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Biology

आईपीएससी-व्युत्पन्न रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम का उपयोग करके लिपिड जमा के लक्षण वर्णन और परिमाणीकरण की लिपिडयूनेट-मशीन लर्निंग-आधारित विधि

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65503
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Ocular and Stem Cell Translational Research Section, National Eye Institute, National Institutes of Health (NIH)
* These authors contributed equally

Summary

अपक्षयी नेत्र रोग जो आंख की रेटिना वर्णक उपकला परत को प्रभावित करते हैं, उनमें मोनोजेनिक और पॉलीजेनिक उत्पत्ति होती है। कई रोग मॉडल और एक सॉफ्टवेयर एप्लिकेशन, लिपिडयूनेट, रोग के तंत्र, साथ ही संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेपों का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है।

Abstract

रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) आंख के पीछे स्थित हेक्सागोनल कोशिकाओं का एक मोनोलेयर है। यह फोटोरिसेप्टर और कोरॉयडल केशिकाओं को पोषण और समर्थन प्रदान करता है, फोटोरिसेप्टर बाहरी खंडों (पीओएस) के फागोसाइटोसिस करता है, और बाहरी रेटिना के होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए ध्रुवीकृत तरीके से साइटोकिन्स का स्राव करता है। उत्परिवर्तन, उम्र बढ़ने और पर्यावरणीय कारकों के कारण होने वाले डिस्फंक्शनल आरपीई के परिणामस्वरूप अन्य रेटिना परतों का अपघटन होता है और दृष्टि हानि का कारण बनता है। डिजेनरेटिंग आरपीई की एक हॉलमार्क फेनोटाइपिक विशेषता इंट्रा और उप-सेलुलर लिपिड समृद्ध जमा है। ये जमा विभिन्न रेटिना अपक्षयी रोगों में एक सामान्य फेनोटाइप हैं। विट्रो में मोनोजेनिक रेटिना अपघटन के लिपिड जमा फेनोटाइप को पुन: पेश करने के लिए, रोगियों के फाइब्रोब्लास्ट से प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न आरपीई (आईआरपीई) उत्पन्न किया गया था। स्टारगार्ड और लेट-ऑनसेट रेटिना डिजनरेशन (एल-ओआरडी) रोग वाले रोगियों से उत्पन्न सेल लाइनों को आरपीई शारीरिक कार्य को दोहराने के लिए 7 दिनों के लिए पीओएस के साथ खिलाया गया था, जिससे इन बीमारियों में पीओएस फागोसाइटोसिस-प्रेरित विकृति हुई। उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) के लिए एक मॉडल उत्पन्न करने के लिए, वैकल्पिक पूरक सक्रियण से जुड़ी एक पॉलीजेनिक बीमारी, आईआरपीई को वैकल्पिक पूरक एनाफिलाटॉक्सिन के साथ चुनौती दी गई थी। इंट्रा और उप-सेलुलर लिपिड जमा को नील लाल, बोरान-डिपाइरोमेथेन (बीओडीआईपीवाई), और एपोलिपोप्रोटीन ई (एपीओई) का उपयोग करके चित्रित किया गया था। लिपिड जमा के घनत्व को निर्धारित करने के लिए, एक मशीन लर्निंग-आधारित सॉफ्टवेयर, लिपिडयूनेट, विकसित किया गया था। सॉफ्टवेयर को संस्कृति सतहों पर आईआरपीई की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवियों पर प्रशिक्षित किया गया था। भविष्य में, इसे त्रि-आयामी (3 डी) छवियों का विश्लेषण करने और लिपिड बूंदों की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रशिक्षित किया जाएगा। लिपिडयूनेट सॉफ्टवेयर दवाओं की खोज के लिए एक मूल्यवान संसाधन होगा जो रोग मॉडल में लिपिड संचय को कम करता है।

Introduction

रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) रेटिना फोटोरिसेप्टर से सटे आंख के पीछे स्थित कोशिकाओं का एक मोनोलेयर है। आरपीई फोटोरिसेप्टर को चयापचय और संरचनात्मक सहायता प्रदान करके उचित दृष्टि बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। स्वस्थ आरपीई कोशिकाओं को एक अलग हेक्सागोनल आकृति विज्ञान की विशेषता है। वे तंग जंक्शनों से जुड़े होते हैं, जो आरपीई को अपने बेसल साइड पर स्थित कोरियोकेशिकाओं और एपिकल रूप से स्थित फोटोरिसेप्टर के बीच एक बाधा के रूप में कार्य करने की अनुमति देते हैं। रेटिना पारिस्थितिकी तंत्र को बनाए रखने के लिए, आरपीई प्रमुख मेटाबोलाइट्स, जैसे, ग्लूकोज, को फोटोरिसेप्टर में इस तरह से शटल करता है जो आरपीई1 में ग्लूकोज की खपत को कम करता है। इस सीमा के कारण, आरपीई फैटी एसिड सहित अपनी चयापचय आवश्यकताओं को बनाए रखने के लिए अन्य मेटाबोलाइट्स पर निर्भर करता है, जिसे आरपीई β-ऑक्सीकरण2 के माध्यम से कीटोन्स में परिवर्तित करता है। फैटी एसिड का उपयोग करने के लिए आरपीई की प्रवृत्ति को देखते हुए, जो संभवतः ऊर्जा स्रोत के रूप में फोटोरिसेप्टर बाहरी खंड (पीओएस) पाचन से पुनर्नवीनीकरण होते हैं, आरपीई में लिपिड प्रसंस्करण मार्गों में हानिकारक परिवर्तन अक्सर मोनोजेनिक और पॉलीजेनिक अपक्षयीरेटिना रोगों दोनों में शामिल होते हैं।

उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी), एक पॉलीजेनिक अपक्षयी आंख रोग जो आरपीई अध: पतन का कारण बनता है, को आरपीई मोनोलेयर में असामान्य ऑटोफैगी और लिपिड चयापचय से भी जोड़ा गया है। पीओएस को संसाधित करने और अन्य महत्वपूर्ण कार्यों को करने के लिए एक बेकार आरपीई मोनोलेयर की विफलता आरपीई और ब्रुच की झिल्ली के बीच स्थित बेसल रैखिक जमा (बीएलआईएनडी) नामक बाह्य (उप-आरपीई) जमा की ओर ले जाती है - एएमडी विकृति की एक पहचान। बीएलआईएनडी के प्रमुख घटकों में लिपोप्रोटीन शामिल हैं, जिनमें से सबसे प्रचुर मात्रा में एपोलिपोप्रोटीन ई (एपीओई) 4 है। बीएलआईएनडी की पतली परतों के संचय से नरम ड्रूसन हो सकता है, जिसे एएमडी 5,6 के नैदानिक लक्षण के रूप में पहचाना जाता है।

कई समूहों ने दिखाया है कि स्टेम सेल-व्युत्पन्न इन विट्रो रोग मॉडल जो आरपीई डिसफंक्शन का कारण बनते हैं, उनमें उप-आरपीई लिपिड संचय 7,8,9 होता है। (2017) ने सीएफएच जीन की बहुरूपता के कारण एएमडी के लिए उच्च जोखिम वाले रोगियों से प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न आरपीई (आईआरपीई) उत्पन्न किया। आईआरपीई ने एपीओई द्वारा चिह्नित ड्रूसन संचय दिखाया, और उच्च जोखिम वाले आरपीई ने कम जोखिमवाले रोगियों से उत्पन्न आईआरपीई की तुलना में बड़ी जमा जमा की।

एक इन विट्रो मॉडल बनाने के लिए जो एएमडी के सेलुलर हॉलमार्क, जैसे लिपिड ड्रॉपलेट्स और ड्रूसन जमाव को पुन: परिभाषित करता है, रोगी के रक्त के नमूनों से उत्पन्न आईआरपीई लाइनों को पहले प्रकाशित विकासात्मक रूप से निर्देशित प्रोटोकॉल11 का उपयोग करके स्थापित किया गया था। आईआरपीई को पूरक-सक्षम मानव सीरम (सीसी-एचएस) के अधीन किया गया था, एक समाधान जिसमें एनाफिलाटॉक्सिन होते हैं जो एएमडी के एक संभावित कारण की नकल करते हैं: वैकल्पिक पूरक सिग्नलिंगमें वृद्धि 8। लिपिड जमा के परिणामस्वरूप सेलुलर और उप-सेलुलर जमाव को आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले लिपिड और लिपोप्रोटीन मार्करों, एपीओई, नाइल रेड और बीओडीआईपीवाई का उपयोग करके मापा गया था। इन मार्करों के माध्यम से, यह दिखाया गया था कि सीसी-एचएस के माध्यम से सक्रिय पूरक सिग्नलिंग ने आईआरपीई कोशिकाओं8 में लिपिड संचय को बढ़ा दिया।

एक मोनोजेनिक रेटिना अपक्षयी बीमारी के लिए एक रोग मॉडल विकसित करने के लिए, आईआरपीई लाइनों को स्टारगार्ड रोग के रोगियों से विकसित किया गया था, जो आरपीई में एबीसीए 4 जीन में उत्परिवर्तन के कारण होने वाली बीमारी है। यह पहले दिखाया गया है कि जब एबीसीए 4 को बाहर कर दिया जाता है, तो ए 2 ई लिपोफसिन, एक इंट्रासेल्युलर जमा जिसमें फॉस्फोलिपिड्स और प्रकाश-निर्भर लिपिड पेरोक्सीडेशन उत्पादों के उच्च स्तर होते हैं, आरपीई12 के अंदर जमा होते हैं। एबीसीए 4 नॉकआउट लाइनों को रोगी लाइनों के साथ विकसित किया गया था, और दोनों को पीओएस फीडिंग के अधीन किया गया था। स्टारगार्ड आईआरपीई ने पीओएस फागोसाइटोसिस-प्रेरित विकृति का प्रदर्शन किया, जो बीओडीआईपीवाई स्टेनिंग द्वारा निर्धारित लिपिड संचय में वृद्धि का प्रदर्शन करता है। एबीसीए 4 केओ आईपीएससी से प्राप्त आरपीई को सीसी-एचएस उपचार के अधीन किया गया था; बीओडीआईपीवाई सिग्नल के परिमाणीकरण ने स्टार्गर्ड रोग मॉडलमें लिपिड हैंडलिंग में दोष दिखाया।

इन बीमारियों की व्यापकता और ऊपर वर्णित प्रासंगिक रोग मॉडल के साथ-साथ प्रभावी चिकित्सा विज्ञान की आवश्यकता को देखते हुए, संभावित उपचारों की प्रभावकारिता को निर्धारित करने के लिए मजबूत तरीकों को स्थापित करने की आवश्यकता है। लिपिड जमा को उद्देश्यपूर्ण, स्वचालित और मानकीकृत तरीके से निर्धारित करने के लिए, एक मशीन-लर्निंग-आधारित सॉफ्टवेयर, लिपिडयूनेट बनाया गया था, ताकि, जब मास्क विश्लेषण उपकरणों के साथ जोड़ा जाए, तो लिपिड जमाव को सामान्य मार्कर नील रेड, बीओडीआईपीवाई और एपीओई का उपयोग करके जल्दी और प्रभावी ढंग से पहचाना जा सके। इस विश्लेषण पाइपलाइन का उपयोग करके प्राप्त सारांश आंकड़ों का विश्लेषण किया जा सकता है और ग्राफिक रूप से प्रदर्शित किया जा सकता है, जिससे उपचार की स्थिति की आसान तुलना हो सकती है। प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध: आरपीई कोशिकाओं को 96-वेल प्लेट पर उगाया जाता है और विट्रो में विभिन्न प्रकार के रेटिना अपघटन को मॉडल करने के लिए सक्रिय मानव सीरम या शुद्ध गोजातीय बाहरी खंडों के साथ चुनौती दी जाती है। आरपीई कोशिकाओं को नाइल रेड, बीओडीआईपीवाई और एपीओई के साथ लिपोप्रोटीन जमा के लिए तय और दाग दिया जाता है। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग फ्लोरोसेंटली-लेबल लिपिड कणों के जेड-ढेर को प्राप्त करने के लिए किया जाता है, जिन्हें बाद में 2 डी अधिकतम तीव्रता अनुमानों में संसाधित किया जाता है। एक मशीन-लर्निंग एल्गोरिदम को लिपोप्रोटीन कणों को पहचानने और सही ढंग से विभाजित करने के लिए प्रशिक्षित किया गया था। कण गणना और विभिन्न आकार मैट्रिक्स युक्त सारांश तालिकाएं उत्पन्न होती हैं और बाद में प्लॉटिंग और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए उपयोग की जा सकती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Protocol

सभी प्रोटोकॉल कदम एनआईएच की मानव अनुसंधान नैतिकता समिति द्वारा निर्धारित दिशानिर्देशों का पालन करते हैं। स्टेम सेल कार्य और रोगी नमूना संग्रह को अमेरिकी सरकार के 45 सीएफआर 46 दिशानिर्देशों के अनुसार, मानव अनुसंधान संरक्षण कार्यालय (ओएचआरपी), एनआईएच के तहत संयुक्त न्यूरोसाइंस संस्थागत समीक्षा बोर्ड (सीएनएस आईआरबी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रोटोकॉल संख्या एनसीटी01432847 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01432847?cond=NCT01432847&draw=2&rank=1) के तहत हेलसिंकी की घोषणा द्वारा निर्धारित मानदंडों के अनुसार सीएनएस आईआरबी-अनुमोदित सहमति फॉर्म का उपयोग करके रोगी के नमूने एकत्र किए गए थे।

1. आईआरपीई उत्पादन

  1. शर्मा एट अल, 202211 (चित्रा 2 और चित्रा 3) द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए रोगी रक्त-व्युत्पन्न आईपीएससी से आईआरपीई उत्पन्न करें।

Figure 2
चित्रा 2: आईआरपीई भेदभाव और परिपक्वता का योजनाबद्ध। आईआरपीई उत्पन्न करने के लिए, एक स्थापित भेदभाव प्रोटोकॉल का पालन किया गया था, और कोशिकाओं को 5 सप्ताह तक परिपक्व होने की अनुमति दी गई थी। परिणामी सेल कल्चर एक इन विट्रो मॉडल के रूप में कार्य करता है जिसे एएमडी और स्टारगार्ड रोग जैसी बीमारियों में आरपीई डिसफंक्शन की नकल करने के लिए विभिन्न उपचारों के साथ हेरफेर किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सफल और असफल आरपीई भेदभाव और परिपक्वता की प्रतिनिधि छवियां। टीजेपी 1 आरपीई के 10 x आवर्धन पर दो ब्राइटफील्ड छवियां आईआरपीई प्रोटोकॉल के दिन 42 पर दिखाई गई हैं। (ए) सफल भेदभाव और परिपक्वता रंजकता और बहुभुज आकृति विज्ञान के साथ संगत आरपीई दिखाएगी। (बी) असफल भेदभाव और परिपक्वता मरने वाली कोशिकाओं के समूहों को दिखाएगी, जैसा कि यहां दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. आरपीई रखरखाव मीडिया (आरपीई-एमएम) तैयारी

  1. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एन 2 पूरक को पिघलाएं। कमरे के तापमान (आरटी) पर अन्य सभी अभिकर्मकों को पिघलाएं।
  2. बाँझ परिस्थितियों में, शर्मा और अन्य, 202211 द्वारा स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार, सूचीबद्ध कमजोर पड़ने वाले कारकों पर तालिका 1 में सूचीबद्ध अभिकर्मकों को जोड़ें।
  3. मीडिया को अच्छी तरह से मिलाएं और 0.22 μm निस्पंदन इकाई का उपयोग करके इसे फ़िल्टर करें।
    नोट: मीडिया 2 सप्ताह के भीतर उपयोग के लिए उपयुक्त है यदि 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।

3. 96-वेल प्लेट सीडिंग

  1. 3-5 मिनट के लिए आरटी पर विट्रोनेक्टिन के एलिकोट को पिघलाएं या जब तक कि बर्फ पूरी तरह से पिघल न जाए।
  2. 1: 200 कमजोर पड़ने (विट्रोनेक्टिन: डीपीबीएस) का उपयोग करके वांछित कार्यशील समाधान प्राप्त करने के लिए 1x डलबेकको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) के साथ विट्रोनेक्टिन को पतला करें। 96-वेल प्लेट के लिए, प्रत्येक को 200 μL कार्यशील समाधान के साथ अच्छी तरह से कोट करें।
  3. 10 μM की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 1: 1000 कमजोर पड़ने पर आरपीई-एमएम के साथ पिघले हुए रॉक अवरोधक (वाई -27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड) को मिलाएं। यह आरपीई कोशिकाओं के लिए प्लेटिंग मीडिया है।
  4. एक स्वचालित सेल पिघलने प्रणाली का उपयोग करके आईआरपीई शीशी को पिघलाएं और आईआरपीई सेल निलंबन को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. 1:10 कमजोर पड़ने पर प्लेटिंग मीडिया के साथ सेल निलंबन को पतला करें। 5 मिनट के लिए 400 x g पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. सुपरनैटेंट को ध्यान से एस्पिरेट करें और प्लेटिंग मीडिया के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  7. सेल गिनती के लिए पुन: निलंबित सेल समाधान के 100 μL के साथ प्लेटिंग मीडिया के 400 μL मिलाएं। सेल व्यवहार्यता काउंटर का उपयोग करके सेल निलंबन की व्यवहार्य सेल एकाग्रता निर्धारित करने के लिए इस एलिकोट का उपयोग करें।
  8. प्लेटिंग मीडिया के साथ सेल निलंबन को 60,000 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पतला करें।
  9. 96-वेल प्लेट से विट्रोनेक्टिन कोटिंग समाधान को पूरी तरह से हटा दें और प्रत्येक कुएं में सेल सस्पेंशन के 200 μL वितरित करें। लगभग 12,000 कोशिकाएं / कुएं या ~ 200 कोशिकाएं / मिमी2 होंगी।
  10. बीज वाली सेल प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। 48 घंटे के बाद, रॉक अवरोधक पूरक के बिना मीडिया को आरपीई-एमएम में बदलें। 5 सप्ताह की परिपक्वता अवधि के दौरान हर 2-3 दिनों में मीडिया बदलें।

4. इन विट्रो रोग मॉडल

  1. सक्षम मानव सीरम (सीसी-एचएस) उपचार के पूरक
    1. मानव रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर सक्षम सीरम को पिघलाएं।
    2. सीसी-एचएस तैयार करें और अक्षम मानव सीरम (सीआई-एचएस) मीडिया को पूरक करें।
      1. 5% सीसी-एचएस मीडिया तैयार करने के लिए, पिघले हुए पूरक सक्षम मानव सीरम को आरपीई-एमएम के साथ 1: 20 कमजोर पड़ने पर मिलाएं। उपयोग करने से पहले 0.22 μm मीडिया फ़िल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें।
      2. 5% पूरक अक्षम मानव सीरम (सीआई-एचएस) मीडिया तैयार करने के लिए, पहले गर्मी सीसी-एचएस को 30 मिनट के लिए 57 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में निष्क्रिय कर देती है और फिर 1: 20 कमजोर पड़ने पर संस्कृति मीडिया के साथ मिश्रण करती है। उपयोग करने से पहले 0.22 μm मीडिया फ़िल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर करें।
    3. सीरम कोशिकाओं को 200 μL या तो 5% CC-HS या 5% CI-HS मीडिया के साथ 48 घंटे के कुल इनक्यूबेशन समय के लिए इलाज करता है, 24 घंटे के बाद मीडिया को ताज़ा करता है।
    4. कोशिकाओं को 1x DPBS से धोएं और उन्हें RT पर 20 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ ठीक करें। 1x DPBS के साथ एक बार फिर धोएं और नमूने को 4 °C पर स्टोर करें, DPBS के 200 μL में डुबोएं।
    5. वैकल्पिक: यदि वांछित हो, तो केवल उप-आरपीई लिपिड जमाव दिखाने के लिए प्लेट से कोशिकाओं को हटा दें।
      1. कोशिकाओं को निष्क्रिय करने और केवल लिपिड जमा छोड़ने के लिए, मीडिया को हटा दें और प्रत्येक कुएं में 200 μL विआयनीकृत पानी जोड़ें।
      2. 10-15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, कोशिकाओं को हटाने तक ऊपर और नीचे पिपेट करें। एक बार फिर 200 μL विआयनीकृत पानी से धोएं और तुरंत 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
      3. होचस्ट का उपयोग करके परमाणु धुंधलापन के साथ सेल हटाने की प्रभावकारिता की पुष्टि करें। 1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए), 0.5% ट्वीन 20 और 0.5% ट्राइटन-एक्स 100 युक्त 1x डीपीबीएस समाधान में 1: 2000 पर होचस्ट को पतला करें। अंधेरे में 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, 1x DPBS से धो लें।
  2. आईआरपीई पर फोटोरिसेप्टर बाहरी खंड (पीओएस) उपचार
    1. पीओएस की तैयारी
      1. -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से पीओएस गोली ट्यूब निकालें और एक ढकी हुई बर्फ की बाल्टी में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पिघलाएं।
      2. डबल-विआयनीकृत एच 2 ओ (डीडीएच2ओ) के 40 एमएल में 10 ग्राम सुक्रोज मिलाकर पीओएस वॉशबफर तैयार करें।
      3. 15 मिनट के लिए धीरे से हिलाते हुए मिश्रण को 40-50 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। मिश्रण में 840 मिलीग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट जोड़ें और 10 मिनट के लिए गर्म करते समय हिलाएं।
      4. पीओएस वॉश बफर की कुल मात्रा को डीडीएच2ओ के साथ 100 एमएल तक समायोजित करें और आवश्यकतानुसार 1 एन एचसीएल या 1 एन एनएओएच के साथ समाधान के पीएच को 8.3 पर समायोजित करें। 0.22 μm फ़िल्टर का उपयोग कर वॉश समाधान फ़िल्टर करें।
        नोट: प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है; पीओएस वॉश बफर को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      5. एक बार पिघलने के बाद, गोली को 15 मिलीलीटर पीओएस वॉश बफर में निलंबित कर दें। पीओएस अखंडता सुनिश्चित करने के लिए पेलेट निलंबन के दौरान सौम्य रहें। 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 600 x g पर पीओएस निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और फिर सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें।
      6. पीओएस वॉश बफर के 10 एमएल में पीओएस गोली को फिर से निलंबित करें।
      7. POS + POS वॉश बफर (POS समाधान) का 100 μL एलिकोट निकालें और 1x DPBS के 400 μL में पतला करें। बैक्टीरियल और फंगल दूषित पदार्थों की जांच के लिए रक्त आगर प्लेट और एक अगारोस प्लेट पर पतला पीओएस समाधान के 50 μL फैलाएं। प्रत्येक के लिए सकारात्मक नियंत्रण तैयार करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए सभी प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
      8. माइकोप्लाज्मा के परीक्षण के लिए अच्छी तरह से पता लगाने के लिए पीओएस समाधान के 1 μL जोड़कर एक क्यूपीसीआर परख करें। डीएनए टुकड़ों को बढ़ाने के लिए, विकृतीकरण के 40 चक्र (95 डिग्री सेल्सियस, 15 एस), और एनीलिंग और बढ़ाव (60 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट) करें। पीओएस नमूने में माइकोप्लाज्मा का पता लगाने के लिए फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर निम्नानुसार हैं:
        फॉरवर्ड प्राइमर: जीजीए टीटीए जीएटी एसीसी सीटीजी जीटीसी सीएसी जी
        रिवर्स प्राइमर: सीजीटी सीएए टीटीसी सीटीटी टीए जीटीटी टीसीए सीटीसी टीटीजी जीसी
      9. आवश्यकता के अनुसार सेल विश्लेषक और एलिकोट का उपयोग करके पीओएस एकाग्रता को मापें। आरपीई कोशिकाओं के साथ 96 अच्छी प्लेटों के एक कुएं के लिए, 3 x 106 पीओएस पर्याप्त है। वांछित अनुपात 10 पीओएस / आरपीई सेल है। भविष्य में उपयोग के लिए एलिकोट को 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. कोशिकाओं में पीओएस को जोड़ना
      1. बर्फ स्नान में पीओएस की शीशियों को पिघलाएं।
      2. तैयार पीओएस की गणना की गई मात्रा को आरपीई-एमएम के साथ मिलाएं और 7 दिनों के लिए रोजाना एक बार पीओएस के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।
        नोट: दैनिक पीओएस समाधान ताजा तैयार करें।
      3. कोशिकाओं को 1x DPBS से धोएं और फिर उन्हें RT पर 20 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ ठीक करें। DPBS के साथ एक बार फिर धोएं और 4 °C पर नमूने स्टोर करें, DPBS के 200 μL में डुबोएं।

5. उप-आरपीई जमा के लिए धुंधलापन

  1. नील लाल धुंधला प्रोटोकॉल
    1. पीएफए निर्धारण के बाद, नमूने को 1x DPBS के साथ 3 बार धोएं।
      नोट: यदि तुरंत उपयोग नहीं किया जाता है, तो प्रोटोकॉल को यहां रोका जा सकता है, लेकिन नमूने 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x DPBS + 0.02% सोडियम एज़ाइड समाधान में संग्रहीत किया जाना चाहिए।
    2. नील लाल स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए, नील लाल पाउडर को एसीटोन में 3 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता पर घोलें। आवधिक मिश्रण के साथ आरटी पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। घोल में शेष अवक्षेप के स्तर के आधार पर घोल को एक या दो बार 0.22 μm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें।
      नोट: स्टॉक समाधान को प्रकाश से सुरक्षित रखें।
    3. कार्यशील समाधान तैयार करने के लिए, स्टॉक समाधान को 1x DPBS में 1:500 के अनुपात में पतला करें। एक शेकर पर आरटी पर 30 मिनट के लिए नमूने में काम करने वाले समाधान के 200 μL जोड़ें और इसे प्रकाश से बचाएं।
    4. 1x PBS के साथ 3 बार धोएं और नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, डीपीबीएस के 200 μL में डुबोएं।
      नोट: यदि 96-वेल प्लेट के बजाय ट्रांसवेल पर एक प्रयोग किया जाता है, तो नमूने को माउंटिंग मीडिया के साथ एक स्लाइड पर रखा जा सकता है, ग्लास कवरस्लिप के साथ कवर किया जा सकता है, और पारदर्शी नेल पॉलिश के साथ सील किया जा सकता है। कोशिकाओं के सामने नमूने को माउंट करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।
  2. BODIPY धुंधला प्रोटोकॉल
    1. स्टॉक समाधान के लिए, 3.8 एमएम की स्टॉक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए निर्जल डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में बीओडीआईपीवाई को घोलें।
    2. पीएफए निश्चित नमूनों के लिए, 1x डीपीबीएस में 1:300 पर बीओडीआईपीवाई स्टॉक को पतला करें। कोशिकाओं में 200 μL जोड़ें और आरटी में एक रॉकर पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    3. 1x DPBS के साथ 3 बार धोएं और नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, डीपीबीएस के 200 μL में डुबोएं।
      नोट: यदि 96-वेल प्लेट के बजाय ट्रांसवेल पर एक प्रयोग किया जाता है, तो नमूने को माउंटिंग मीडिया के साथ एक स्लाइड पर रखा जा सकता है, ग्लास कवरस्लिप के साथ कवर किया जा सकता है, और पारदर्शी नेल पॉलिश के साथ सील किया जा सकता है। कोशिकाओं के सामने नमूने को माउंट करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।
  3. एपीओई इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल
    1. एक बफर समाधान बनाने के लिए 1x DPBS को 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), 0.5% ट्वीन 20 और 0.5% ट्राइटन-एक्स 100 के साथ मिलाएं।
    2. पीएफए निश्चित नमूनों के लिए, आरटी पर 1 घंटे के लिए बफर समाधान के 200 μL में नमूने को ब्लॉक और परमेबिलाइज करें।
    3. बफर समाधान में 1:100 पर पतला एपीओई प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और आरटी पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    4. अगले दिन, 1x DPBS के साथ नमूने को 3 बार धोएं।
    5. बफर समाधान में 1:1000 कमजोर पड़ने पर एक द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें और आरटी पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं में 200 μL समाधान जोड़ें।
    6. 1x DPBS के साथ 3 बार धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें, DPBS के 200 μL में डूबे हुए।
      नोट: यदि 96-वेल प्लेट के बजाय ट्रांसवेल पर एक प्रयोग किया जाता है, तो नमूने को माउंटिंग मीडिया (फ्लोरोमाउंट) के साथ एक स्लाइड पर रखा जा सकता है, ग्लास कवरस्लिप के साथ कवर किया जा सकता है, और पारदर्शी नेल पॉलिश के साथ सील किया जा सकता है। कोशिकाओं के सामने नमूने को माउंट करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।

6. छवि स्वचालन और प्रसंस्करण

  1. स्वचालित छवि स्कैन
    नोट: इस अध्ययन में ज़ीस एलएसएम 800 इनवर्टेड कॉन्फोकल स्कैनिंग माइक्रोस्कोप और ज़ेन 3.2 (ब्लू संस्करण) सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था। सुनिश्चित करें कि 96-वेल प्लेट को इमेजिंग से पहले कम से कम 60 मिनट के लिए आरटी में गर्म किया जाता है ताकि तापमान परिवर्तन के साथ माध्यम के अपवर्तक सूचकांक में बदलाव के कारण स्कैन के दौरान फोकल प्लेन बहाव से बचा जा सके।
    1. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप और 40x उद्देश्य का उपयोग करके, उपयोग किए गए लिपिड मार्कर और किसी भी अतिरिक्त एंटीबॉडी के लिए उपयुक्त फ्लोरोसेंट चैनलों के साथ एक स्कैन प्रोफ़ाइल बनाएं।
    2. छवि स्वचालन सेट करने के लिए टाइल्स चेकबॉक्स का उपयोग करें। 96-वेल प्लेट को कैलिब्रेट करने के लिए, सुनिश्चित करें कि सही नमूना वाहक माप दर्ज और चयनित हैं। फिर, निर्देशों के अनुसार प्लेट को कैलिब्रेट करने के लिए कैलिब्रेट बटन पर क्लिक करें, जिसके लिए 10x उद्देश्य का उपयोग करने की आवश्यकता होती है।
    3. उपयुक्त कुओं का चयन करने के लिए उन्नत सेटअप दृश्य चुनें और स्थिति फ़ंक्शन का उपयोग करके कुएं के केंद्र के पास 3 अलग-अलग इमेजिंग बिंदु जोड़ें। यह स्थिति सबटैब के तहत मैन्युअल रूप से या यादृच्छिक रूप से स्थिति सेटअप टैब का उपयोग करके और कैरियर द्वारा सेटअप का चयन करके किया जा सकता है। एक ही धुंधला पन के सभी कुओं के लिए दोहराएं।
    4. स्वचालन के दौरान इष्टतम फ़ोकस और जेड-स्टैक पोजिशनिंग के लिए, टाइल्स सेटअप द्वारा परिभाषित फ़ोकस सरफ़ेस/जेड मानों का उपयोग करें का चयन करने के लिए फ़ोकस रणनीति टैब पर जाएँ। वैकल्पिक विधियाँ अन्य फ़ोकस रणनीतियों का उपयोग कर सकती हैं, लेकिन सबसे सुसंगत परिणामों के लिए इस सेटिंग का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है।
    5. टाइल्स टैब के अंतर्गत, स्थिति सत्यापित करें क्लिक करें और मैन्युअल रूप से प्रत्येक स्थिति के लिए केंद्रीय Z विमान सेट करें। विकल्प सबटैब में सेटिंग्स छवियों के अधिग्रहण का आदेश देगी, इसलिए छवि शुरू करने से पहले इसे जांचें। पदों के चयन के क्रम में छवियों को प्राप्त करने के लिए, टाइल क्षेत्रों / पदों और कैरियर वेल्स / कंटेनर चेकबॉक्स का चयन करें। छवि प्रसंस्करण में आसानी के लिए अलग-अलग फ़ाइलों में विभाजित दृश्यों का चयन करें।
    6. सुनिश्चित करें कि जेड-स्टैक टैब केंद्र पर सेट है, उपयोगकर्ता की प्राथमिकताओं के लिए एक सीमा इनपुट की जाती है, और स्लाइस अंतराल सेट करने के लिए इष्टतम बटन का चयन किया जाता है।
    7. अधिग्रहण मोड, चैनल, फोकस रणनीति, जेड-स्टैक और टाइल्स टैब को अनुकूलित करने के बाद, प्रयोग शुरू करें।
  2. छवि संसाधन
    1. बैच इमेज प्रोसेसिंग विधि का उपयोग करके, फोकस विधि की विस्तारित गहराई के साथ प्रत्येक जेड-स्टैक के अधिकतम अनुमान बनाएं।
    2. बैच छवि प्रसंस्करण विधि का उपयोग करके, अधिकतम प्रक्षेपण फ़ाइलों को 16-बिट TIFF छवियों के रूप में निर्यात करें। संपीड़न को कोई नहीं पर सेट करें और सुनिश्चित करें कि मूल डेटा की जाँच की गई है। परिणामी छवि केवल प्रतिदीप्ति चैनल का अधिकतम प्रक्षेपण ग्रेस्केल टीआईएफएफ होना चाहिए जिस पर लिपिड मार्कर व्यक्त किया जाता है।

7. विभाजन और परिमाणीकरण

नोट: लिपिडयूनेट कार्यक्रम को 96-वेल प्लेट से 40x छवियों पर प्रशिक्षित किया गया था। 40x उद्देश्य का उपयोग करके प्राप्त की गई छवियों का उपयोग करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।

  1. लिपिडयूनेट सॉफ्टवेयर स्थापित करें। लिपिडयूनेट को निम्नलिखित GitHub रिपॉजिटरी से डाउनलोड किया जा सकता है: https://github.com/RPEGoogleMap/LipidUNet
  2. नील रेड, बोडिपी, या एपीओई का प्रतिनिधित्व करने वाली टीआईएफएफ छवियों की पहचान करें और उपयोग की जा रही विधि के आधार पर उन्हें Nile_Red, बोडिपी, या एपीओई नामक निर्देशिका के भीतर आईएमजी नामक फ़ोल्डर में ले जाएं।
    नोट: निर्देशिकाओं को पहचानने के लिए लिपिडयूनेट कार्यक्रम के लिए सटीक नामकरण सम्मेलनों का उपयोग किया जाना चाहिए।
  3. लिपिडयूनेट सॉफ्टवेयर खोलें (चित्रा 4)।
  4. सॉफ़्टवेयर के पूर्वानुमान टैब में, एलिप्सिस पर क्लिक करके और नामित निर्देशिका पर नेविगेट करके प्रासंगिक निर्देशिका (Nile_Red, Bodipy, या APOE) का चयन करें। पुष्टि करें कि लिपिडयूनेट प्रोग्राम ने कक्षा प्रविष्टि की जांच करके छवियों को सही ढंग से पहचाना है।
  5. 0.01 और 0.99 के बीच एल्गोरिथ्म के लिए संभाव्यता सीमा का चयन करें। एक उच्च मूल्य अधिक झूठी सकारात्मकता को समाप्त कर देगा, लेकिन अधिक झूठे नकारात्मक का कारण बन सकता है, और कम मूल्य अधिक झूठे नकारात्मक को समाप्त करते हुए अधिक झूठे सकारात्मक पेश कर सकते हैं। 0.65 का मान डिफ़ॉल्ट है और अनुशंसित है.
  6. भविष्यवाणी पर क्लिक करें.
    नोट: सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से सभी छवियों के माध्यम से पुनरावृत्ति करेगा और चयनित निर्देशिका में predicted_masks नामक एक नया फ़ोल्डर बनाएगा।
  7. उत्पन्न मास्क के माध्यम से पुनरावर्तन करने के लिए एक मास्क विश्लेषण उपकरण का उपयोग करें और मास्क छवियों से थ्रेशोल्ड लिपिड जमा की मात्रात्मक गणना प्रदान करें।
  8. उपचार की स्थिति की तुलना करने के लिए उत्पन्न गणना डेटा का विश्लेषण करें।

Figure 4
चित्र 4: लिपिडयूनेट उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस। लिपिडयूनेट सॉफ्टवेयर में प्रशिक्षण डेटा निर्देशिका के लिए चयन करने के लिए अलग-अलग खंड हैं, जहां लिपिड जमा की छवियों को सही ढंग से पहचाना गया है; मॉडल वजन निर्देशिका, जो प्रशिक्षण डेटा से निर्मित होती है; और भविष्यवाणी डेटा निर्देशिका जिसमें उपयोगकर्ता विभाजन के लिए अपनी छवियों को इनपुट करेगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Representative Results

यह प्रोटोकॉल नाइल रेड, बीओडीआईपीवाई और एपीओई द्वारा दाग वाले लिपिड जमा की पहचान करने के लिए एक वर्कफ़्लो प्रदान करता है। विकसित सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से लिपिड जमा की पहचान और मात्रा निर्धारित कर सकता है और उल्लिखित प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने पर सबसे अच्छा प्रदर्शन करता है। इसमें सफलतापूर्वक विभेदित आरपीई (चित्रा 3 ए) और खराब विभेदित आरपीई (चित्रा 3 बी) के उदाहरण शामिल हैं, क्योंकि सेल मॉडल की गुणवत्ता उचित छवि विभाजन की गुणवत्ता को बहुत प्रभावित करती है।

प्रोटोकॉल में वर्णित तीन मार्करों में से दो, नाइल रेड और बीओडीआईपीवाई, को छोटे परिपत्र बिंदुओं के रूप में पहचाना जाता है जो फ्लोरोसेंट छवियों (चित्रा 5 और चित्रा 6) में विशिष्ट रूप से उज्ज्वल हैं। प्रोटोकॉल से एक "सकारात्मक" छवि इन अलग-अलग जमाओं (चित्रा 5 ए-डी और चित्रा 5 ई-एच) की उचित पहचान होगी। एक "नकारात्मक" परिणाम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को जमा के रूप में गलत समझकर छवि का गलत विभाजन दिखाएगा, या तो कमजोर धुंधलापन (चित्रा 6 ए-सी और चित्रा 6 डी-एफ) के कारण या उच्च पृष्ठभूमि तीव्रता (चित्रा 6 जी-आई) के कारण।

एपीओई जमा में विभिन्न प्रकार के आकार और आकार होते हैं, जो नील लाल और बीओडीआईपीवाई के गोलाकार जमा के बजाय अधिक अंडाकार या अनियमित दिखाई देते हैं। ये जमा भी कम कठोर होते हैं, और नमूने के परमेबिलाइजेशन में भिन्नता के कारण जमा के बीच सिग्नल की तीव्रता भिन्न हो सकती है। सही पहचान प्रत्येक जमा की पहचान करेगी, जिसमें वे भी शामिल हैं जो कम संतृप्त हैं (चित्रा 5I-L), जबकि गलत विभाजन इन जमाओं को नहीं उठाएगा (चित्रा 6J-L)। इसलिए, कठोर भिन्नता से बचने के लिए धुंधला और इमेजिंग विधियों को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। ऐसा करने का एक तरीका इम्यूनोस्टेनिंग के दौरान नमूना परमेबिलाइजेशन चरणों पर सावधानीपूर्वक ध्यान देना है। फ्लोरोसेंट सिग्नल को अनुकूलित करने के लिए, एपीओई के लिए निर्धारण और इम्यूनोस्टेनिंग से पहले कोशिकाओं को लाइसिस किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप एपीओई जमा का संतृप्ति और बेहतर विभाजन होता है।

96 वेल प्लेट के अलावा एक संस्कृति मंच पर परिपक्व कोशिकाओं की खंडित छवियां भी प्रदान की जाती हैं। लिपिडयूनेट सॉफ्टवेयर को ट्रांसवेल पर सुसंस्कृत कोशिकाओं की छवियों पर चलाया गया था, और जबकि लिपिड जमा को दहलीज किया जाता है, तो ट्रांसवेल झिल्ली में छिद्र भी होते हैं (चित्रा 6 एम-ओ)। आकार और आकार में समानता के कारण, लिपिडयूनेट सॉफ्टवेयर अपने वर्तमान रूप में लिपिड जमा और ट्रांसवेल छिद्रों दोनों को अंधाधुंध रूप से मुखौटा करेगा।

Figure 5
चित्र 5: प्रतिनिधि परिणाम। (ए, ई, आई) 96-अच्छी तरह से प्लेटेड आरपीई होचस्ट परमाणु धुंधलापन (नीला) और या तो नील लाल (मैजेंटा), बीओडीआईपीवाई (हरा), या एपीओई (नारंगी) से सना हुआ है और जेड-स्टैक के अधिकतम तीव्रता अनुमान हैं। (बी, एफ, जे) छवि प्रसंस्करण के बाद लिपिडयूनेट सॉफ्टवेयर के लिए ग्रेस्केल इनपुट छवियां। (सी, जी, के) लिपिडयूनेट द्वारा उत्पन्न मास्क, जहां सभी जमा सही ढंग से पहचाने जाते हैं। (डी, एच, एल) प्रत्येक नकाबपोश कण की रूपरेखा क्रमांकित है। ये लेबल छवि में प्रत्येक कण को कच्चे डेटा के साथ स्प्रेडहाइट में एक प्रविष्टि से जोड़ने की अनुमति देते हैं। (ए-डी) नील लाल धुंधलापन दिखाता है, और सॉफ्टवेयर कमजोर संकेत के बावजूद पृष्ठभूमि के खिलाफ जमा को सटीक रूप से पहचानने में सक्षम है। (ई-एच) बीओडीआईपीवाई सिग्नल और पृष्ठभूमि के बीच एक मजबूत अंतर दिखाता है, जो आदर्श है। लिपिडयूनेट छवि में हर जमा को सही ढंग से पहचानता है। (आई-एल) एक मजबूत एपीओई संकेत दिखाता है और सिग्नल संतृप्ति की परिवर्तनशीलता का प्रतिनिधित्व करता है जो अक्सर इस दाग के साथ देखा जाता है। बहरहाल, छवि विभाजन प्रत्येक एपीओई जमा की सीमाओं की पहचान करने में सक्षम है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: उप-मानक परिणाम। (ए, डी, जी, जे, एम) 96-अच्छी तरह से प्लेटेड आरपीई होचस्ट परमाणु धुंधलापन (नीला) और या तो नील लाल (मैजेंटा), बीओडीआईपीवाई (हरा), या एपीओई (नारंगी) से सना हुआ है और जेड-स्टैक के अधिकतम तीव्रता अनुमान हैं। (बी, ई, एच, के, एन) छवि प्रसंस्करण के बाद लिपिडयूनेट सॉफ्टवेयर के लिए ग्रेस्केल इनपुट छवियां। (सी, एफ, आई, एल, ओ) लिपिडयूनेट द्वारा उत्पन्न गलत मास्क। लाल घेरे इंगित करते हैं कि सॉफ्टवेयर ने गलत तरीके से लिपिड जमा की पहचान की है। (A-C) नाइल रेड प्रोसेसिंग गलत है क्योंकि सॉफ्टवेयर ने पृष्ठभूमि धुंधला होने को जमा के रूप में पहचाना है। यह अधिक बार हो सकता है जब छवि में उच्च पृष्ठभूमि लेकिन कुछ लिपिड जमा होते हैं। BODIPY धुंधला होने के दो उदाहरण दिखाए गए हैं: (D-F) कमजोर BODIPY धुंधला होने के कारण एक खराब गुणवत्ता वाली छवि और (G - I) उच्च पृष्ठभूमि के साथ एक मजबूत BODIPY संकेत। दोनों मामलों में, सॉफ्टवेयर नाभिक के आसपास की पृष्ठभूमि परिपत्र अंगूठी से छोटे, गोलाकार लिपिड जमा को अलग करने में असमर्थ है। जबकि इन त्रुटियों से बचने के लिए धुंधला और इमेजिंग को अनुकूलित किया जाना चाहिए, लिपिडयूनेट का सबसे हालिया संस्करण इन छवियों के लिए काफी हद तक सुधार किया गया है। (J-L) गलत एपीओई विभाजन। चूंकि जमा सिग्नल के आकार और संतृप्ति में अधिक परिवर्तनशील हैं, इसलिए सॉफ्टवेयर को कुछ जमा को पहचानने में कठिनाई होती है। (M-O) आरपीई को एक ट्रांसवेल पर बोया गया और नील लाल रंग से दाग दिया गया। जेड-स्टैक का एक टुकड़ा यहां नाइल रेड लिपिड जमा और ट्रांसवेल छिद्र दोनों के साथ दिखाया गया है। सॉफ्टवेयर दोनों के बीच अंतर करने में असमर्थ है, जैसा कि ट्रांसवेल छिद्रों वाले लाल सर्कल और नील लाल जमा की ओर इशारा करने वाले हरे तीर द्वारा दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: मुखौटा उपकरण तुलना । (ए, बी, सी) लिपिड जमाव की परिवर्तनीय मात्रा के साथ 96-अच्छी तरह से प्लेटेड आरपीई को नाइल रेड (लाल) के साथ पहचाना जाता है। छवियों को तीन अलग-अलग सामान्य मास्किंग विधियों, फाइंड मैक्सिमा, मैक्स एन्ट्रॉपी और रेनी एन्ट्रॉपी का उपयोग करके मास्क किया जाता है, और लिपिडयूनेट-जेनरेटेड मास्क की तुलना में। मूल छवि लिपिड जमा की एक मैनुअल गिनती के साथ है, जबकि मास्क प्रत्येक विभाजन विधि द्वारा अनुमानित गणना प्रदर्शित करते हैं। निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके विभाजन की प्रत्येक विधि के लिए औसत त्रुटि दर की गणना की गई थी: माध्य[(|अनुमानित गणना - मैनुअल गिनती |/मैनुअल गिनती) x 100]। लिपिडयूनेट-जनित मास्क अन्य मास्किंग विधियों की तुलना में परिवर्तनीय जमाव के साथ छवियों में लिपिड जमा की अधिक सटीक पहचान करता है (औसत त्रुटि दर: 23% लिपिडयूनेट, 1164% फाइंड मैक्सिमा, 851% मैक्स एन्ट्रॉपी, 203% रेनी एन्ट्रॉपी)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

घटक बिल्ली का नंबर स्टॉक शंख। अंतिम शंख। मिलीलीटर
एमईएम अल्फा; 12571-063 ना 500
N2 पूरक 17502-048 ना 1% 5
हीट इनएक्टिवेटेड एफबीएस SH30071.03 ना 5% 25
एनएमईएम एनईएए 11140-050 10 mM 0.01 mM 5
सोडियम पाइरूवेट 11360-070 100 mM 1 mM 5
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 15140-122 10000u/mL 100U/mL 5
टॉरिन T4571 50mg/mL 250ug/mL 2.5
हाइड्रोकार्टिसोन H6909 18.1 mg/L 20ug/L 0.553
T3 T5516 20ug/L 0.013ug/L 0.33
कुल मात्रा, mL 548.383

तालिका 1: आरपीई-एमएम अभिकर्मक संरचना। आरपीई-एमएम के लिए अभिकर्मकों और इष्टतम सांद्रता की एक सूची।

Discussion

यह प्रोटोकॉल अपक्षयी नेत्र रोगों के लिए मोनोजेनिक और पॉलीजेनिक इन विट्रो रोग मॉडल में लिपिड जमा को कुशलतापूर्वक लेबल, छवि और मात्रा निर्धारित करने की एक विधि प्रदान करता है। एआई-आधारित सॉफ्टवेयर, लिपिडयूनेट, को तीन सामान्य लिपिड मार्करों, एपीओई, नाइल रेड और बीओडीआईपीवाई पर लागू किया जा सकता है, और विश्लेषण के लिए एक तेज़, स्वचालित विधि प्रदान करता है जो परिमाणीकरण को मानक और निष्पक्ष होने की अनुमति देता है।

लिपिडयूनेट की मुख्य सीमा यह तथ्य है कि एआई के लिए प्रशिक्षण डेटासेट 96-वेल प्लेट में संवर्धित कोशिकाओं की 40x आवर्धन छवियों तक सीमित था। प्रशिक्षण छवि सेट के परिणामस्वरूप, लिपिडयूनेट, अपने वर्तमान रूप में, 40x आवर्धन छवियों का विश्लेषण करने तक सीमित है। सॉफ्टवेयर का उपयोग 96 वेल प्लेट के अलावा अन्य संस्कृति सतहों पर सुसंस्कृत कोशिकाओं की 40x छवियों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन सॉफ्टवेयर द्वारा सटीक थ्रेशोल्डिंग को सत्यापित करने के लिए उत्पन्न आउटपुट मास्क की जांच करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। अधिक छवि सेट (विभिन्न आवर्धन पर) की आवश्यकता होगी ताकि उन नमूनों / छवियों के दायरे का विस्तार किया जा सके जो इसका विश्लेषण कर सकते हैं।

प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। लिपिड मार्कर चरण में, उपयोगकर्ता को यह पुष्टि करनी चाहिए कि उनके चुने हुए लेबलिंग यौगिक (बीओडीआईपीवाई, एपीओई, नाइल रेड) ने अपने नमूने को प्रभावी ढंग से लेबल किया है। परिपक्व आरपीई कोशिकाएं अक्सर भारी रंजित होती हैं, जो एंटीबॉडी इम्यूनोस्टेनिंग के फ्लोरोसेंट सिग्नल को खराब कर सकती हैं। जब प्रतिदीप्ति संकेत कमजोर होता है या जब बहुत अधिक पृष्ठभूमि धुंधला होता है, तो लिपिडयूनेट लिपिड बूंदों को सटीक रूप से नहीं समझ सकता है। इसी तरह के कारण से, प्रोटोकॉल के स्वचालित इमेजिंग चरण के लिए ठीक से चयनित अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग किया जाना चाहिए। यदि अधिग्रहित छवियां खराब गुणवत्ता की हैं, तो लिपिडयूनेट छवियों को ठीक से मुखौटा करने के लिए संघर्ष करेगा और इसलिए, परिमाणीकरण गलत होगा (चित्रा 6 ए-एल)। अंत में, छवियों का पोस्ट-प्रोसेसिंग एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि लिपिडयूनेट में सॉफ्टवेयर के काम करने के लिए विशिष्ट आवश्यकताएं हैं।

जब लिपिड विश्लेषण के लिए वर्कफ़्लोज़ की तुलना में जो मैनुअल थ्रेशोल्डिंग का उपयोग करते हैं, या ऐसी तकनीकें जिनमें फिजी जैसे सॉफ़्टवेयर में स्वचालित थ्रेशोल्डिंग शामिल होती है, लिपिडयूनेट परिवर्तनीय लिपिड जमाव के साथ छवियों में एक गैर-पक्षपाती और विश्वसनीय विभाजन प्रदान करता है, जैसा कि लिपिड कणों की पहचान में एक छोटी त्रुटि दर से परिलक्षित होता है (चित्रा 7)। सॉफ्टवेयर अतिरिक्त प्रशिक्षण छवियों के उपयोगकर्ता प्रवेश की अनुमति देता है, जो उन लोगों से परे छवि सेटों के विश्लेषण की अनुमति देता है जो 40x आवर्धन उद्देश्य का उपयोग करते हैं या यहां तक कि जो प्रोटोकॉल में उल्लिखित एक अलग लिपिड मार्कर का उपयोग करते हैं। भविष्य में, सॉफ्टवेयर को 3 डी छवियों का विश्लेषण करने के लिए प्रशिक्षित किया जाएगा ताकि लिपिड जमा मात्रा का ठहराव संभव हो। अपक्षयी नेत्र रोग जो पैथोलॉजी में एक प्रमुख योगदानकर्ता के रूप में लिपिड जमाव को फंसाते हैं, प्रचलित हैं, और मामलों में वृद्धि की भविष्यवाणी की जाती है क्योंकि बुजुर्ग आबादीका विस्तार हो रहा है। सटीक रोग मॉडल और कुशल विश्लेषण उपकरण, जैसा कि हमने इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित किया है, नए चिकित्सीय हस्तक्षेपों के विकास की अनुमति देगा।

Disclosures

कोई खुलासा नहीं।

Acknowledgments

हम ज़ीस कॉन्फोकल सिस्टम के उपयोग के लिए नेशनल आई इंस्टीट्यूट (एनईआई) हिस्टोलॉजी कोर को धन्यवाद देते हैं। यह काम एनईआई आईआरपी फंड (अनुदान संख्या ज़िया ईवाई000533-04) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Steriflip filter system EMD Millipore SCGP00525
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco 14190-144
3,3',5-Triiodo-L-thyronine Sigma T5516
Albumin Bovine, Fraction V MP Biomedical 160069
Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L) Invitrogen A21431 APOE secondary antibody
APOE primary antibody Millipore Sigma AB947
BODIPY 493/503 Invitrogen D3922 Protect from light
Complement competent human serum Millipore Sigma S1-LITER
CTS N2 Supplement Life Technologies A13707-01
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01 Slide mounting media
Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm Electron Microscopy Sciences 72204-01
Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick Electron Microscopy Sciences 71870-01
Hydrocortisone Sigma H0396
MEM Alpha Life Technologies 12571-063
MEM non-essential Amino Acids Life Technologies 11140
Nile Red Sigma 72485-100MG Protect from light
Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin-Strep Life Technologies 15140-148
Phosphate Buffered Saline 10x Gibco 70011-044
Rod Outer Segments (OS) InVision Bioresources 98740
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Sodium Pyruvate Life Technologies 11360-070
Sucrose Sigma Aldrich S1888
SYBR Green Master Mix Bio-Rad 1725274
Taurine Sigma T0625
Triton X-100 Sigma 9002-93-1
Tween 20 Ultrapure Affymetrix 9005-64-5
Vitronectin Life Technologies A14701SA
Y-27632 dihydrochloride R&D Systems 1254

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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जीव विज्ञान अंक 197
आईपीएससी-व्युत्पन्न रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम का उपयोग करके लिपिड जमा के लक्षण वर्णन और परिमाणीकरण की लिपिडयूनेट-मशीन लर्निंग-आधारित विधि
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Esh, Z., Suresh, S., Ortolan, D.,… More

Esh, Z., Suresh, S., Ortolan, D., Farnoodian, M., Bose, D., Ryu, J., Volkov, A., Bharti, K., Sharma, R. LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (197), e65503, doi:10.3791/65503 (2023).

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