мкм/мин против 0,41 ± 0,09 мкм/мин, p = 0,02) (рис. 5C). Лечение церулеином также увеличивало среднюю частоту поворота субклеточных структур на 10% по сравнению с лечением PBS (2,3 ± 0,3 град/мин против 2,6 ± 0,6 град/мин, p = 0,04) (рис. 5F). Тем не менее, не было существенной разницы (p > 0,05) в чистой скорости, направленности или кумулятивном расстоянии, пройденном между лечением церулеином и лечением PBS (рис. 5D, E и рис. 5G). Изображения генерировались на специально изготовленном многофотонном микроскопе24 со светом 880 нм и получением z-stack-t lapse (размер FOV = 340 x 340 мкм, размер пикселя 0,67 мкм) с интервалом между кадрами 2,9 мин, 11 срезов с шагом 2 мкм и ~1 срез/с.

Наконец, SWIP позволяет визуализировать и фиксировать миграцию опухолевых клеток. На рисунке 6A показан кадр из покадрового видеоролика (Supplemental Video S1 и Supplemental Video S2) миграции в поджелудочной железе меченых KPC-клеток KPC, которые были ортотопически введены. В течение коротких периодов времени (<1 ч) можно наблюдать как коллективную миграцию клеток в кластерах (рис. 6B и дополнительное видео S1), так и миграцию отдельных клеток (рис. 6C и дополнительное видео S2). Изображения генерировались на специально изготовленном многофотонном микроскопе24 со светом 880 нм и получением провала 4 x 4 mosaic-z stack-t с 20% перекрытием между плитками (размер плитки = 340 x 340 мкм), 3,4 мин между кадрами, 3 среза с шагом 5 мкм и ~1 срез/с. Мощность лазера и усиление ФЭУ были выбраны таким образом, чтобы максимизировать сигнал при минимизации фотообесцвечивания и фотоповреждения.

Figure 1
Рисунок 1: Повышенная стабильность визуализации благодаря SWIP. (A) Кадры из первых 72 минут таймлапс-видео поджелудочной железы, снятого с помощью SWIP. Может наблюдаться некоторый осевой, но очень незначительный боковой дрейф. Масштабные линейки = 50 мкм. (B) Непрерывная покадровая визуализация через 72 мин показывает высокий уровень осевой и латеральной стабильности. (А,Б) Красный = 155 кДа сыворотка крови, меченная тетраметилродамином, меченая декстраном, Голубой = ЦФП-меченные клетки поджелудочной железы (трансгенные мыши MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP) (C-E) Сравнение латеральной стабильности каждого из окон визуализации поджелудочной железы в течение первого часа визуализации для (C) AIW, (D) PIW и (E) SWIP. (Ф-Х) Сравнение латеральной стабильности каждого из изображений поджелудочной железы в течение последующих 150 мин для (F) AIW, (G) PIW и (H) SWIP. Врезки представляют собой увеличенные виды соответствующих графиков. (И-К) Сравнение осевой стабильности каждого из окон визуализации поджелудочной железы в течение первых 120 минут визуализации для (I) AIW, (J) PIW и (K) SWIP. Этот рисунок взят из Du et al. Open Biology 2022, DOI:10.1098/rsob.210273 https://royalsocietypublishing.org/doi/full/10.109 8/rsob.210273. 15. Сокращения: SWIP = стабилизированное окно для прижизненной визуализации поджелудочной железы; AIW = окно визуализации брюшной полости; PIW = окно визуализации поджелудочной железы; CFP = голубой флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Обзор хирургического протокола ортотопической инъекции клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (КПК). (А) Иллюстрация того, как держать хирургические щипцы. (Б) Иллюстрация того, как держать ножницы Кастровьехо. (C) Иллюстрация того, как держать инструмент вакуумного захвата. (D) Дезинфекция кожи. (E) Разрез на коже. (F) Разрез в мышце. (G) Растопыренная поджелудочная железа. (H) Введение иглы в нужное место инъекции. (I) Инъекция суспензии раковых клеток с образованием пузыря (синяя стрелка). (J) Поджелудочная железа вернулась в брюшную полость. (К,Л) Закрытие мышечного слоя прерывистым шелковым швом. (М,Н) Закрытие кожи прерывистым шелковым швом. (O) Цианоакрилатный клей, нанесенный на разрез. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Обзор протокола операции «Стабилизированное окно для визуализации поджелудочной железы». (А) Идентификация селезенки и прикрепленной поджелудочной железы. (В,В) Круговой разрез на коже и мышцах. Красные пунктирные линии в А-С обозначают контур селезенки, который можно увидеть через брюшную стенку и кожу. (Д,Э) Первый стежок корзины для вышивки крестиком помещается и завязывается в мышечный слой (Е, желтая стрелка). (F) Стежок продолжается до противоположной стороны разреза мышцы, оставляя хвост (белая стрелка). (Г,Н) Второй стежок ставится перпендикулярно первому, завязывается с одного конца (желтые стрелки) и оставляет хвостик (белые стрелки). (Я,Дж) Помещение поджелудочной железы в корзину для вышивки крестиком. (K) Круговой кисетный шов через мышцы и кожу. (L) Имплантация оконной рамы. (M) Нанесение клея на оконную раму. (N) Прикрепление стеклянного покровного стекла. (O) Концы вышивки крестиком затянуты. (P) Полностью имплантированный SWIP. Аббревиатура: SWIP = стабилизированное окно для прижизненной визуализации поджелудочной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Микрокартография, используемая для последовательной визуализации для повторной локализации одних и тех же областей интереса в пределах оптического окна. Прижизненная визуализация одного участка мышиной поджелудочной железы, показывающая, что одна и та же долька перемещалась в течение 2 дней подряд (D1-D2) с помощью микрокартографии. Желтыми пунктирными линиями очерчены границы одной и той же дольки. Сплошные линии выделяют одни и те же кровеносные сосуды (о чем свидетельствует наличие сыворотки крови с красной меткой в просвете), выявленные каждый последующий день. Красный = 155 кДа сыворотка крови, меченная тетраметилродамином, меченая декстраном, Голубой = клетки поджелудочной железы, меченные CFP (трансгенные мыши MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP) (Врезка) Изображение SWIP с царапинами для микрокартографии. Использование микрокартографии для перемещения интересующих областей во время последовательной визуализации разрешено тремя выгравированными линиями на оконной раме (врезка). Масштабные линейки = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Субклеточное разрешение и измерение субклеточной динамики с помощью SWIP. (A) Отдельные клетки (пунктирные желтые контуры) и субклеточные структуры, такие как вакуоли, могут быть визуализированы с помощью SWIP с течением времени в поджелудочной железе мышей. Примеры таких вакуолей обозначены желтыми стрелками. Таким образом, SWIP позволяет отслеживать субклеточные структуры (цветные контуры и треки, наложенные на флуоресцентное изображение) с течением времени. На врезке изображена увеличенная желтая прямоугольная область, показывающая три отслеживаемые вакуоли. Масштабная линейка = 50 мкм. (B) Траектории субклеточных структур, таких как ядра и вакуоли (выделены А), после сдвига координат к исходной точке. Красная пунктирная линия показывает средний путь цепи за 1 ч (3,46 мкм). Количественная оценка динамических параметров (C) средней скорости, (D) чистого пробега, (E) направленности, (F) средней частоты поворотов и (G) кумулятивного расстояния. Красный = 155 кДа сыворотка крови, меченная тетраметилродамином, меченая декстраном, голубой = ЦФП-меченные клетки поджелудочной железы (трансгенные мыши MMTV-iCre/CAG-CAC-ECFP). Сокращения: SWIP = стабилизированное окно для прижизненной визуализации поджелудочной железы; CFP = голубой флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Регистрация миграции клеток с помощью SWIP . (A) Неподвижное изображение из покадровой прижизненной визуализации поджелудочной железы в ортотопически инъективной мышиной модели PDAC. (B) Неподвижные изображения из дополнительного видео S1 , показывающие пример коллективной миграции опухолевых клеток (желтая стрелка). (C) Кадры из дополнительного видеоролика S2 , показывающие примеры одноклеточной миграции опухолевой клетки (желтая стрелка) и макрофага (красная стрелка). Зеленый = опухолевые клетки, меченные Dendra2, синий = макрофаги, меченные CFP, красный = 155 кДа сыворотка крови, меченная тетраметилродамином-декстраном. Масштабные линейки = 50 мкм (А), 15 мкм (В,С). Сокращения: SWIP = стабилизированное окно для прижизненной визуализации поджелудочной железы; CFP = голубой флуоресцентный белок; PDAC = аденокарцинома поджелудочной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительное видео S1: Видеоролик с прижизненной визуализацией с интервальной съемкой, показывающий коллективную миграцию опухолевых клеток, как показано на рисунке 6B. Зеленый = опухолевые клетки, меченные Dendra2, синий = макрофаги, меченные CFP, красный = 155 кДа сыворотка крови, меченная тетраметилродамином-декстраном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный видеоролик S2: Видеоролик с прижизненной визуализацией с интервальной съемкой, показывающий миграцию опухолевых клеток, проходящих миграцию одиночных клеток, как показано на рисунке 6C. Зеленый = опухолевые клетки, меченные Dendra2, синий = макрофаги, меченные CFP, красный = 155 кДа сыворотка крови, меченная тетраметилродамином-декстраном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол SWIP, описанный здесь, обеспечивает улучшенный метод стабилизации тканей поджелудочной железы с использованием техники вышивки корзиной крестиком. Ранние окна визуализации брюшной полости (AIW) позволяли проводить прижизненную визуализацию (IVI) внутренних органов брюшной полости, но не ограничивали адекватно движение мягких тканей, таких как поджелудочная железа. В ответ на это Park et al. разработали окно визуализации поджелудочной железы (PIW), которое включает в себя горизонтальную металлическую полку и позволяет улучшить стабилизацию ткани поджелудочной железы, сохраняя при этом контакт со стеклянным покровным стеклом. Несмотря на то, что этот подход улучшает латеральную стабильность, он ограничивает визуализацию солидных опухолей поджелудочной железы, поскольку их размер превышает узкое пространство между полкой и покровным стеклом. SWIP решает эту проблему, стабилизируя поджелудочную железу с помощью корзины для вышивания крестиком, ограничивая как осевое, так и боковое смещение, а также способствуя размещению больших (≤10 мм) солидных опухолей.

Прямые сравнения SWIP с предыдущими окнами визуализации, такими как AIW и PIW, были проведены ранее15. Это показано на рисунке 1, адаптированном из Du et al.15, где боковые и осевые сдвиги были количественно оценены путем отслеживания клеточных анатомических особенностей, таких как ядра или кровеносные сосуды. Во всех окнах визуализации наблюдалась необходимость в периоде успокоения в течение примерно первого часа съемки. В течение этого времени наблюдалась более высокая степень бокового смещения с AIW и PIW по сравнению с SWIP. Большее осевое смещение также наблюдалось при использовании AIW и PIW по сравнению с SWIP в течение 2 часов. В целом, SWIP показал наименьший уровень дрейфа и подходит для длительной съемки (≤12 ч).

К сожалению, поджелудочная железа является сильно рассеивающей тканью, и поэтому функция точечного разброса для многофотонного микроскопа, используемого в IVI, быстро ухудшается при проникновении в ткань. Таким образом, глубина изображения с любым из оптических окон ограничена всего ~30-60 мкм. IVI также несет в себе риск повреждения образца светом. Это можно проверить в начале сеансов визуализации, получив временные ряды из 100 изображений и посмотрев на признаки фотообесцвечивания или фотоповреждения. На нашей микроскопической системе мы обнаружили, что максимальная мощность ~15 мВт на образце может быть использована без негативного воздействия на ткани.

Протокол SWIP позволяет проводить стабильную одноклеточную оптическую IVI поджелудочной железы мышей с высоким разрешением как в нормальных здоровых условиях, так и при болезненных состояниях, таких как панкреатит и PDAC. Это делает SWIP особенно полезным для длительной покадровой съемки, а также для выполнения 3D и 4D (3D + время) визуализации путем захвата нескольких z-срезов (используя преимущества возможностей оптического секционирования, присущих многофотонной и конфокальной микроскопии). Позволяя визуализировать in vivo отдельные клетки и их взаимодействие с клеточными составляющими поджелудочной железы, IVI высокого разрешения окажется бесценным для понимания механизмов, лежащих в основе заболеваний поджелудочной железы.

Для выполнения протокола SWIP необходим определенный уровень технических знаний. Однако при должной практике и внимании к ключевым этапам процедура может быть выполнена с высоким процентом успеха. Для визуализации злокачественной поджелудочной железы крайне важно сначала успешно имплантировать опухоль. Его получают путем ортотопической инъекции суспензии мышиных раковых клеток поджелудочной железы в поджелудочную железу мыши. Успешная инъекция наблюдается, когда паренхима поджелудочной железы раздувается в пузырь, заполненный жидкостью, и была подробно описана ранее21. Для обеспечения максимального успеха и выживания жизненно важно, чтобы утечка клеточной суспензии была минимальной или отсутствовала вовсе, так как утечка значительно уменьшит потенциальный размер опухоли, а также приведет к канцероматозу. Кроме того, поджелудочная железа является сильно васкуляризированным органом с множеством разветвленных кровеносных сосудов. Очень важно избегать разрыва сосудов, так как это вызовет кровотечение и последующую гематому в поджелудочной железе и затормозит рост опухоли. В этой модели мы использовали сингенную клеточную линию PDAC, полученную от мышей KPC20. Это позволяет приживлять опухоль у иммунокомпетентных мышей. Другие сингенные клеточные линии PDAC могут быть использованы в зависимости от штамма используемой мыши. Также могут быть использованы клеточные линии PDAC человека; Тем не менее, штамм мыши должен быть иммунизирован, чтобы избежать отторжения имплантации опухоли.

Размер опухолей, подвергающихся визуализации в этом протоколе, может быть изменен по мере необходимости. Это может быть достигнуто путем использования более высокой концентрации раковых клеток, имплантируемых в поджелудочную железу мышей для получения опухоли большего размера, или путем увеличения времени роста опухоли перед имплантацией окна. В этом исследовании мы ввели 106 клеток KPC PDAC и имплантировали SWIP через 10-14 дней после этого, когда опухоли были пальпируемы. Меньшие и большие опухоли также могут быть размещены по этому протоколу SWIP с использованием соответствующего размещения ткани в корзине для вышивки крестом.

Надежное размещение окна визуализации и поджелудочной железы также имеет решающее значение для получения высококачественной визуализации и ограничения артефактов движения. Нормальная поджелудочная железа мышей очень послушна и склонна к движению от дыхания и близлежащей перистальтики. Для решения этой проблемы и повышения стабильности поджелудочной железы во время визуализации используется ранее описанная техника вышивки корзиной крестом31. Корзина для вышивки крестом спроектирована таким образом, чтобы имитировать использование связок телом. Прижимая ткань к стеклянному покровному стеклу и оказывая постоянное осевое давление, он предотвращает как боковое, так и осевое смещение. При работе с более крупными солидными опухолями точка опоры и направление вышивки крестиком могут быть изменены таким образом, чтобы наилучшим образом соответствовать размеру и положению опухоли для оптимальной поддержки.

Неоптимальная визуализация также может произойти, когда оконная рама неадекватно имплантирована в брюшную полость мыши. Неплотно подогнанная оконная рама может привести к трудностям с визуализацией и искажениям движения. Соответствующий кисетный шов может решить эту проблему, закрепив оконную раму на брюшной полости через кожу и брюшную стенку. Во избежание чрезмерного сгибания кожи при затягивании шнурок между шагами стежки должны быть не более 5 мм, которые располагаются на расстоянии не более 1 мм от края ткани, обеспечивая плотное прилегание к оконной раме. После наложения шва, помещения поджелудочной железы в корзину для вышивки крестиком и имплантации оконной рамы, последним важным этапом является нанесение клея в углубление оконной рамы. Очень важно, чтобы на этом этапе клей не контактировал с тканью поджелудочной железы, так как это может повредить ткань и затруднить визуализацию. Потенциальная модификация, которая также может предотвратить контакт клея с тканью поджелудочной железы, заключается в том, чтобы приклеить стеклянную защитную пленку к оконной раме и дать им высохнуть перед хирургической имплантацией в брюшную полость.

SWIP, как и все методы прижизненной визуализации, имеет ограничения в своей способности раскрывать информацию о других клетках и структурах в ткани, которые явно не помечены. Тем не менее, сочетание окна SWIP с флуоресцентными репортерами (такими как ECFP-экспрессирующий эпителий и Dendra2-меченые клетки KPC, как в этом исследовании) и контроль белковых или клеточных состояний с помощью фармакологических и/или оптогенетических инструментов может устранить эти ограничения.

Кроме того, конструкция окна SWIP включает в себя три выгравированные линии на оконной раме, служащие в качестве реперных маркеров для микрокартографии для повторной локализации областей интереса во время серийной визуализации30. Это позволяет находить одно и то же поле зрения несколько раз, даже в немаркированных тканях.

Таким образом, SWIP может быть использован в нормальной здоровой ткани поджелудочной железы, а также при доброкачественных и злокачественных заболеваниях поджелудочной железы, таких как панкреатит и PDAC. Одноклеточная и субклеточная динамика может быть зафиксирована в этих состояниях с помощью SWIP и может помочь исследователям понять важные физиологические события, такие как метастатическая диссеминация при PDAC. Повышенное качество и стабильность IVI могут дать ценную информацию о патофизиологии и клеточной биологии поджелудочной железы, что делает его многообещающим и полезным инструментом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgments

Благотворительный фонд Эвелин Липпер, Центр биофотоники Грусса-Липпера, Программа комплексной визуализации для исследования рака, стипендия NIH T-32 (CA200561) и грант Программы исследования рака поджелудочной железы Министерства обороны США (PCARP) PA210223P1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent Alconox Inc NA Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning
5% (w/v) solution of sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045 Passivation reagent
5 mm cover glass Electron Microscopy Sciences 72296-05 Round Glass Coverslips 
7% (w/v) solution of citric acid Sigma-Aldrich  251275 Passivation reagent
28G 1 mL BD Insulin Syringe BD 329410 Syringe for cell injection
Baytril 100 (enrofloxacin) Bayer (Santa Cruz Biotechnology) sc-362890Rx Antibiotic
Bench Mount Heat Lamp McMaster-Carr 3349K51 Heat lamp
Buprenorphine 0.3 mg/mL Covetrus North America 059122 Buprenorphine Analgesia
Castroviejo Curved Scissors World Precision Instruments WP2220 Scissor for cutting tissue
C57BL/6J Mouse Jackson Laboratory 000664  C57BL/6J Mouse
Chlorhexidine solution Durvet 7-45801-10258-3 Chlorhexidine Disinfectant Solution
Compressed air canister Falcon DPSJB-12 Compressed air for drying tissue
Cyano acrylate - Gel Superglue Staples 234790-6 Skin Glue
Cyano acrylate - Liquid Superglue Staples LOC1647358 Coverslip Glue
DPBS 1x Corning 21-031-CV DPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery Kit Harvard Apparatus 726067 Cautery Pen
Germinator 500 CellPoint Scientific GER 5287-120V Bead Sterilizer
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length Roboz Surgical RS-5135  Graefe Micro Dissecting Forceps
Imaging microscope NA NA See Entenberg et al. 2011 [27]
Imaging software NA NA See Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane) Henry Schein Animal Health 50033 Isoflurane Anesthesia
Kim Wipes Fisher Scientific 06-666-A  Kim Wipes
Laboratory tape Fisher Scientific 159015R Laboratory Tape
Mouse Dissecting Kit World Precision Instruments MOUSEKIT Surgical Instruments
Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor Kent Scientific Corpo MSTAT Sensor-MSE Pulse Oximeter
Mouse Surgisuite Kent Scientific SURGI-M04 Heated platform
Nair Hair Removal Lotion Amazon B001RVMR7K Depilatory Lotion
Oxygen TechAir OX TM Oxygen
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 VWR 95056-872 Silk Suture
Phosphate Buffered Saline 1x Life Technologies 10010-023 PBS
PhysioSuite System Kent Scientific PhysioSuite Heated Platform Controller
Puralube Henry Schein Animal Health 008897 Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs  Fisher Scientific 867WCNOGLUE Cotton Swabs
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL Denville Scientific Inc. P1125 100 µL Pipet Tips
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran Sigma-Aldrich T1287-500MG Vascular Label
Window-fixturing plate NA NA Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8].
Window Frame NA NA The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8].

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peery, A. F., et al. Burden and cost of gastrointestinal, liver, and pancreatic diseases in the United States: Update 2021. Gastroenterology. 162 (2), 621-644 (2022).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 73 (1), 17-48 (2023).
  3. Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).
  4. Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry A. 97 (5), 448-457 (2020).
  5. Peters, N. C., et al. In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis transmitted by sand flies. Science. 321 (5891), 970-974 (2008).
  6. Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1147-1154 (2008).
  7. Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  9. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
  10. Park, K., You, J., Du, C., Pan, Y. Cranial window implantation on mouse cortex to study microvascular change induced by cocaine. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 97-107 (2015).
  11. Beerling, E., Oosterom, I., Voest, E., Lolkema, M., van Rheenen, J. Intravital characterization of tumor cell migration in pancreatic cancer. Intravital. 5 (3), e1261773 (2016).
  12. Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews: Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
  13. Entenberg, D., et al. time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  14. Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
  15. Du, W., et al. SWIP-a stabilized window for intravital imaging of the murine pancreas. Open Biology Journal. 12 (6), 210273 (2022).
  16. DeBold, T. A. M., James, W. How To Passivate Stainless Steel Parts. , https://www.mmsonline.com/articles/how-to-passivate-stainless-steel-parts (2003).
  17. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  18. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  19. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), pdb prot5563 (2011).
  20. Moral, J. A., et al. ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity. Nature. 579 (7797), 130-135 (2020).
  21. Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), dmm034793 (2018).
  22. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
  23. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, 19.7.1-19.7.19 (2013).
  24. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  25. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments. (116), 54603 (2016).
  26. Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), 55115 (2018).
  27. Gorelick, F. S., Lerch, M. M. Do animal models of acute pancreatitis reproduce human disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (2), 251-262 (2017).
  28. Dolai, S., et al. Depletion of the membrane-fusion regulator Munc18c attenuates caerulein hyperstimulation-induced pancreatitis. Journal of Biological Chemistry. 293 (7), 2510-2522 (2018).
  29. Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5 Pt 1), 1192-1204 (1985).
  30. Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
  31. Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer. Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).

Tags

Стабилизированное окно Прижизненная визуализация Мышиная поджелудочная железа Физиология поджелудочной железы Панкреатит Аденокарцинома поджелудочной железы Визуализация высокого разрешения Наблюдение в реальном времени Клеточная динамика SWIP Процесс имплантации Здоровая поджелудочная железа Острый панкреатит Опухоли поджелудочной железы Генетически меченые клетки Флуоресцентные красители Динамика одиночных клеток Субклеточная динамика Коллективная миграция Серийная визуализация Миграция опухолевых клеток Метастатическая нагрузка PDAC
Стабилизированное окно для прижизненной визуализации поджелудочной железы мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petersen, J., Du, W., Adkisson, C.,… More

Petersen, J., Du, W., Adkisson, C., Gravekamp, C., Oktay, M. H., Condeelis, J., Panarelli, N. C., McAuliffe, J. C., Entenberg, D. Stabilized Window for Intravital Imaging of the Murine Pancreas. J. Vis. Exp. (200), e65498, doi:10.3791/65498 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter