Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generering av monocythärledda dendritiska celler med olika sialylerade fenotyper

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65525
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 4,5, 6, 1,2,7
1Associate Laboratory i4HB - Institute for Health and Bioeconomy, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 2UCIBIO - Applied Molecular Biosciences Unit, Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa, 3LAQV and REQUIMTE, Departamento de Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade NOVA de Lisboa, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Oncology, Albert Einstein College of Medicine, 6Stemmatters, Biotecnologia e Medicina Regenerativa SA, Parque de Ciência e Tecnologia Avepark, Zona Industrial da Gandra, 7CDG & Allies - Professionals and Patient Associations International Network (CDG & Allies - PPAIN), Department of Life Sciences, NOVA School of Science and Technology, Universidade NOVA de Lisboa

Summary

Ett unikt, omfattande protokoll för att generera de-sialylerade humana monocyt-härledda dendritiska celler (mo-DC) från isolerade mononukleära celler i perifert blod (PBMC) med hjälp av en sialidasbehandling presenteras. Vidare beskrivs metoder för att bedöma den fenotypiska och funktionella karakteriseringen av mo-DCs och utvärdera hur sialidasbehandling förbättrar mognadsnivån av mo-DCs.

Abstract

Sialinsyror är negativt laddade monosackarider som vanligtvis finns vid cellytans glykaners ändpunkter. På grund av deras hydrofilicitet och biofysiska egenskaper är de involverade i många biologiska processer, såsom modulering av immunsvaret, igenkänning av själv- och icke-självantigener, kolhydrat-proteininteraktioner, etc. Det cellulära innehållet av sialinsyra regleras av sialidas, som katalyserar avlägsnandet av sialinsyrarester. Flera studier har visat att sialo-glykaner är avgörande för att övervaka immunövervakning genom att engagera cis - och transhämmande Siglec-receptorer på immunceller. På samma sätt håller glykoimmuna kontrollpunkter i cancer på att bli viktiga mål för att utveckla immunterapier. Dessutom är dendritiska celler (DC) tänkta som en viktig komponent i immunterapier, särskilt inom cancerforskning, på grund av deras unika roll som professionella antigenpresenterande celler (APC) och deras förmåga att utlösa adaptiva immunsvar och generera immunologiskt minne. DC:s funktion är dock beroende av deras fulla mognad. Omogna DC:er har en motsatt funktion till mogna DC:er och en hög halt av sialinsyra, vilket ytterligare dämpar deras mognadsnivå. Detta nedreglerar förmågan hos omogna DCs att aktivera T-celler, vilket leder till ett försvagat immunsvar. Följaktligen inducerar avlägsnande av sialinsyra från cellytan på humana DCs deras mognad, vilket ökar uttrycket av MHC-molekyler och antigenpresentation. Dessutom kan det återställa uttrycket av co-stimulerande molekyler och IL-12, vilket resulterar i att DCs har en högre förmåga att polarisera T-celler mot en Th1-fenotyp och specifikt aktivera cytotoxiska T-celler för att döda tumörceller. Därför har sialinsyra dykt upp som en nyckelmodulator av DCs och används som ett nytt mål för att främja deras terapeutiska användning. Denna studie ger ett unikt tillvägagångssätt för att behandla in vitro-monocythärledda DC med sialidas, som syftar till att generera DC-populationer med olika cellyte-sialinsyrafenotyper och skräddarsydda mognads- och co-stimulerande profiler.

Introduction

Sialinsyrabärande glykaner (sialoglykaner) har fått stort intresse på grund av deras immunmodulerande roll. Monosackariden sialinsyra, som är vanligast hos människor i form av N-acetylneuraminsyra, presenterar grundläggande ligander för lektiner med en erkänd roll inom immunologi, såsom Selectins och Siglecs. Dessa lektiner känner igen sialoglykaner antingen på samma cell (cis) eller på olika celler (trans) och spelar en viktig roll i värd-patogeninteraktioner och olika fysiologiska och patologiska cellulära aktiviteter 1,2,3. Dessutom, eftersom sialinsyra upptar de terminala positionerna för cellyteglykokonjugat, kan den dölja de underliggande strukturerna och därmed hämma cell-till-cell-kontakt via icke-specifika repulsiva effekter eller genom att hindra detektion av andra lektiner4. Aktiviteten hos en mängd olika sialyltransferaser (som överför sialinsyror) och sialidaser (som klyver sialinsyrabindningar) i cellen bestämmer mängden sialinsyra som finns på ytan. Dessutom kan lösliga sialyltransferaser och sialidaser som uttrycks av värden eller patogener extrinsiskt modifiera mängden sialinsyra på cellytan 5,6.

Avvikande sialylering är ett kännetecken för flera patologiska tillstånd. Vid autoimmuna sjukdomar kan hyposialylering bidra till ohämmad immunaktivering och organskador, eftersom sialinsyra hjälper till att diskriminera självantigener och reglera inflammatoriskareaktioner. Omvänt resulterar hypersialylering i överuttryck av sialoglykaner, såsom sialyl-Tn, sialyl-Lewis-antigener, polysialinsyra och gangliosider, vilket utgör ett kännetecken för vissa cancerformer 8,9. Hypersialylering beror också på ökat uttryck av specifika enzymer såsom N-acetylglukosaminyltransferas (GNT-V), som genererar hypersialylerade tri- och/eller tetraantennära N-kopplade glykaner, som har associerats med cancertillväxt och metastasering10. Innehållet av sialinsyra reglerar också proteinets stabilitet och funktion, vilket är avgörande för relevanta onkogena aktörers roll11. Därför kan ökad sialylering underlätta tumörutveckling, metastasering, läkemedelsresistens och immunflykt. Dessutom gör uppregleringen av sialoglykaner det möjligt för tumörer att interagera med hämmande Siglec-receptorer på immunceller och undvika immunövervakning. Av den anledningen anses sialoglykaner nu vara glykoimmuna kontrollpunkter och attraktiva terapeutiska mål. Till exempel befinner sig hämmare av Siglec-immunaxeln redan i tidiga kliniska prövningar, eftersom immuncellsreceptorn Siglec (sialicsyrabindande ImmunoGlobulin-like LECtin) spelar en immunhämmande roll12.

Enzymer har använts för att modulera glykanprofilen som verktyg för studier eller för terapeutiska strategier13,14. Sialidas har använts för att förändra cancercellers malignitet eftersom sialylerade glykaner såsom sialyl Lewis X är avgörande för cellmigration och cancermetastasering15. Samtidigt har sialidashämmare, som hindrar sialinsyraklyvning, nått kliniker för behandling av sialinsyraberoende virusinfektioner16. På senare tid har sialinsyramodulering fått ytterligare intresse på grund av sialinsyrornas kritiska roll som ligander i Siglec-immunaxeln, vilket innebär att de erbjuder nya sätt att minska cancerflykt från immunsvar. Detta intresse förstärktes ytterligare av 2022 års Nobelpristagare Bertozzi och hennes teams bidrag med flera strategier som selektivt klyver olika sialoglykaner och förbättrar immunsvaret mot cancer17. Således representerar sialidasbaserade strategier en lovande modalitet för glykoimmun checkpoint-terapi. Glykofenotypen hos celler i immunsystemet är beroende av typen av cell och deras aktiveringsstatus. När det gäller T-celler har glykaner en nyckelroll i de patofysiologiska stegen för T-cellsutveckling och tymocytselektion, T-cellsaktivitet, differentiering och proliferation18. Till exempel påverkar polylaktosamin på glykoproteiner basala nivåer av B-lymfocyter och T-lymfocyter och makrofagaktivering19. I makrofager har distinkta glykanuttrycksmönster en viktig roll i makrofagrekryteringen till tumörens mikromiljö (TME)20. Därför kan immuncellers uttryck av O- och N-kopplade glykaner användas som potentiella glykobiomarkörer för terapeutiska metoder vid behandling av cancer och autoimmuna sjukdomar.

Dendritiska celler (DC) är specifika antigenpresenterande celler med en unik förmåga att utlösa immunsvar, såsom anti-cancerimmunitet21. DCs måste genomgå en uppreglering av sina antigenpresenterande MHC-molekyler för att presentera antigener för T-celler (signal 1), co-stimulerande molekyler för att aktivera T-celler (signal 2) och proinflammatoriska cytokiner, såsom IL-12, för att utlösa typ 1-hjälpar-T-cellsproliferation (signal 3)22. Den resulterande immunprofilen är strikt reglerad, och kontrollpunkter är viktiga för att förhindra att friska celler attackeras. Eftersom DC kan stimulera olika immunsvar mot tumörceller används de som cellbaserade vacciner, och ett stort antal kliniska studier har visat deras potentiella fördelar23,24. Efter att FDA godkände det första DC-baserade vaccinet 201025,26 har många andra DC-baserade vacciner utvecklats. DC-baserade vacciner produceras huvudsakligen ex vivo och administreras till patienter för att framkalla immunsvar mot tumörer. Otillräcklig eller kort mognad är dock för närvarande en av de faktorer som begränsar den kliniska effekten av DCs och innebär att dyra cytokincocktails måste användas. Utan adekvat mognad kan DCs inte aktivera T-celler under kliniska omständigheter. Istället uttrycker DC:erna immunkontrollpunkter och utlöser ett tolerogent immunsvar som hindrar cytotoxiska T-celler från att verka mot tumörceller.

Humana DCs har kraftigt sialylerade ytor, och denna sialylering minskar vid mognad och under ett övergripande immunsvar27. Mognaden av DCs kan induceras genom att eliminera dessa sialinsyror med sialidas. Desialylering uppreglerar i hög grad olika cytokiner, inklusive IL-12, på grund av translokationen av NF-kB-transkriptionsfaktorn till kärnan 6,28. Dessutom förbättrar desialylering antigenkorspresentation genom MHC-I och antitumörimmunsvar29,30. Följaktligen genererar knockouten av sialyltransferaserna ST3Gal.l och ST6Gal.l, som har en viktig roll i DC-sialylering, en mer mogen fenotyp i murina DCs31.

Silidasbehandling ger en metod för att stimulera alla aspekter av DC-mognad, inklusive ökad antigenpresentation, ökat uttryck av co-stimulerande molekyler och ökad cytokinproduktion, för att åtgärda de brister som nämns ovan och göra det möjligt för DCs att framkalla effektiva svar. I den här artikeln presenteras en procedur för att erhålla livskraftiga desialylerade humana DCs genom användning av ett bakteriellt sialidas. De-sialylerade DCs visar en förbättrad mognadsprofil och kan användas som cellmodeller för att öka immunsvaret mot tumörer in vitro. DCs erhålls från blodmonocyter, som sedan differentieras in vitro i närvaro av cytokinen interleukin-4 (IL-4) och granulocytmakrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF). Detta arbete beskriver också lektinbaserade metoder för att analysera sialinsyra på cellytan och metoder för att immunofenotypa DC-mognadsnivån. Proceduren som beskrivs här kan användas för att desialysera andra celltyper, vilket ger ett tillvägagångssätt för att undersöka rollen för sialoglykaner, som är viktiga glykoimmuna kontrollpunkter och relevanta för immunmodulering.

Protocol

Cellerna isolerades från de buffy rockarna hos friska anonyma blodgivare, som var frivilliga från den nationella blodbanken, Instituto Português do Sangue e da Transplantação (IPST), efter skriftligt och informerat samtycke från donatorn (IMP.74.52.4). Användningen av blod godkändes av etikkommittén (IPST 30072015) i enlighet med direktiv 2004/23/EG om kvalitets- och säkerhetsnormer för donation, tillvaratagande, kontroll, bearbetning, konservering, förvaring och distribution av mänskliga vävnader och celler (portugisisk lag 22/2007, 29 juni). IPST-biobanken samlar in och lagrar blod i en särskild plastpåse som innehåller citratfosfatdextros (CPD), en konserverande och antikoagulerande lösning, för att bibehålla blodets integritet fram till bearbetningen. För att bedöma om det biologiska materialet är lämpligt för manipulation utförs en serologisk kontroll för Treponema pallidum, hepatit B-virus (HBV), hepatit C-virus (HCV) och humant immunbristvirus (HIV), som alla måste vara negativa. För den aktuella studien tillhandahölls buffypälsen av IPST för undersökningsändamål, tillsammans med information om insamlingsdatum, serologiska resultat, blodgrupp och ålder på donatorn32. Buffypälsen kan stå i rumstemperatur i högst 1 dag.

1. Erhållande av dendritiska celler från monocyter

OBS: Det är viktigt att nämna att när humant perifert blod manipuleras, bör man överväga specifika universella säkerhetsåtgärder och lämplig materialkassering. Innan du börjar, kontrollera att alla reagenser och material som behövs är förberedda och redo att användas.

