Summary
本研究では、ラベルフリーの生細胞バイオイメージングを示し、2つの細菌株を検出するために、良好な生体適合性を有する低コストの表面増強ラマン散乱(SERS)ベースの指紋ナノプローブを開発し、非破壊法で生細胞のSERSスペクトルを取得する方法を詳細に示した。
Abstract
表面増強ラマン散乱(SERS)技術は、生体試料の分子フィンガープリント情報を提供できることや、シングルセル解析の可能性から、生物医学分野でますます注目を集めています。この研究は、Au@carbonドットナノプローブ(Au@CDs)に基づくラベルフリーSERSバイオアナリシスのための簡単な戦略を確立することを目的としています。ここでは、ポリフェノール由来のCDを還元剤として利用してコアシェルAu@CDナノ構造を迅速に合成し、協同ラマン増強機構により、メチレンブルー(MB)の濃度が10〜9 Mと低い場合でも強力なSERS性能を実現します。バイオ分析のために、Au@CDsは、バイオサンプルの細胞成分(例えば、癌細胞および細菌)を識別するためのユニークなSERSナノセンサーとして機能することができる。異なる種の分子フィンガープリントは、主成分分析との組み合わせ後にさらに区別することができます。さらに、Au@CDsは、細胞内組成プロファイルを分析するためのラベルフリーSERSイメージングも可能にします。この戦略は、実行可能なラベルフリーのSERSバイオアナリシスを提供し、ナノ診断の新たな展望を開きます。
Introduction
単一細胞解析は、細胞の不均一性を明らかにし、細胞の包括的な状態を評価する研究に不可欠です。微小環境に対する細胞の即時応答も、単一細胞解析を保証します1。ただし、現在の手法にはいくつかの制限があります。蛍光検出はシングルセル解析にも適用できますが、感度が低いという制約があります。他の課題は、細胞の複雑な蛍光バックグラウンドと長期照射下での蛍光光退色から生じます2。表面増強ラマン散乱(SERS)は、(1)固有の分子フィンガープリント情報と瞬間的な状況を反映する、(2)超高表面感度、(3)便利なマルチプレックス検出、(4)高い光安定性、(5)比較分析のために検出を定量できる、(6)NIR波長励起による細胞自家蛍光の回避、(7)検出は細胞水溶液で実行できる、などの利点があるため、単一細胞分析の観点から適格である可能性があります環境、および(8)検出は、細胞3、4、5内の特定の領域に向けることができる。
SERSを基本的な現象として理解するために広く認識されている2つのメカニズムがあります:支配的な理由としての電磁増強(EM)と化学的増強(CM)。EMとは、励起場の所定の周波数において、入射光の周波数が金属内で振動する自由電子の周波数と一致し、表面プラズモン共鳴(SPR)を引き起こすときに、電磁波によって駆動される集合電子の振動を指します。局在SPR(LSPR)が金属ナノ粒子(NP)に衝突する入射レーザーを介して発生すると、入射光の共鳴吸収または散乱につながります。その結果、金属NPの表面電磁界強度を2〜5桁向上させることができます4。ただし、SERSの大幅な強化の鍵は、単一の金属NPではなく、ホットスポットを作成する2つのNP間のギャップです。CMは、(1)標的分子と金属NPとの相互作用、(2)標的分子が金属NP4,5との間で電子を移動できることの2つの側面から生成されます。より網羅的な詳細は、これらのレビュー記事4,5に記載されています。生細胞におけるSERSバイオセンシングおよびイメージングのためのいくつかの有望な方法が以前の文献に提示されており、例えば、アポトーシス細胞6、細胞小器官7におけるタンパク質7、細胞内miRNAX8、細胞脂質膜9、サイトカイン10、および生細胞における代謝産物11の検出、ならびに共焦点SERSイメージング2による細胞の同定およびモニタリング、 11、12、13。興味深いことに、ラベルフリーSERSは、内部分子スペクトル5を記述できるSERSのユニークな利点を提供します。
ラベルフリーSERSの大きな問題は、合理的で信頼性の高い基質です。典型的なSERS基板は、多くの光を散乱させる優れた能力があるため、貴金属NPです14。今日では、その顕著な物理的および化学的特性および生体適合性のために、ナノコンポジットにますます注目が払われている。さらに重要なことに、ナノコンポジットは、ナノハイブリッド上のホットスポットによって誘発される強烈なEMおよび他の非金属材料に由来する追加の化学的増強のために、より良好なSERS活性を示すことができる15。例えば、Feiらは、マウス4T1乳がん細胞(4T1細胞)のラベルフリー近赤外(NIR)SERSイメージングのために、Au NP@MoS 2 QDナノコンポジットを合成するための還元剤としてMoS2量子ドット(QD)を使用しました16。また、Liらは、食品媒介病原菌のラベルフリーSERS測定のために、Au NPsと2Dハフニウムジテルル化物ナノシートからなる2D SERS基板を作製した17。近年、良好な電子供与体であるカーボンドット(CD)が、他の還元体や照射を伴わずに還元体として使用され、Au@carbonドットナノプローブ(Au@CDs)18を合成し、AuコアとCDシェル間の電荷移動(CT)効果に基づいてSERS活性を高める効率的な材料であることが報告されています19,20。それ以上に、CDはキャッピング剤およびAu NPが凝集するのを防ぐための安定剤として認識されています21。さらに、それは多数の結合部位および活性部位を提供することができるので、分析物との反応のためのより多くの可能性を開く20。上記を利用して、Jinらは、不均一な触媒反応をリアルタイムで監視するための独自のSERS特性と優れた触媒活性を備えたAg@CD NPを製造するための高速で制御可能な方法を開発しました18。
ここでは、コアシェルAu@CD SERS基質を作製して細胞成分を同定し、ラベルフリーのSERS生細胞バイオイメージング、ならびに 大腸菌 (大腸菌)と黄色 ブドウ球菌 (黄色ブドウ球菌)を検出および鑑別するための簡単で低コストの方法が実証され、疾患の早期診断と細胞プロセスのより良い理解に有望です。
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Protocol
1. Au@CDsの製作
メモ: 図 1 は、Au@CDsの製造手順を示しています。
- 典型的な水熱処理手順18を介してクエン酸(CA)および没食子酸(GA)を使用してCD溶液を調製する。調製したCD溶液3.0 mL-1 100 μLを10 mM塩化金酸(HAuCl4)200 μL(材料表を参照)に室温で紫色の懸濁液が生成されるまで10秒間加えます。
- 紫色の懸濁液を4,000 × g で室温で10分間遠心分離し、Au@CDコロイドの除去が困難な場合はピペットを使用して上清を静かに除去します。
- Au@CDsを200 μLの脱イオン水(抵抗率18.2 MΩcm)で再懸濁し、余分なCDを洗浄します。
- ステップ1.2を繰り返してコアシェルNPを取得し、100 μLの脱イオン水に再分散し、4°Cで保存します。 NPは1ヶ月間保管することができます。
2. Au@CDsの特性評価
- 透過型電子顕微鏡(TEM)
- CDとAu@CDサンプルを-80°Cで一晩放置して凍結溶液から凍結乾燥し、凍結乾燥後に粉砕して粉末にします。
- 得られた粉末サンプルを超音波処理によって脱イオン水に適切に分散させ、100%の電力で、5分間。
- レーシーカーボンフィルムで覆われたCuコーティングされたTEMグリッドにサンプル懸濁液を数滴下し、200 kVの加速電圧で透過型電子顕微鏡を使用して乾燥後の画像をキャプチャします( 材料表を参照)。
- フーリエ変換赤外分光法(FT-IR)
- ステップ2.1.1を繰り返してパワーサンプルを取得し、事前に乾燥したいくつかのKBr粒子を乳鉢で粉末に粉砕し、サンプルをピンチ追加し、KBr粉末と同時に混合してIR特性評価を行います16。
- 紫外可視近赤外(紫外対近赤外)吸光度分光法
- 吸光度が1未満になるように適切な濃度のCDおよびAu@CDsの懸濁液を調製し、UV-vs-NIRの特性評価を実行します16。
- ラマンスペクトル
- 10 mWのレーザー出力と20倍のオブジェクション倍率で785 nmの半導体レーザーをオンにします。露光時間を 5 秒、累積数を 3 に設定します。
- 等量の調製Au@CDsサンプルを5 μLのメチレンブルー(MB)溶液に加え、十分に混合します。
- 真鍮基板上に懸濁液を一滴垂らして、SERSスペクトルを収集します。
3. 細胞培養
- ヒト上皮肺癌細胞(A549細胞、実験室で継代)を、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で培養し、5%CO2を含む37°Cの加湿インキュベーター内でインキュベートします。
- 細胞を96ウェルプレート(1 × 105 細胞/ウェル)に播種し、20〜100 μMの範囲のさまざまな濃度のAu@CDsで処理します。 CCK-8アッセイキットを使用して、細胞生存率を測定します( 材料表を参照)。各処理では、3つの独立した複製が使用されます。
- SERS実験を実行するには、次の手順に従います。
- 滅菌サファイアチップ( 材料表を参照)を12ウェルプレートに入れ、1 mLの培地を入れたシングルウェルに細胞を播種します。プレートを加湿インキュベーター内で37°C、5%CO2で一晩インキュベートし、70%〜80%のコンフルエントに到達させます。
- Au@CDsを単一のウェルに加え、4〜6時間インキュベートします。
注:インキュベーションの前に、基質、特に溶液相NPの安定性をテストしてください。これらの材料は、保管および使用中の溶解、凝集、および沈降プロセスによる劣化の影響を受けやすく、EM損失が減少し、SERS活性が低下する可能性があります。さらに重要なことに、細胞内取り込みについては、NPs22のサイズに大きく影響される可能性がある。 - インキュベーション中、基質はエンドサイトーシスの取り込みによって細胞に入ります。インキュベーション後、細胞内にいくつかの黒い粒子が見られるまで、光学顕微鏡で細胞を観察します。
注:SERS強度が弱い場合は、Au@CD濃度を高めるか、インキュベーション時間を延長してください。 - 培地を取り出し、サファイアチップをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で穏やかにすすぎ、SERS検出16のためにPBSに浸します。
4. 細胞SERS実験
- コンピューターを開き、ラマン分光計の電源を入れ、ソフトウェアを起動してから、785 nmレーザーの電源を入れます( 材料表を参照)。
- [新しい 測定 ]をクリックして、新しいスペクトル取得を開始します。サンプル測定の前に、シリコンウェーハで17を校正します。
- 鮮明な細胞画像が観察されるように20倍の対物レンズを取り、次に対物レンズを50倍に変更します。レーザー出力を低から高に設定し、適切な露光時間と蓄積を設定します。
注意: SERS測定の前に、適切なレーザー出力をチェックして、不可逆的な細胞の損傷を防ぎ、取得パラメーターが一貫していることを確認してください。SERS強度は、レーザー出力、スポットサイズ、蓄積、および露光時間に関連しています。 - 測定するセルのポイントを選択し、[ 実行]をクリックします。各細胞は20個のスポットで測定され、10個の細胞が測定されて平均が取られます。
注:細胞内成分は複雑であり、広いスペクトル格差につながります。したがって、同様の細胞領域でスペクトルを取得し、できるだけ多くのスペクトルを取得します。 - スペクトルを保存します。
- [新しいストリームライン画像取得]をクリックし、[ビデオレビュー]をクリックして、撮影する範囲を選択し、[OK]をクリックします。パラメータを設定します:785 nmのエッジストリームライン、1,200 cm-1の中心、露光時間5秒、蓄積数3、レーザー出力50%。
- [新しい of Living イメージング] をクリックし、[信号からベースライン] を選択し、最初の制限 625 から 2 番目の制限 1,700 までの範囲を設定して、[エリア設定] をクリックします。次に、適切な手順を設定し、[適用]と[OK]をクリックします。最後に、[実行]をクリックしてSERSイメージングの実行を開始します。
5. 細菌培養とSERS測定
- 大腸菌と黄色ブドウ球菌の一晩培養(1:100)を5 mLの新しいルリアベルターニ(LB)培地で希釈します(材料表を参照)。A600を0.4〜0.6に37°Cで増殖させた後、培養物を5,000 × gで5分間遠心分離し、細胞をペレット化した。
- ペレットを1 mLのPBSに再懸濁した後、5分間5,000 × g の遠心分離(室温)を2回行います。
- 細菌培養物をAu@CDsと混合し、SERSプラットフォームの真下で混合物を観察します。
6.データ分析
- スペクトルを平滑化し、ベースラインを修正します。
- 処理されたデータで主成分分析(PCA)16を実行します。
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Representative Results
Au@CDsの製作を図1に示す。CDは、典型的な熱水プロセスを介してCAおよびGAから調製された18。Au@CDsは、室温で水性媒体中でCDによってHAuCl4を還元することによって迅速に合成された。CDおよびAu@CDsのサイズおよび形態は、TEMおよび高分解能(HR)TEM23によって観察することができる。調製されたCDは、約2〜6 nmの小さなサイズで単分散されています(図2A)。球状のAu核は、約2.1nmのCD殻の層でコーティングされています(図2B、Cおよび 補足図1)。
CDおよびAu@CDsの構造を確認するために、FT-IRスペクトルを記録して有機官能基を分析しました(図2D)。3,000-3,600/2,500-2,800 cm-1、1,251/1,629 cm-1、1,471 cm-1のバンドは、それぞれO-H伸縮振動、C=O伸縮振動、C-O伸縮振動に割り当てることができます24,25。また、1,741cm-1での伸張振動帯はC-C24に関連しています。GAおよびCAからのこれらの官能基のいくつかはCDおよびAu@CDsにも存在し、NPの合成の成功を示唆している。 CDのUV-vis吸収スペクトルは、265nmに特徴的なピークを有し、炭素コア26内の孤立した芳香族構造を示し、還元時に消失する。Au@CDsのスペクトルは、Au核のSPR吸収帯に関連する545 nmに特徴的なピークを示し、複合ナノ構造の作製を示しています(図2E)。
図3A,Bに示すように、MBの濃度が10-9 Mと低い場合でも、Au@CDsはAu NPと比較して優れたSERS性能を示す。増強係数(EF)は、以下の式16により算出することができ、ここで、ISERSおよびI0は、それぞれSERSスペクトルおよび正常ラマンのラマン強度を指し、CSERSおよびC0は、それぞれSERSおよびラマン測定に使用される基質分子の濃度を指す。計算に1,620 cm-1 MBを使用すると、Au@CDsのEFはほぼ2.1 × 105であり、Au NPの約3倍です(6.8 × 104)。
770cm-1(C-Hの面内曲げ)、1,398cm-1(C-Nの対称延伸)、1,625cm-1(C-Cリング延伸)など、いくつかの特徴的なピークが検出され、これは報告文献27と一致している。 同時に、10〜5 M〜10〜9 MのMBが検出され、定量化のために1,620 cm-1のSERSバンドが取得されます。線形関係は、y = 0.2437x + 2.1756(R2 = 0.9922)として定義されます(図3B)。感度に加えて、再現性と長期安定性はどちらもSERS基質の重要な指標です。したがって、SERSスペクトルはランダムに20点で取得され、それらの間で高い類似性を示しました(図3C、D)。1ヶ月間に4つのスペクトルを収集し、MBの特徴的なピークは4°Cで配置後1か月でも検出され、950 cm-1、1,185 cm-1、および1,620 cm-1での平均SERS活性は、それぞれ約5.43%、11.44%、および13.94%の減衰度のみを示し(図3E)、Au@CD基質の良好な再現性と長期安定性を示しました。
本細胞SERS測定では、まず、NPsの細胞毒性を試験した。Au@CDs(20-100μM)は、A549細胞に対してかろうじて細胞毒性を示した(図3F)。以上の結果は、生細胞におけるラベルフリーSERS測定への応用がAu@CDs可能性が高いことを示唆しています。 図4に示すように、Au@CD組み立てられたSERS基質は、800〜1,700 cm-1の細胞成分の統合SERSマッピングを提供します。Au@CD NP凝集体は、A549細胞のSERSマッピングにおいて、ノイズバックグラウンドなしで明らかなSERSシグナルを示すことが観察されています(図4B)。異なる細胞点からの3つのスペクトルを 図4Cに示し、さまざまな細胞質領域における成分の不均一性と、単一細胞分析用のSERSプローブとしてのAu@CDsの優位性を示しています。A549細胞の平均スペクトルを 図4Aに示し、豊富な細胞情報を観察することができます。詳細な特性ピーク割り当てを 表 1に示します。
さらに、Au@CDsは、2つの細菌株を検出および区別する優れた能力も示しています。得られたスペクトルは、1,030 cm-1のフェニルアラニンや741 cm-1の核酸のリング呼吸(図5A、B)など、大腸菌と黄色ブドウ球菌の公開文献と非常によく似ており、SERS測定の信頼性を検証しています28。詳細な特性ピーク割り当て28、29、30、31を表2に示す。PCAモデルもよく識別します(図5C、D)。
図1:Au@CDsの合成経路の模式図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:CDの代表的な特性評価とAu@CDs 。 (A)CDのHRTEM画像。 スケールバー:10 nm。(B)Au@CDsのTEM像。スケールバー:100ナノメートル。(C)Au@CDs界面領域のHRTEM像。スケールバー: 10 nm;挿入図:2ナノメートル。(D)生のGA、CA、および調製されたCDおよびAu@CDsのFT-IRスペクトル。(E)CD、Au NP、およびAu@CDsの紫外可視吸収スペクトル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:Au@CDsのSERS活動。 (A)バルクMB(10-5 M、黒線)および10-9 M MB(青線と緑線)溶液のSERSスペクトル。(B)異なる濃度(10-9-10-5 M)でのMBのSERSスペクトル。挿入: 1,620 cm-1 MB における SERS バンドの線形関係、y = 0.2437x + 2.1756 (R2 = 0.9922)。SERS基質再現性(C)、相対標準偏差(RSD)ヒストグラム(10-7MにおけるMBの1,620cm-1ピーク)(D)、および長期安定性(E)実験の結果。(f)Au@CD濃度勾配でのインキュベーションの24時間後のA549細胞の細胞生存率。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:A549細胞のフィンガープリント解析とラベルフリーSERSイメージング 。 (A)A549細胞の平均SERSスペクトル。(B)明視野、SERSマッピング、およびA549細胞のマージ画像。スケールバー:20 μm。 (C)1、2、および3のマージ画像でマークされた異なる細胞点のSERSスペクトル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:2つの細菌株のフィンガープリント分析。大腸菌(A)と黄色ブドウ球菌(B)の平均SERSスペクトル。2つの細菌株の差分分析に関する2D PCA(C)および3D PCA(D)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:A549細胞のラマンピークの割り当て。 略語:プロ=プロリン;HYP = ヒドロキシプロリン;Tyr=チロシン;Trp = トリポトファン;フェ=フェニルアラニン;A = アデニン;T =チミン;C =シトシン;G =グアニン;曲げ=曲げ;str = ストレッチ;def = 変形;ツイスト=ツイスト;呼吸=呼吸;ワグ=ワギング;sym = 対称;非対称=非対称;BK =バックボーン。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:大腸菌と黄色ブドウ球菌のラマンピークの割り当て。略語:Tyr=チロシン;フェ=フェニルアラニン;A = アデニン;G =グアニン;str = ストレッチ;def = 変形;呼吸=呼吸;sym = 対称。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図1:Au@CDsの動的光散乱研究。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
要約すると、2.1nmの超薄型CDシェルを備えたAu@CDsが正常に製造されました。ナノコンポジットは、純粋なAu NPよりも優れたSERS感度を示します。また、Au@CDs再現性と長期安定性に優れた性能を持っています。さらなる研究には、A549細胞31のSERSイメージングを実行し、2つの細菌株32を検出するための基質としてAu@CDsを取ることが含まれる。Au@CDsは、主にAu NPとCDの間の化学的増強に基づく超高感度SERSプローブとして使用できることが証明されています。
以前のプロトコルのSERS測定中にいくつかの重要なポイントがあります。まず、細胞や細菌サンプルにAu@CDsを適用する前に、優れたSERS基質処方と、色素分子によって検証できる適切な濃度を確保する必要があります。その後、生物学的サンプルは複雑で動的であるため、SERSスペクトルはすべての細胞点で一貫性がありません。
より大きなレーザースポットを撮影する場合、異なる点からのSERSスペクトルはより類似します。注目すべきことに、同じセルラーポイントのSERSスペクトルは、異なるレーザー出力に従わない場合があります。生物学的サンプルの平均SERSスペクトルが一貫していることは広く受け入れられています。したがって、可能な限り同じ細胞領域でSERSスペクトルを取得し、次にいくつかの異なる細胞領域を平均化することが重要です。さらに、細胞内SERSの検出感度はバックグラウンドシグナルの影響を受けやすい。ラマンバックグラウンドシグナルは、主に(1)サファイア、シリコンウェーハなどの基板、(2)SERSプローブ、(3)生物学的サンプルの3つの側面から発生します。したがって、これは困難ですが、可能な限りバックグラウンドノイズのない基板を選択することをお勧めします。
従来のラマン分光法と比較して、SERSは信号強度を数桁33大幅に改善することができます。この研究では、金が複合NPの製造に選ばれたのは、銀よりもサイズと形状を最適化する優れた能力を持ち、細胞毒性が低く、化学的に不活性で堅牢であるためです34。一方、Au表面に付着したCDシェルは、セルと金属NP33との間の相互作用を減少させることができる。結論として、上記の結果は、ラベルフリーSERSが非侵襲的かつ非破壊的な技術であり、単一細胞レベルで分析対象物の固有の化学組成を提供できることを実証しました35。
これまでの研究では、ネイティブ指紋情報の歪みが発生した場合に適切な検出環境と時間を制御することが不可欠であることが示されています5。したがって、信頼性の高いスペクトルを取得するために、細胞に損傷がないことを確認することが不可欠です。その他の課題には、(1)細胞内SERS測定において、SERS活性Au NPがタンパク質、脂質、核酸などの細胞内成分と相互作用する可能性があります4。したがって、生体適合性とSERSシグナルの割り当てを考慮する必要があります。(2)SERS検出中の一定のレーザー曝露は、細胞毒性または生体サンプルを損傷する可能性があります。(3)図5A、Bに示すように、ポータブルSERSプラットフォームにはまだいくつかの制限があります-ラマン強度または検出できる信号のいずれかが図4に示すように良くありません。
加えて、液滴マイクロ流体36、深層学習37、機械学習38、触媒ヘアピン集合増幅技術39、および蛍光技術40などの他の技術と組み合わせると、これらの統合戦略は、SERSの優位性を開発することができる。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(32071399および62175071)、広州科学技術プログラム(2019050001)、広東基礎応用基礎研究財団(2021A1515011988)、および中国教育省(福建師範大学)の医学のための光電子科学技術の主要研究所のオープン財団(JYG2009)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS buffer (Cell culture) | Langeco Technology | BL316A | |
| 6 well cell culture plate | LABSELECT | 11110 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | GLPBIO | GK10001 | |
| Citric acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | C108869 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Constant temperature magnetic agitator | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Cryogenic high speed centrifuge | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| DMEM high glucose cell culture medium | Procell | PM150210 | |
| Electronic balance | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Enzyme marker | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biological Technology | 11011-8611 | |
| Figure 1 | Figdraw. | ||
| Fourier infrared spectrometer | Thermo, America | Nicolet 380 | |
| Freeze dryer | Tecan | Infinite F50 | |
| Gallic acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | G104228 | |
| Handheld Raman spectrometer | OCEANHOOD, Shanghai, China | Uspectral-PLUS | |
| HAuCl4 | Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou) | ||
| High resolution transmission electron microscope | Thermo Fisher Technologies | FEI Tecnai G2 Spirit T12 | |
| High temperature autoclave | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S  |
|
| Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Yongxin Optical | XD-202 | |
| LB Broth BR | Huankai picoorganism | 028320 | |
| Medical ultra-low temperature refrigerator | Thermo Fisher Technologies | ULTS1368 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | ||
| Pancreatin Cell Digestive Solution | beyotime | C0207 | |
| Penicillin streptomycin double resistance | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S |
|
| Pure water meter | Millipore, USA | Milli-Q System | |
| Raman spectrometer | Renishaw | ||
| Sapphire chip | beyotime | ||
| Thermostatic water bath | Changzhou Noki | ||
| Ultra-clean table | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| Uv-visible light absorption spectrometer | MADAPA, China | UV-6100S | |
| Wire 3.4 | Renishaw |
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