  1. Isolering av mononukleära celler i perifert blod
    1. Få tillgång till den mänskliga buffypälsen.
      OBS: Buffy coat är en biprodukt som härrör från blod som samlats in via leukaferes32, som anrikas i vita blodkroppar genom centrifugering. Alla steg utfördes i ett biosäkerhetsskåp med vertikal flödeskammare (BSC).
    2. Öppna buffy coat-förpackningen genom att skära av det förseglade utloppsröret med en skalpell och överför innehållet till ett 50 ml rör. Överför 7 ml buffy coat sample per steril 15 ml konisk slang och tillsätt 6 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) för att utföra en preliminär tvätt. Detta första tvättsteg är nödvändigt för att rengöra provet från den avsevärda mängden röda blodkroppar (RBC) och plasma så att provet är optimerat för gradientseparation med ett densitetsgradientmedium (se materialtabellen).
    3. Centrifugera röret i rumstemperatur i 10 minuter vid 1 100 x g i en centrifug med svängrotor och med bromsen avstängd (se materialtabellen).
    4. Efter centrifugeringen samlas leukocytsuspensionen (den vita ringen mellan plasma och röda blodkroppar) upp med en Pasteurpipett och överförs till ett nytt sterilt 15 ml koniskt rör.
    5. Fyll leukocytsuspensionen upp till 10 ml med PBS för att underlätta nästa separationssteg, och blanda genom att försiktigt pipettera upp och ner.
    6. Förbered densitetsgradientmediet (densitet: 1,077 g/ml) lösning: Placera 3 ml densitetsgradientmedium i ett nytt sterilt 15 ml koniskt rör och låt det värmas upp till rumstemperatur.
    7. Tillsätt 5 ml av den utspädda leukocytsuspensionen (från steg 1.1.5) i det koniska röret som innehåller densitetsgradientmediet (5:3) för att utföra densitetsgradientseparation. Tillsätt provet långsamt, droppe för droppe, med hjälp av rörväggarna för att undvika att störa densitetsgradientmediet.
    8. Gradientseparation: Centrifugera densitetsgradientmediets suspension vid rumstemperatur i 30 minuter vid 1 100 x g i en centrifug med svängrotor och med bromsen avstängd.
    9. Efter centrifugering, ta försiktigt bort de koniska rören från centrifugen. Efter detta steg är en rad väldefinierade lager synliga, inklusive följande, med början från botten: ett rött lager (röda blodkroppar och granulocyter), densitetsgradientmedium, ett tunt blekt lager av mononukleära celler i perifert blod (PBMC) och plasma.
    10. Samla upp det tunna lagret av PBMC med hjälp av en Pasteur-pipett och undvik att ta upp densitetsgradientmediet under eller för mycket plasma ovanför. Placera PBMC-provet i ett nytt 50 ml koniskt rör, fyll det upp till 25 ml med PBS och blanda sample genom att försiktigt pipettera upp och ner.
    11. Centrifugera proverna vid rumstemperatur i 10 minuter vid 600 x g (normal broms) för att tvätta bort kvarvarande celler och skräp, och kassera supernatanten genom att försiktigt vända röret upp och ner.
      OBS: Om det finns för mycket kontaminering av röda blodkroppar, vilket kan observeras när cellpelleten eller buffypälsen inte är helt separerad eller verkar rödaktig, rekommenderas att lysera de återstående röda blodkropparna. Tillsätt i så fall 5 ml RBC-lysbuffert (se materialtabellen), blanda ordentligt och inkubera i 5 minuter. Fyll upp till 40 ml med PBS, centrifugera proverna vid rumstemperatur i 10 minuter vid 900 x g (normal broms) och kassera supernatanten genom att försiktigt vända röret upp och ner.
    12. Fyll provet till 10 ml med PBS och ta en alikvot för att räkna cellerna. För att avlägsna blodplättar, centrifugera i rumstemperatur i 5 minuter vid 400 x g (normal broms) och kassera supernatanten genom att försiktigt vända röret upp och ner.
      OBS: Om det finns ett stort antal blodplättar, centrifugera i rumstemperatur i 10 minuter vid 200 x g (normal broms) två gånger. Trombocyterna identifieras genom att visualisera provet samtidigt som cellerna räknas.
  2. Monocytisolering genom immunmagnetisk separation
    1. Bered bufferten med mikrokulor genom att komplettera PBS med 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) och 2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA). Sterilisera lösningen genom filtrering (0,2 μm) och förvara bufferten i kylskåp (2-8 °C).
    2. Utför monocyt CD14+ -isolering genom magnetaktiverad cellsortering (MACS).
      1. Efter cellräkning med hjälp av en automatiserad cellräknare (steg 1.4.1), beräkna lämplig volym mikrokulabuffert och CD14 immunmagnetiska pärlor (se materialtabellen) som krävs. Se till att dessa lösningar hålls på is. Tillsätt 80 μL mikropärlor buffert per 1 x 10 7 celler och 20 μL CD14-pärlor per 1 x 107 celler.
      2. Återsuspendera cellpelleten i de tidigare fastställda volymerna och inkubera i 15 minuter vid 4 °C (2–8 °C).
        OBS: Om verifiering av monocytnivåerna i PBMC-proverna behövs, utför en flödescytometrisk analys med färgningsantikroppar (t.ex. CD14 [Monoklonal TÜK4]). Följ steg 3.2 för mer information om den flödescytometriska analysen.
      3. Tillsätt 1-2 ml mikropärlor buffert per 1 x 107 celler, centrifugera i rumstemperatur i 10 minuter vid 600 x g (normal broms) för att ta bort obundna pärlor och kassera supernatanten genom att försiktigt vända röret.
      4. Förbered LS-kolumnen. LS-kolonnerna innehåller ferromagnetiska sfärer som, när de placeras på en magnet, tillåter positiv, skonsam retention av magnetiskt märkta celler33. Omedelbart före användning, placera en LS-kolonn (se materialtabellen) på magneten, skölj med 3 ml mikropärlor buffert utan att torka helt och fortsätt omedelbart till nästa steg.
        OBS: Låt aldrig kolonnen torka ut under proceduren för att undvika att äventyra utbytet.
      5. Återsuspendera cellpelleten i 500 μL mikrokulebuffert per 1 x 108 celler. Om cellantalet är högre än 4 x 108, använd en 40 μm cellsil för att förhindra cellaggregering.
      6. Tillsätt cellsuspensionen till kolonninloppet, placera ett 15 ml koniskt rör under kolonnens utlopp för att samla upp den negativa cellfraktionen och tvätta kolonnen tre gånger med 3 ml mikropärlor buffert. Den negativa fraktionen består av de celler som inte samlades in med CD14−-kulorna (dvs. CD14− -cellerna).
      7. Efter den sista tvätten, ta bort kolonnen från magneten, placera den på ett sterilt 15 ml koniskt rör, pipettera 5 ml mikropärlor buffert i kolonninloppet och sätt omedelbart in sprutkolven i kolonninloppet och tryck för att dispensera målcellerna.
      8. Samla in de magnetiskt märkta cellerna (CD14+ -celler) och ta en alikvot för att räkna cellerna, enligt beskrivningen i steg 1.4.1.
      9. Centrifugera båda cellfraktionerna, CD14− och CD14+-celler, vid rumstemperatur i 10 minuter vid 600 x g (normal broms). Kassera supernatanten, behåll CD14+-fraktionen för nästa steg och lagra CD14−-fraktionen för framtida analyser, såsom samkulturanalyser, om det behövs. Vid behov kan cellerna från CD14−-fraktionen kryokonserveras i RPMI-1640 20 % FBS och 10 % DMSO vid −80 °C.
  3. Monocytdifferentiering till dendritiska celler
    1. Bered komplett RPMI-1640-medium genom att komplettera RPMI-1640-basmediet (innehållande 11.1 mM glukos) med 10 % fetalt bovint serum (FBS), 1 % av 2 mM L-glutamin, 1 % icke-essentiella aminosyror (NEAA), 1 % natriumpyruvat och 1 % 100 μg/ml penicillin/streptomycin (se materialtabellen).
    2. Utför monocytdifferentiering till mo-DCs, vilket sker under ~5-6 dagar.
      1. Beräkna den volym medium som krävs för antalet erhållna CD14+ -celler och plätera cellerna enligt följande experimentuppställning.
        OBS: I detta protokoll pläterades cellerna med en koncentration av 1,3 x 106 celler/ml för att ta hänsyn till celldöd och mätfel, och mediet bereddes genom att tillsätta 1 000 E/ml GM-CSF och 750 E/ml IL-4 (se materialtabellen) till ett komplett medium och blanda det noggrant.
      2. Tillsätt lämplig volym medium till CD14+ -cellerna och återsuspendera genom att pipettera upp och ner med en Pasteur-pipett. Platta cellsuspensionen i plattor med 24 brunnar (per brunn: 1,3 x 106 celler/ml) och inkubera i en odlingsinkubator vid 37 °C med 5 % CO2 .
      3. Byt odlingsmedium och komplettera det med färska cytokiner var 2-3:e dag (vanligtvis en gång per differentieringsprocess). För att utföra detta, ta försiktigt bort hälften av odlingsmediet utan att störa cellerna. Tillsätt samma mängd färskt medium med lämplig koncentration av cytokiner, som beskrivits tidigare i anmärkningen till steg 1.3.2.1, och inkubera under den återstående differentieringsperioden.
        OBS: DC, när de skiljer sig från monocyter, är löst vidhäftande celler. Fullt differentierade omogna mo-DCs är spindelformade, fritt flytande och löst vidhäftande celler. Cellerna kan också bilda rosetter, särskilt när de är mogna34 år.
      4. För att samla upp cellerna efter differentiering, använd en mikropipett för att överföra hela cellsuspensionen till ett sterilt koniskt rör och tvätta plattans brunnar två gånger med PBS, knacka försiktigt på botten (Figur 1A).
        OBS: Undvik att samla de kraftigt vidhäftande cellerna, eftersom dessa förmodligen är makrofager. För att undvika felaktig cellmognad eller aktivering, se till att cellerna hanteras med extrem försiktighet.
      5. Centrifugera cellerna vid rumstemperatur i 10 minuter vid 180 x g (normal broms) för att avlägsna eventuella rester eller döda celler, och återsuspendera i lämpligt medium/buffert för försöksuppställningen.
    3. Utför mognad av mo-DC:er.
      1. Om mognad av mo-DC krävs, använd en brunnsplatta eller flaska, med beaktande av det cellkoncentrationsexempel som användes tidigare (1,3 x 10 6 celler/ml), och administrera en cytokincocktail genom att komplettera mediet med en cytokincocktail bestående av IL-1β (10 ng/ml),IL-6 (1 000 E/ml), prostaglandin E2 (PGE2; 1 μg/ml), och tumörnekrosfaktor-α (TNF-α; 10 ng/ml) (se materialtabellen). Inkubera cellerna vid 37 °C med 5 % CO2 i 24 timmar eller 48 timmar.
  4. Cellräkning och livsduglighet
    1. Utför cellräkning och trypan blå färgning.
      1. För att bestämma antalet celler och viabiliteten hos en cellsuspension, ta en alikvot på 10 μl från cellsuspensionen och blanda den med 10 μl trypanblått (1:1 spädning).
      2. Ta 10 μL av den föregående blandningen och använd den automatiska cellräknaren för att räkna antalet celler enligt tillverkarens instruktioner.
        OBS: Om koncentrationen av celler är för hög, späd ut alikvoten och ta hänsyn till utspädningsfaktorn i beräkningarna efter cellräkningen.
      3. Justera cellantalet och medium/buffert för experimentuppställningen.
    2. Bestäm cellviabilitet och apoptos30.
      OBS: I detta arbete, efter sialidasbehandlingen (avsnitt 2), utfördes viabilitetsanalysen.
      1. Färga mo-DC med 5 μg/ml 7-aminoaktinomycin D (7-AAD) och annexin V och bestäm apoptosen enligt tillverkarens anvisningar (se materialförteckningen).
      2. Analysera resultaten med hjälp av flödescytometri29,30.

2. Behandling av cellerna med sialidas

OBS: Efter differentieringen till mo-DCs, på den sjätte dagen, är cellerna redo för sialidasbehandlingsanalysen.

  1. Med tanke på den önskade experimentuppställningen, samla ~10 x 10 6 mo-DCs från 10 brunnar av 24-brunnsplattorna med 1,3 x 106 celler/brunn och överför dem till ett nytt sterilt 15 ml koniskt rör.
    OBS: Antag en viss cellförlust; Vanligtvis, i detta skede, är den uppmätta koncentrationen 1,3 x 106 celler/ml eftersom mo-DCs och deras prekursorer inte förökar sig och upplever 20% viabilitetsförlust under differentiering till mo-DCs.
  2. Centrifugera i rumstemperatur i 5-7 minuter vid 300 x g (normal broms) och kassera supernatanten för att avlägsna döda celler och skräp.
  3. Tillsätt 10 ml RPMI-1640-medium (innehållande 11,1 mM glukos), centrifugera vid rumstemperatur i 4 minuter vid 300 x g (normal broms), kassera supernatanten, tillsätt 2 ml RPMI-1640 och blanda ordentligt.
  4. Placera 1 ml celler i RPMI-1640 i nya sterila mikrorör, #1 och #2; Varje mikrorör kommer att innehålla cirka 5 x 106 celler.
  5. Tillsätt 500 mU sialidas från Clostridium perfringens till mikrorör #1 (se materialtabellen). Till mikrorör #2, tillsätt mock-behandlat sialidas, som är en negativ kontroll, för att bekräfta om de observerade effekterna är direkt relaterade till avlägsnande av sialinsyra och inte beror på artefakter. Det mockbehandlade sialidaset är värmeinaktiverat sialidas, som erhålls genom att enzymet kokas i 20 minuter vid 100 °C.
  6. Inkubera i 60 minuter vid 37 °C.
  7. Efter inkubationen, placera cellerna i nya sterila 15 ml koniska rör med samma numrering, #1 och #2. Tillsätt cirka 4 ml komplett RPMI-1640-medium (innehållande 10 % FBS) till båda rören för att stoppa den enzymatiska reaktionen.
  8. Centrifugera i rumstemperatur i 4 minuter vid 300 x g (normal broms) och kassera supernatanten.
  9. Tillsätt 5 ml komplett RPMI-1640-medium till varje rör och platta 1 ml celler per brunn.

3. Bestämning av sialinsyraprofilen

  1. Färgning av lektin
    1. Samla upp och tvätta cellerna i rumstemperatur i 5 minuter vid 300 x g (normal broms).
    2. Återsuspendera cellerna i RPMI-1640 + 10 % FBS och fördela cellerna (100 000/100 μL) i mikrorören.
    3. Utför färgning för flödescytometri i RPMI-1640 med 10 % FBS med en koncentration på 0.01 mg/ml för varje lektin: Sambucus nigra (SNA) lektin, jordnötagglutinin (PNA) lektin och Maackia amurensis (MAA) lektin (se materialtabellen). Inkubera i 30 minuter vid 4 °C.
    4. Tvätta cellerna med 1 ml PBS innehållande 10 % FBS eller 10 % BSA och centrifugera i rumstemperatur i 4 minuter vid 300 x g (normal broms).
    5. Tillsätt 0,0005 mg/ml streptavidin-PE (se materialtabellen) till de celler som färgats med biotinylerade lektiner och inkubera i 15 minuter i rumstemperatur i mörker. Tvätta cellerna med 1 ml PBS och centrifugera i rumstemperatur i 4 minuter vid 300 x g (normal broms).
    6. Kassera supernatanten och tillsätt 300 μL 2 % paraformaldehyd (PFA 2 %) till varje rör. Skydda rören från ljus och förvara vid behov vid 4 °C tills data samlas in.
    7. Samla in data med hjälp av en flödescytometer inom 1 vecka efter provberedning 29,30.
  2. Flödescytometri
    1. Återsuspendera cellerna i 1 ml PBS och ta provet med en flödescytometer för omedelbar datainsamling.
    2. Vid fördröjd datainsamling suspenderas 2 % PFA i 300 μL och data samlas in inom 1 vecka.
  3. Konfokal laserskanningsmikroskopi
    1. Plätera cellerna på polylysinbelagda glasskivor med en diameter på 12 mm och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
    2. Centrifugera täckglasen i rumstemperatur i 1 minut vid 100 x g (normal broms) för att främja cellvidhäftning.
    3. Fixera i rumstemperatur i 30 min med 4% PFA innan tvätt med 1% BSA i PBS.
    4. Använd FITC-konjugerat SNA-lektin (0,01 mg/ml) för att färga α2,6-bundna sialinsyror på cellytorna (se materialtabellen).
    5. Ta bilder på ett konfokalmikroskop (se materialtabellen).
    6. Efter Z-stackbearbetning, välj representativa konfokala tvärsnittsbilder.
    7. Analytiskt kvantifiera färgningsintensiteten med hjälp av den korrigerade totala cellfluorescensen (CTCF).
      CTCF = Integrerad densitet − (Arean av den valda cellen × Genomsnittlig fluorescens av bakgrundsavläsningar)29.

4. Mognadsprofilering av mo-DC

  1. Antikroppsfärgning och flödescytometri
    1. Samla in ett nytt prov av de celler som är av intresse för att utföra antikroppsfärgning. Tvätta cellerna i rumstemperatur i 5 minuter vid 300 x g (normal broms) och fördela cellerna i mikrorören (100 000 celler per rör).
    2. Utför färgning för flödescytometri med önskade antikroppar (ab), MHI-I, MHC-II, CD80 och CD86 (se materialtabellen).
    3. Inkubera den fluorescenskonjugerade ab i 15 minuter i rumstemperatur i mörker.
    4. Tvätta cellerna med 1 ml PBS och centrifugera i rumstemperatur i 5 minuter vid 300 x g (normal broms).
      OBS: Om du använder omärkt ab, tillsätt fluorescerande konjugerad sekundär ab och inkubera i mörker i 15 minuter enligt tillverkarens instruktioner. Tvätta cellerna med 1 ml PBS och centrifugera i rumstemperatur i 5 minuter vid 300 x g (normal broms).
    5. Tillsätt upp till 100 μl PBS till alla mikrorör, återsuspendera cellerna i 300 μl 2 % paraformaldehyd (PFA 2 %) och förvara rören i mörker vid 4 °C fram till datainsamlingen.
    6. Samla in data med hjälp av en flödescytometer.
      OBS: Efter färgning och fixering kan proverna erhållas genom flödescytometri omedelbart eller inom en 1-veckorsperiod. Förvara i så fall rören vid 4 °C i mörker.

5. Enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA)

OBS: I detta arbete mättes IFN-γ-produktionen med hjälp av ELISA-analysen enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabellen).

  1. För beläggning av plattan i en beläggningsbuffert, späd avskiljningsantikroppen (1:100, avskiljningsantikropp i PBS), överför 100 μl av denna arbetslösning till varje brunn och inkubera över natten vid rumstemperatur.
  2. Kassera infångningsantikroppen helt.
  3. Tillsätt blockeringsbufferten (t.ex. PBS + 2 % BSA + 0,05 % Tween20) och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur innan blockeringsbufferten tas bort.
  4. Tillsätt standarden och provet, med respektive blandning och spädningar, och inkubera i 2 timmar i rumstemperatur. Tvätta fem gånger med tvättmedel.
  5. Tillsätt den biotinylerade detektorantikroppen och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur, följt av fem tvättar.
  6. Tillsätt poly-HRP-streptavidin-HS och inkubera i 30 minuter i rumstemperatur, följt av fem tvättar med tvättbuffert.
  7. Tillsätt TMB-substrat (se materialtabellen) och inkubera i upp till 60 minuter vid rumstemperatur, med hänsyn till det testsystem som används. Tvätta fem gånger med tvättmedel.
  8. Läs av proverna på en mikroplattläsare vid 450 nm.

Representative Results

Monocytisolering och monocytdifferentiering till mo-DC
I enlighet med protokollet isolerades mänskliga PBMC från buffypälsen med hjälp av densitetsgradientseparation med densitetsgradientmedium och tvättades noggrant. Trypanblått användes för att utföra livskraftig cellräkning på isoleringsdagen, som beskrivits tidigare i steg 1.4.1. Därefter utfördes CD14+ monocytisolering genom positiv selektion. För att uppnå detta inkuberades PBMC med magnetiska pärlor som innehåller en antikropp som känner igen CD14-antigenet. De utvalda CD14+ -monocyterna odlades i ett medium kompletterat med GM-CSF och IL-4 under 5-6 dagar27 för att differentiera till omogna mo-DC (Figur 1A). Mognaden av mo-DC kan erhållas genom att applicera en cocktail av cytokiner, inklusive IL-6, IL-1β, TNF-α och PGE235 (figur 1A).

Under differentieringsprocessen, som ett resultat av IL-4 och GMCSF-stimulering, förväntas cellfenotypen förändras. Data visar att mo-DCs förlorar uttrycket av ytmarkören CD14, huvudsakligen uttryckt av monocyter (Figur 1B), och får ett signifikant uttryck av CD1a, en markör som uttrycks av humana DCs36,37. mo-DC erhåller också högre MHC-II (HLA-DR)-uttryck, en antigenpresenterande molekyl som uttrycks av humana DCs och andra antigenpresenterande celler38 (figur 1B).

Halten av sialinsyra på cellytan
Behandlingen av mo-DC med sialidas minskar sialinsyrahalten på ytan av mo-DCs, vilket kan bekräftas genom färgning med lektiner, som är proteiner som kan binda till kolhydrater39. Eftersom det enzym som används avlägsnar både α2,3- och α2,6-bundna sialinsyror från cellytan, färgades mo-DCs med PNA, som känner igen T-antigen-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr, samt MAA- och SNA-lektiner, som binder till α2,3- respektive α2,6-sialic. Effekten av sialidasbehandlingen utvärderades med flödescytometri och konfokalmikroskopi (Figur 2). Som visas i figur 2A minskade sialidasbehandling signifikant MAA- och SNA-bindningen samtidigt som PNA-färgningen ökade. Minskningen av SNA-färgning efter sialidasbehandling bekräftades ytterligare av konfokalmikroskopianalys som visade en signifikant minskad SNA-färgning på cellytan (Figur 2B).

Funktionell karakterisering av sialidasbehandlade mo-DCs
För att utvärdera hur sialidasbehandling påverkar mo-DC-funktioner utvärderades mognadsnivån av mo-DCs efter sialidasbehandling. Som visas i figur 3A leder sialidasbehandlingen till en signifikant ökning av uttrycket av de antigenpresenterande molekylerna MHC I och MHC II och uttrycket av CD80- och CD86-co-stimulerande molekyler. För att bedöma effekten av avlägsnande av sialinsyra på mo-DCs förmåga att inducera T-cellssvar, användes sialidasbehandlade mo-DCs laddade med tumörcellslysat för att prima autologa T-celler (Figur 3). Därefter karakteriserades profilen för de resulterande T-cellerna baserat på deras förmåga att utsöndra Th1-cytokinet IFN-γ. Som visas i figur 3B, jämfört med T-celler primade av helt sialylerade mo-DCs, utsöndrade T-cellerna primade av sialidasbehandlade mo-DCs signifikant högre nivåer av IFN-γ. Dessa resultat tyder på att sialidasbehandlade mo-DC har förbättrad förmåga att prima autologa T-celler.

Cellviabilitet
Efter behandling med sialidas, utfördes en viabilitetsanalys för att säkerställa att behandlingen inte var cytotoxisk för cellerna. Efter behandling färgades mo-DC med 7-AAD och Annexin V, för att detektera icke-viabla och apoptotiska celler, och analyserades med flödescytometri (Figur 4). Data visar ingen signifikant skillnad i cellviabilitet mellan obehandlade (figur 4, vänster panel) och sialidasbehandlade celler (figur 4, höger panel).

Figure 1
Figur 1: Differentiering av isolerade monocyter till mo-DCs. (A) CD14+-monocyter isolerades från buffy coat och odlades i en koncentration av 1,3 x 106 celler/ml vid 37 °C. Monocyterna differentierades i medium kompletterat med 750 E/ml IL-4 och 1 000 E/ml GM-CSF. Mikroskopisk analys av morfologin hos monocyter isolerade från human buffy coat på dag 0 (översta bilden). Omogna mo-DCs; cellerna differentierades under en period av 5 dagar med hjälp av IL-4 och GM-CSF (mellersta bilden). Mogna mo-DCs erhölls genom att använda IL-6, IL-1β, TNF-α och PGE2 cytokiner i 24 timmar (nedre bilden). Skalstaplar: 100 μm. (B) Cellerna analyserades dag 0, dag 2 och dag 5 under hela differentieringsperioden med hjälp av flödescytometri. Följande antikroppar användes för att karakterisera cellytemarkörer: (a-c) CD14; (d-f) CD1a och (g-i) HLA-DR (MHC klass II). Figuren visar representativa histogram för minst tre oberoende analyser. Panel (B) har modifierats från Videira et al.40, patent WO2017002045A1. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Sialidasbehandling av humana mo-DCs för att avlägsna α2,6- och α2,3-bundna sialinsyror från cellytan. A) Analys av mo-DC genom flödescytometri med lektinfärgning för att testa effekten av sialidasbehandling. Humana mo-DC behandlades med sialidas (grå staplar) eller lämnades obehandlade (vita staplar) och färgades med SNA-lektin (känner igen [2,6]-sialinsyror), MAA-lektin (känner igen [2,3]-sialinsyror) och PNA-lektin (känner igen T-antigen-Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr). Värdena representerar den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) för minst tre oberoende analyser. Statistisk signifikans bestämdes med hjälp av ett tvåsidigt parat t-test (*P < 0,05 eller ***P < 0,0001), med avseende på skillnaden mellan de obehandlade och sialidasbehandlade DCs. Behandling med sialidas minskade MAA-bindningen och ökade PNA-färgningen i humana mo-DCs, till följd av avlägsnandet av α(2,3)-bundna sialinsyror; avlägsnandet av α(2,6)-bundna sialinsyror efter behandling med sialidas, detekterades genom en minskning av SNA-färgningen. (B) Konfokalmikroskopi av mo-DCs behandlade med sialidas och preparerade på täckglas för observation. En rad z-stackbilder samlades in från olika celler och bearbetades för att inkludera den genomsnittliga färgningsintensiteten. Skalstaplar: 20 μm. Panel (A) har modifierats från Silva et al.30; panel (B) har modifierats från Silva et al.29. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Sialidasbehandling av mo-DCs som inducerar ett högre uttryck av mognadsmarkörer. (A) mo-DCs behandlade med sialidas uppvisade en högre mognadsfenotyp än helt sialylerade mo-DCs. Flödescytometri användes för att utvärdera uttrycket av flera mognadsmarkörer. Mo-DCs behandlades med sialidas i 1 timme vid 37 °C. Diagramvärdena representerar den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) (medelvärde ± SEM) för minst tre oberoende analyser. Statistiskt signifikanta skillnader beräknades med hjälp av ett t-test (*P < 0,05, **P < 0,01), med avseende på skillnaden mellan de obehandlade och sialidasbehandlade tillstånden. (B) Desialylerade humana mo-DCs laddade med heltumörantigener inducerade specifika T-cellssvar. Mo-DCs behandlades med sialidas i 1 timme vid 37 °C eller lämnades obehandlade, följt av laddning med MCF-7-lysat (TL) som en källa till hela tumörcellsantigener. Samodling mellan mo-DCs och autologa T-celler utfördes under 4-8 dagar i närvaro av IL-2 (10 E/ml). T-celler primade med desialylerade mo-DCs visade signifikant högre utsöndring av Th1-cytokinen, IFN-γ. Efter T-cellsstimulering med mo-DC mättes cytokinerna som utsöndrades i samkultursupernatanterna med ELISA (n = 7). Grafvärdena representerar koncentrationen (pg/ml) (medelvärde ± SEM). Statistiskt signifikanta skillnader beräknades med hjälp av ett t-test (*P < 0,05). Figuren har modifierats från Silva et al.30. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Avsaknad av effekt av sialidasbehandling på livskraften hos humana mo-DC. Obehandlade mo-DCs (vänster panel) och sialidas-behandlade mo-DCs (höger panel) utsattes för dubbel färgning med annexin V och 7-AAD, och färgningen analyserades med flödescytometri. Data visade ingen signifikant skillnad i cellviabilitet mellan de obehandlade och sialidasbehandlade cellerna, vilket tyder på att mo-DCs kan tolerera sialidasbehandling och förbli livskraftiga för att utöva sin immunologiska funktion. Figuren har modifierats från Silva et al.30. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Isolering av monocyter
Detta manuskript beskriver ett protokoll för att generera mo-DCs från humanisolerade monocyter CD14+ (Figur 1A), följt av att utföra en sialidasbehandling för att minska sialinsyrahalten på ytan av dessa celler.

Det finns olika sätt att erhålla humana DC, t.ex. direkt från perifert blod eller perifera vävnader eller genom differentiering från förstadier som stamceller eller monocyter. Att erhålla DC differentierat från monocyter isolerade från perifert blod är mycket enklare på grund av att det är lätt att erhålla stora mängder monocyter jämfört med andra DC-källor41. Ändå, för att få en hög andel isolerade monocyter, måste alla protokollsteg följas noggrant. Till exempel kan densitetsgradientmediet vara giftigt för cellerna, och för att förhindra celldöd måste man undvika långvarig cellkontakt med densitetsgradientmediet och tvätta cellerna noggrant. Cellmanipulation måste göras så snabbt som möjligt för att undvika förlust av cellviabilitet. Från PBMC kan monocyter isoleras genom positiv selektion med hjälp av MACS-metoden (magnetic-activated cell sorting), som är en lämplig teknik för att ge ett stort antal monocyter. Dessutom, jämfört med andra metoder för selektion av monocyter, har mo-DCs som härrör från MACS-isolerade monocyter en större förmåga att stimulera anti-tumör-T-cellsaktivitet42. I detta protokoll, när monocyterna väl hade isolerats, inkuberades de med IL-4 och GM-CSF under en period av 5-6 dagar för att uppnå differentieringen till omogna mo-DC (Figur 1). Resultaten visade att morfologiskt (Figur 1A) och fenotypiskt (Figur 1B) differentierade de isolerade monocyterna till omogna mo-DCs. Dessutom, under hela differentieringen, förlorade mo-DC:erna uttrycket av CD14-markörer och fick uttrycket av CD1a och MHC-II (Figur 1B), som krävs för antigenpresentation för T-celler.

Denna isolering och differentiering av monocyter till mo-DC är begränsningar för detta protokoll. Isoleringsprocessen är ett känsligt steg som måste utföras noggrant och snabbt för att undvika celldöd, och detta steg måste också göras varje gång mo-DCs behövs för ett nytt experiment. Differentieringsprocessen tar 5-6 dagar, vilket innebär en svårighet när det gäller att använda denna metod för analyser med hög genomströmning. Icke desto mindre är isoleringsmetoden och användningen av cytokiner för att differentiera mo-DCs användbara för att generera ett stort antal funktionella mo-DCs in vitro för experimentändamål. De mo-DCs som genereras i detta protokoll kan genomgå sialidasbehandling, flödescytometri, ELISA, konfokalmikroskopi och så vidare, vilket understryker vikten och användbarheten av denna metod30.

Omogen mo-DC- och sialidasbehandling
Silidaser är viktiga för sialyleringsreglering och är ansvariga för att avlägsna sialinsyror från cellytans glykaner. I mo-DC leder avlägsnande av sialinsyra med sialidas till mognad av dessa celler, vilket ökar antigenkorspresentationen och efterföljande T-cellsaktivering och antitumöraktivitet30.

Omogna humana mo-DCs uppvisar ett högt innehåll av cellyte-α(2,6)- och α(2,3)-bundna sialinsyror27 jämfört med mogna mo-DCs 31,43. Avlägsnande av sialinsyror genom att behandla mo-DCs med sialidas förbättrar dessutom mognaden av DCs 28,30,31. Det sialidas som valdes ut för detta experiment kom från bakterien Clostridium perfringens. Ändå producerar andra organismer också sialidaser, såsom bakterierna Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae eller Salmonella typhimurium44, blodigeln Macrobdella decora45 och till och med Homo sapiens46, och sialidaser från dessa organismer används också experimentellt. Varje sialidas har dock olika substratspecificiteter. Dessutom kan användningen av enzymet sialidas ha sina begränsningar; Till exempel kan manipulation av mo-DCs under behandlingen ytterligare stimulera dessa celler. Dessutom måste mängden sialidas och inkubationstiderna optimeras baserat på vilken typ av celler som används och deras sialinsyrasammansättning. Avlägsnandet av sialinsyra är inte en permanent effekt utan snarare ett övergående fenomen, eftersom cellen kommer att återställa sitt innehåll av sialinsyra på cellytan. Förutom sialidas, finns det andra metoder för att reducera sialinsyramolekylerna på cellytan, såsom att använda sialyltransferashämmare, genknockouts av sialyltransferasgener eller metabolisk blockad av sialinsyra med hjälp av sialinsyramimetika47,48,49. Icke desto mindre kan dessa metoder ge distinkta effekter på celler, och förutom desialylering måste cellviabiliteten beaktas. Enzymbehandlingen med sialidasenzym är en praktisk metod för att effektivt och kortvarigt avlägsna sialinsyror på cellytan samtidigt som cellviabiliteten bibehålls.

I detta arbete tillsattes sialidas till de omogna mo-DCs i koncentrationen 500 mU/5 x 106 celler/ml, och cellerna inkuberades vid 37 °C i 60 minuter. Behandlingen utfördes med RPMI-1640 utan serum för att bevara cellviabiliteten och undvika interaktion mellan de sialylerade molekylerna som finns i serum30. Silidasbehandling kan utföras med andra buffertar förutom RPMI, såsom 50 mM natriumacetat, pH 5,1 (för C. perfingens sialidas) eller PBS50,51,52. Icke desto mindre är RPMI-1640 det vanligaste odlingsmediet för DCs eftersom det upprätthåller konstanta experimentella förhållanden under proceduren, undviker att inducera mognad och minskar eventuell stress som kan orsakas av sialidasbuffertar eller PBS53,54,55,56. Efter inkubation med sialidas är det viktigt att tvätta cellerna noggrant med ett serumtillsatt medium för att garantera att enzymreaktionen har upphört. Närvaron av sialylerade molekyler i serumet kommer att konkurrera som substrat för sialidas, vilket säkerställer ett snabbt reaktionsstopp.

Ytmarkörkarakterisering med flödescytometri och konfokalmikroskopi
För bestämning av sialinsyraprofilen, i protokollavsnitt 3, använde vi lektinfärgning följt av flödescytometri och konfokal laserskanningsmikroskopi. För cellfärgningsproceduren optimerades i båda fallen lektinkoncentrationerna och inkubationsförhållandena för att undvika cellagglutination och död. Det är viktigt att utföra inkubationen vid 4 °C i buffertar som innehåller minst 2 % av antingen FBS eller BSA för att undvika icke-specifik bindning av lektinerna. I detta protokoll användes RPMI-1640 innehållande 10 % FBS för att upprätthålla konstanta experimentella förhållanden och undvika cellstress. När det gäller konfokalmikroskopi är fixering av cellerna före färgning avgörande för att bevara morfologin, förhindra autolys och upprätthålla antigeniciteten.

Analysen av mo-DC-fenotypen med flödescytometri visade att sialidasbehandlade mo-DCs hade en signifikant högre mängd PNA-lektin bundet till cellytan jämfört med MMA- och SNA-lektiner, som minskade efter sialidasbehandlingen (Figur 2A). Som förväntat ökade PNA-färgningen, eftersom PNA känner igen icke-sialylerade antigener, till skillnad från MAA och SNA, som binder direkt till α2,3- respektive α2,6-sialinsyror30. Denna färgning bekräftar det effektiva avlägsnandet av sialinsyror från cellytan med hjälp av detta protokoll. En annan metod som kan användas för att validera behandlingen och analysera cellytans sialinsyrainnehåll är lektinfärgning följt av konfokalmikroskopi, som exemplifieras i figur 2B.

Förutom de förstnämnda exemplen finns det alternativa metoder för att utvärdera och karakterisera halten av sialinsyra, t.ex. lektinsondering genom western blotting. Det finns också alternativa sialinsyraspecifika lektiner, t.ex. Siglecs, en grupp lektiner som har en tydlig preferens för sialinsyratyper och kopplingar57. Förutom att använda lektiner i endera tekniken (flödescytometri, mikroskopi eller western blot), är det också möjligt att karakterisera sialinsyrahalten med hjälp av antikroppar; Till exempel kan α2,8-sialinsyror bedömas med antikroppar såsom klon 735, som är specifik för polysialinsyra58. Dessutom, efter sialidasbehandling, kan celler testas funktionellt för sin biologiska eller terapeutiska effektivitet genom att utvärdera deras fenotyp och förmåga att aktivera T-celler40. I själva verket, som visas i de angivna exemplen, uppvisade sialidasbehandlade mo-DCs högre mognadsfenotyp, såväl som ett förhöjt uttryck av antigenpresenterande och samstimulerande molekyler.

Dessutom kan sialidasbehandlade mo-DCs laddas med antigener och samodlas med T-celler eller andra celler och kan sedan studeras med avseende på fenotyp, cytokinsekretionsprofil eller andra egenskaper. I exemplet visar data att sialidasbehandlade mo-DCs kan laddas med tumörantigener och sedan användas för att aktivera T-celler. Faktum är att de resulterande T-cellerna visade ökad IFN-γ-utsöndring, vilket är i överensstämmelse med tidigare rapporter om effekten av sialinsyrabrist på att öka kapaciteten hos mo-DCs att aktivera T-celler 27,28,29,30,31.

Sammanfattningsvis visar detta protokoll en genomförbar, genomförbar och praktisk metod för att generera mo-DCs för manipulation av sialinsyrainnehåll genom behandling med sialidas. Detta protokoll presenterar en metod som kan tjäna olika syften och tillämpningar. Denna metod kan inte bara ha en avgörande roll för att förstå sialinsyrornas roll i immuncellernas mognad och respons utan kan också användas som ett immunmodulerande verktyg.

Disclosures

Författarna redovisar inga konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna erkänner finansiering från Europeiska kommissionen GLYCOTwinning GA 101079417 och EJPRD/0001/2020 EU 825575; Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) Portugal, inom ramen för bidrag FCT 2022.04607.PTDC, UIDP/04378/2020, UIDB/04378/2020 (UCIBIO) och LA/P/0140/2020 (i4HB). FCT-NOVA. och Stemmatters finansierades också av Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), genom Programa Operacional Regional do Norte (Norte 2020) för SI I& DT DCMatters-projektet (NORTE-01-0247-FEDER-047212). Vi erkänner Biolabs anläggning vid FCT-NOVA och GLYCOVID NOVA Saude.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical tube AstiK’s CTGP-E15-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase
24-well plate Greiner Bio-one 662 160 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase
50 mL conical tube AstiK’s CTGP-E50-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
7-Aminoactinomycin D (7-AAD) BioLegend 420404 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Annexin V Immunotools 31490013 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Attune Acoustic Focusing Flow Cytometer Thermo Fisher Scientific  Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
BSA Sigma - Aldrich A3294-100G Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Determination of Sialic Acid Profile
CD14 (Monoclonal TÜK4) Miltenyi Biotec 130-080-701 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
CD80 Immunotools 21270803 Maturation Profiling of mo-DCs
CD86 Immunotools 21480863 Maturation Profiling of mo-DCs
Cell counting slides and trypan blue EVE EVS-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Centrifuge Eppendorf 5430 R Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Density gradient medium (Histopaque) Sigma - Aldrich 10771-100ML Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
EDTA Gibco, ThermoFisher 15400054 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Elisa kit (IFN-γ) Immunotools 31673539 Maturation Profiling of mo-DCs
EVE automated cell count NanoEntek 10027-452 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10500064 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Miltenyi Biotec   130-093-864 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Human CD14 microbeads (Immunomagnetic beads) Miltenyi Biotec 130-050-201 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-1β Sigma - Aldrich I9401 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-4 Miltenyi Biotec 130-093-919 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Interleukin (IL)-6 Sigma - Aldrich SRP3096 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
L-glutamine Gibco A2916801 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
LS column and plunger Miltenyi Biotec 130-042-401 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Maackia amurensis (MAA) lectin (MAA lectin - Biotinylated) Vector labs B-1265-1 Determination of Sialic Acid Profile
MHC-I (HLA-ABC) Immunotools 21159033 Maturation Profiling of mo-DCs
MHC-II (HLA-DR) Immunostep HLADRA-100T Maturation Profiling of mo-DCs
Microtubes AstiK’s PCRP-E015-500 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Neuraminidase (Sialidase) Roche 11585886001 Treatment of Cells with Sialidase
Non-essential amino acids (NEAA) Gibco 11140-050 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Paraformaldehyde (PFA 2%) Polysciences Europe 25085-1 Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Paraformaldehyde (PFA 4%) Biotium 22023 Determination of Sialic Acid Profile
Pasteur pipettes Labbox PIPP-003-500 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Peanut (Arachis hypogaea) Agglutinin (PNA) lectin (PNA lectin - FITC) Vector labs FL-1071 Determination of Sialic Acid Profile
Penicillin/streptomycin Gibco 15140163 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Phosphate Buffered Saline (PBS) NZYTech   MB18201 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Prostaglandin E2 (PGE2) Sigma - Aldrich P0409 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
RBC lysis buffer BioLegend 420302 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
RPMI-1640 medium (containing 11.1 mM glucose) Gibco 31870074 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile
Sambucus nigra lectin (SNA lectin - Biotinylated) Vector labs   B-1305-2 Determination of Sialic Acid Profile
Sambucus nigra lectin (SNA lectin - FITC) Vector labs FL-1301-2 Determination of Sialic Acid Profile
Sodium pyruvate Thermofisher 11360-070 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
SpectroMax190 Molecular Devices Maturation Profiling of mo-DCs
Streptavidin-PE BioLegend   405203 Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs
Tetramethylbenzidine (TMB) Sigma - Aldrich T0440 Maturation Profiling of mo-DCs
Tumour necrosis factor-α (TNF-α) Sigma - Aldrich H8916 Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells
Zeiss LSM710 confocal microscope Zeiss Determination of Sialic Acid Profile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Varki, A., Gagneux, P. Multifarious roles of sialic acids in immunity. Annals of the New York Academy of Sciences. 1253, 16-36 (2012).
  2. Bochner, B. S., Zimmermann, N. Role of Siglecs and related glycan-binding proteins in immune responses and immunoregulation. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (3), 598-608 (2015).
  3. Smith, B. A. H., Bertozzi, C. R. The clinical impact of glycobiology: Targeting selectins, Siglecs and mammalian glycans. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 217-243 (2021).
  4. Schauer, R. Sialic acids as regulators of molecular and cellular interactions. Current Opinion in Structural Biology. 19 (5), 507-514 (2009).
  5. Manhardt, C. T., Punch, P. R., Dougher, C. W. L., Lau, J. T. Y. Extrinsic sialylation is dynamically regulated by systemic triggers in vivo. Journal of Biological Chemistry. 292 (33), 13514-13520 (2017).
  6. Cabral, M. G., et al. Human dendritic cells contain cell surface sialyltransferase activity. Immunology Letters. 131 (1), 89-96 (2010).
  7. Bordron, A., et al. Hyposialylation must be considered to develop future therapies in autoimmune diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3402 (2021).
  8. Julien, S., Videira, P. A., Delannoy, P. Sialyl-Tn in cancer: (How) did we miss the target. Biomolecules. 2 (4), 435-466 (2012).
  9. Munkley, J. Aberrant sialylation in cancer: Therapeutic opportunities. Cancers. 14 (17), 4248 (2022).
  10. Dennis, J. W., Laferte, S., Waghorne, C., Breitman, M. L., Kerbel, R. S. S1-6 Branching of Asn-linked oligosaccharides is directly associated with metastasis. Science. 236 (4801), 582-585 (1987).
  11. Pinho, S. S., Reis, C. A. Glycosylation in cancer: Mechanisms and clinical implications. Nature Reviews Cancer. 15 (9), 540-555 (2015).
  12. Manni, M., Läubli, H. Targeting glyco-immune checkpoints for cancer therapy. Expert Opinion on Biological Therapy. 21 (8), 1063-1071 (2021).
  13. Sjögren, J., Lood, R., Nägeli, A. On enzymatic remodeling of IgG glycosylation; Unique tools with broad applications. Glycobiology. 30 (4), 254-267 (2020).
  14. Trastoy, B., et al. Sculpting therapeutic monoclonal antibody N-glycans using endoglycosidases. Current Opinion in Structural Biology. 72, 248-259 (2022).
  15. Pascoal, C., et al. Sialyl LewisX/A and cytokeratin crosstalk in triple negative breast cancer. Cancers. 15 (3), 731 (2023).
  16. von Itzstein, M., et al. Rational design of potent sialidase-based inhibitors of influenza virus replication. Nature. 363 (6428), 418-423 (1993).
  17. Gray, M. A., et al. Targeted glycan degradation potentiates the anticancer immune response in vivo. Nature Chemical Biology. 16 (12), 1376-1384 (2020).
  18. Fernandes, Â, et al. Glycans as shapers of tumour microenvironment: A sweet driver of T-cell-mediated anti-tumour immune response. Immunology. 168 (2), 217-232 (2023).
  19. Togayachi, A., et al. Polylactosamine on glycoproteins influences basal levels of lymphocyte and macrophage activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15829-15834 (2007).
  20. Park, D. D. Resident and elicited murine macrophages differ in expression of their glycomes and glycan-binding proteins. Cell Chemical Biology. 28 (4), 567-582 (2021).
  21. Steinman, R. M. Dendritic cells and immune-based therapies. Experimental Hematology. 24 (8), 859-862 (1996).
  22. Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2 (1), 37-56 (2010).
  23. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
  24. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).
  25. So-Rosillo, R., Small, E. J. Sipuleucel-T (APC8015) for prostate cancer. Expert Review of Anticancer Therapy. 6 (9), 1163-1167 (2006).
  26. Cheever, M. A., Higano, C. S. PROVENGE (Sipuleucel-T) in prostate cancer: The first FDA-approved therapeutic cancer vaccine. Clinical Cancer Research. 17 (11), 3520-3526 (2011).
  27. Videira, P. A., et al. Surface α2-3- and α2-6-sialylation of human monocytes and derived dendritic cells and its influence on endocytosis. Glycoconjugate Journal. 25 (3), 259-268 (2008).
  28. Cabral, M. G., et al. The phagocytic capacity and immunological potency of human dendritic cells is improved by α2,6-sialic acid deficiency. Immunology. 138 (3), 235-245 (2013).
  29. Silva, Z., et al. MHC class I stability is modulated by cell surface sialylation in human dendritic cells. Pharmaceutics. 12 (3), 249 (2020).
  30. Silva, M., et al. Sialic acid removal from dendritic cells improves antigen cross-presentation and boosts anti-tumor immune responses. Oncotarget. 7 (27), 41053-41066 (2016).
  31. Crespo, H. J., et al. Effect of sialic acid loss on dendritic cell maturation. Immunology. 128, 621-631 (2009).
  32. Council of Europe. Guide to the Preparation, Use and Quality Assurance of Blood Components. Council of Europe. , Strasbourg, France. (2017).
  33. LS Columns. Miltenyi Biotec. , Available from: https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/Is-columns.html#130-042-401 (2012).
  34. Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. Isolation and generation of human dendritic cells. Current Protocols in Immunology. 07, Unit 7.32 (2012).
  35. Wu, X., Xu, F., Liu, J., Wang, G. Comparative study of dendritic cells matured by using IL-1β, IL-6, TNF-α and prostaglandins E2 for different time span. Experimental and Therapeutic Medicine. 14 (2), 1389-1394 (2017).
  36. Naeim, F., Nagesh Rao, P., Song, S., Phan, R. Chapter 2 - Principles of Immunophenotyping. Atlas of Hematopathology. , Academic Press. Cambridge, MA. 29-56 (2018).
  37. Cernadas, M., Lu, J., Watts, G., Brenner, M. B. CD1a expression defines an interleukin-12 producing population of human dendritic cells. Clinical and Experimental Immunology. 155, 523-533 (2009).
  38. Santambrogio, L., Strominger, J. L. The ins and outs of MHC class II proteins in dendritic cells. Immunity. 25 (6), 857-859 (2006).
  39. Raposo, C. D., Canelas, A. B., Barros, M. T. Human lectins, their carbohydrate affinities and where to find them. Biomolecules. 11 (2), 188 (2021).
  40. Videira, P. A. Q., et al. Patent WO2017002045. A viable cell population, method for production and uses thereof. Portugal patent. , Universidade NOVA de Lisboa. Lisbon, Portugal. (2017).
  41. Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: Advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. International Journal of Oncology. 20 (2), 247-253 (2002).
  42. Marques, G. S., Silva, Z., Videira, P. A. Antitumor efficacy of human monocyte-derived dendritic cells: Comparing effects of two monocyte isolation methods. Biological Procedures Online. 20, 4 (2018).
  43. Bax, M., et al. Dendritic cell maturation results in pronounced changes in glycan expression affecting recognition by Siglecs and galectins. Journal of Immunology. 179 (12), 8216-8224 (2007).
  44. Chinoy, Z. S., Montembault, E., Moremen, K. W., Royou, A., Friscourt, F. Impacting bacterial sialidase activity by incorporating bioorthogonal chemical reporters onto mammalian cell-surface sialosides. ACS Chemical Biology. 16 (11), 2307-2314 (2021).
  45. Chou, M. -Y., Li, S. -C., Li, Y. -T. Cloning and expression of sialidase L, a NeuAcα2→3Gal-specific sialidase from the leech, Macrobdella decora. Journal of Biological Chemistry. 271 (32), 19219-19224 (1996).
  46. Crespo, H. J., Lau, J. T. Y., Videira, P. A. Dendritic cells: A spot on sialic acid. Frontiers in Immunology. 4, 491 (2013).
  47. Büll, C. Metabolic sialic acid blockade lowers the activation threshold of moDCs for TLR stimulation. Immunology & Cell Biology. 95 (4), 408-415 (2017).
  48. Ohmi, Y., et al. Majority of alpha2,6-sialylated glycans in the adult mouse brain exist in O -glycans: SALSA-MS analysis for knockout mice of alpha2,6-sialyltransferase genes. Glycobiology. 31 (5), 557-570 (2021).
  49. Chung, C., et al. Integrated genome and protein editing swaps α-2,6 sialylation for α-2,3 sialic acid on recombinant antibodies from CHO. Biotechnology Journal. 12 (2), 1600502 (2017).
  50. Hyvärinen, S., Meri, S., Jokiranta, T. S. Disturbed sialic acid recognition on endothelial cells and platelets in complement attack causes atypical hemolytic uremic syndrome. Blood. 127 (22), 2701-2710 (2016).
  51. Powell, L. D., Whiteheart, S. W., Hart, G. W. Cell surface sialic acid influences tumor cell recognition in the mixed lymphocyte reaction. Journal of Immunology. 139, 262-270 (1987).
  52. Corfield, A. P., Higa, H., Paulson, J. C., Schauer, R. The specificity of viral and bacterial sialidases for α(2-3)- and α(2-6)-linked sialic acids in glycoproteins. Biochimica et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology. 744 (2), 121-126 (1983).
  53. Tkachenko, N., Wojas, K., Tabarkiewicz, J., Rolinski, J. Generation of dendritic cells from human peripheral blood monocytes - Comparison of different culture media. Folia Histochemica et Cytobiologica. 43, 25-30 (2005).
  54. Kim, S. J., et al. Human CD141+ dendritic cells generated from adult peripheral blood monocytes. Cytotherapy. 21 (10), 1049-1063 (2019).
  55. Calmeiro, J., et al. In-depth analysis of the impact of different serum-free media on the production of clinical grade dendritic cells for cancer immunotherapy. Frontiers in Immunology. 11, 593363 (2021).
  56. Stamatos, N. M., et al. LPS-induced cytokine production in human dendritic cells is regulated by sialidase activity. Journal of Leukocyte Biology. 88 (6), 1227-1239 (2010).
  57. Lehmann, F., Tiralongo, E., Tiralongo, J. Sialic acid-specific lectins: Occurrence, specificity and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1331-1354 (2006).
  58. Frosch, M., Görgen, I., Boulnois, G. J., Timmis, K. N., Bitter-Suermann, D. NZB mouse system for production of monoclonal antibodies to weak bacterial antigens: Isolation of an IgG antibody to the polysaccharide capsules of Escherichia coli K1 and group B meningococci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (4), 1194-1198 (1985).

Tags

Monocythärledda dendritiska celler sialylerade fenotyper sialinsyror immunsvarsmodulering immunövervakning glykoimmuna kontrollpunkter immunterapier dendritiska celler (DC) antigenpresenterande celler (APC) mognad av DC sialinsyrainnehåll T-cellsaktivering
Generering av monocythärledda dendritiska celler med olika sialylerade fenotyper
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luz, V. C. C., Silva, Z., Sobral,… More

Luz, V. C. C., Silva, Z., Sobral, P., Tanwar, A., Paterson, R. L., Videira, P. A. Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differing Sialylated Phenotypes. J. Vis. Exp. (200), e65525, doi:10.3791/65525 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter