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Neuroscience

वयस्क ज़ेब्राफिश के व्यवहार में फोरब्रेन गतिविधि की दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65526
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1,2
1Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 2Molecular and Cell Biology, Taiwan International Graduate Program, Academia Sinica and Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम वयस्क ज़ेबराफिश के पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क में दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

वयस्क ज़ेब्राफ़िश (डेनियो रेरियो) संज्ञानात्मक कार्यों का अध्ययन करने के लिए व्यवहार का एक समृद्ध प्रदर्शन प्रदर्शित करता है। उनके पास एक लघु मस्तिष्क भी है जिसका उपयोग ऑप्टिकल इमेजिंग विधियों के माध्यम से मस्तिष्क क्षेत्रों में गतिविधियों को मापने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, वयस्क ज़ेबराफ़िश के व्यवहार में मस्तिष्क गतिविधि की रिकॉर्डिंग पर रिपोर्ट दुर्लभ रही है। वर्तमान अध्ययन वयस्क ज़ेबराफिश के पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क में दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग करने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। हम वयस्क ज़ेब्राफ़िश को अपने सिर को हिलाने से रोकने के कदमों पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो स्थिरता प्रदान करता है जो मस्तिष्क गतिविधि की लेजर स्कैनिंग इमेजिंग को सक्षम बनाता है। सिर-नियंत्रित जानवर स्वतंत्र रूप से अपने शरीर के अंगों को हिला सकते हैं और एड्स के बिना सांस ले सकते हैं। प्रक्रिया का उद्देश्य सिर संयम सर्जरी के समय को कम करना, मस्तिष्क की गति को कम करना और दर्ज न्यूरॉन्स की संख्या को अधिकतम करना है। कैल्शियम इमेजिंग के दौरान एक इमर्सिव दृश्य वातावरण प्रस्तुत करने के लिए एक सेटअप भी यहां वर्णित है, जिसका उपयोग नेत्रहीन ट्रिगर व्यवहार ों के अंतर्निहित तंत्रिका सहसंबंधों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड संकेतक या सिंथेटिक रंगों के साथ कैल्शियम फ्लोरेसेंस इमेजिंग गैर-मानव प्राइमेट्स, कृन्तकों, पक्षियों और कीड़ों सहित व्यवहार करने वाले जानवरों में न्यूरोनल गतिविधि को मापने का एक शक्तिशाली तरीका रहाहै। मस्तिष्क की सतह के नीचे लगभग 800 μm तक सैकड़ों कोशिकाओं की गतिविधि को मल्टी-फोटॉन इमेजिंग 2,3 का उपयोग करके एक साथ मापा जा सकता है। आनुवंशिक रूप से परिभाषित न्यूरोनल आबादी में कैल्शियम संकेतक व्यक्त करके विशिष्ट सेल प्रकारों की गतिविधि को भी मापा जा सकता है। छोटे कशेरुक मॉडल के लिए इमेजिंग विधि का अनुप्रयोग मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरोनल गणना के क्षेत्र में नई संभावनाएं खोलता है।

जेब्राफिश तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल सिस्टम है। निषेचन के लगभग 6 दिनों के बाद लार्वा जेब्राफिश का उपयोग उनके लघु मस्तिष्क औरपारदर्शी शरीर के कारण कैल्शियम इमेजिंग के लिए किया गया है। किशोर ज़ेब्राफ़िश (3-4 सप्ताह पुराना) का उपयोग सेंसरिमोटर मार्ग 5,6 के अंतर्निहित तंत्रिका तंत्र का अध्ययन करने के लिए भी किया जाता है। हालांकि, साहचर्य सीखने और सामाजिक व्यवहार सहित जटिल व्यवहारों के लिए अधिकतम प्रदर्शन स्तर, 7,8 वर्ष की आयु में पहुंच जाता है। इस प्रकार, इमेजिंग विधियों का उपयोग करके वयस्क ज़ेब्राफिश के दिमाग में कई संज्ञानात्मक कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। जबकि जेब्राफिश लार्वा और किशोर जेब्राफिश को विवो इमेजिंग में अगारोस में एम्बेडेड किया जा सकता है, 2 महीने या उससे अधिक उम्र की वयस्क ज़ेब्राफ़िश ऐसी स्थितियों में हाइपोक्सिया से पीड़ित होती हैं और शारीरिक रूप से इतनी मजबूत होती हैं कि उन्हें अगारोस द्वारा नियंत्रित नहीं किया जा सकता है। इसलिए, मस्तिष्क को स्थिर करने और जानवर को गलफड़ों के माध्यम से स्वतंत्र रूप से सांस लेने में सक्षम बनाने के लिए एक शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की आवश्यकता होती है।

यहां, हम एक हेड संयम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसमें एकल हेड बार का एक नया डिजाइन शामिल है। 25 मिनट का कम सर्जरी का समय पिछली विधि9 की तुलना में दोगुना तेज है। हम रिकॉर्डिंग कक्ष (अर्ध-हेक्सागोनल टैंक), हेड स्टेज औरदो भागों 9 को संयोजित करने के लिए एक त्वरित-लॉक तंत्र के डिजाइन का भी वर्णन करते हैं। अंत में, नेत्रहीन ट्रिगर मस्तिष्क गतिविधि और व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक इमर्सिव दृश्य उत्तेजना पेश करने के लिए सेटअप भी वर्णित है। कुल मिलाकर, यहां वर्णित प्रक्रियाओं का उपयोग सिर-संयमित वयस्क ज़ेबराफ़िश में आनुवंशिक रूप से परिभाषित सेल आबादी में दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग करने के लिए किया जा सकता है, जिससे विभिन्न व्यवहार प्रतिमानों के दौरान मस्तिष्क की गतिविधियों की जांच सक्षम हो सकती है।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को अकादमिक सिनिका की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार अनुमोदित और किया गया था। अनुसंधान उपकरणों का विवरण सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है।

1. रिकॉर्डिंग कक्ष की तैयारी

  1. एक अर्ध-हेक्सागोनल टैंक, एक बेस प्लेट और एक हेड स्टेज तैयार करें (चित्रा 1 ए; पूरक फाइलें 1-3)। हेड स्टेज में एक गोलाकार प्लेट से जुड़े दो धातु के पद होते हैं। गोलाकार प्लेट में खांचे होते हैं जिन्हें बेस प्लेट पर लॉक किया जा सकता है। एक साथ बंद होने के बाद, हेड स्टेज और बेस प्लेट को सेमी-हेक्सागोनल टैंक के तल पर रखा जाता है।
  2. माइक्रोस्कोप के प्रयोगात्मक मंच पर अर्ध-हेक्सागोनल टैंक रखें। प्लेटफ़ॉर्म को अनुवाद चरण की सीमा को हिट किए बिना एक्स और वाई दिशाओं में स्थानांतरित करने में सक्षम होना चाहिए।
  3. व्यवहार रिकॉर्डिंग के लिए 810 एनएम इन्फ्रारेड (आईआर) प्रकाश और कैमरे को हेड स्टेज पर लक्षित करें। सुनिश्चित करें कि कैमरे के दृश्य का क्षेत्र एक वयस्क ज़ेबराफ़िश को फिट करने के लिए पर्याप्त बड़ा है।
    1. दो-फोटॉन लेजर और दृश्य उत्तेजना को व्यवहार रिकॉर्डिंग में हस्तक्षेप करने से रोकने के लिए, क्रमशः कैमरे के सामने 875 एनएम शॉर्ट-पास फिल्टर और 700 एनएम लॉन्ग-पास फिल्टर स्थापित करें।
  4. दृश्य उत्तेजना पेश करने के लिए, अर्ध-हेक्सागोनल टैंक (चित्रा 1 ए) की तीन दीवारों के आंतरिक पक्ष में बैक-प्रोजेक्शन फिल्मों को संलग्न करें।
  5. टैंक की तीन सतहों पर तीन प्रोजेक्टर को लक्षित करें। तीन छवियों को एक निरंतर दृश्य दृश्य बनाने के लिए संरेखित किया जाना चाहिए। प्रोजेक्टर रोशनी को कैल्शियम फ्लोरेसेंस सिग्नल को दूषित करने से रोकने के लिए, प्रत्येक प्रोजेक्टर के सामने एक तटस्थ घनत्व फ़िल्टर और एक लाल रंग फ़िल्टर (600 एनएम, लॉन्ग-पास) रखें, और फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी) के सामने एक बैंड-पास फ़िल्टर (510/80 एनएम) रखें।

Figure 1
चित्र 1: सिर संयम सर्जरी के लिए आवश्यक उपकरण। (ए) अर्ध-हेक्सागोनल टैंक के अंदर हेड स्टेज की गोलाकार प्लेट और बेस प्लेट के बीच त्वरित-लॉक तंत्र। कस्टम-निर्मित भागों की कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (सीएडी) फाइलें पूरक फाइल 1-4 में पाई जा सकती हैं। (बी) सिर संयम के लिए Ω आकार की हेड बार। (सी) तीन-अक्ष माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग हेड बार को अटैचमेंट साइट पर रखने के लिए किया जाता है। इनसेट: मिट्टी में हेड बार का अभिविन्यास। (डी) सर्जरी के दौरान मछली को पकड़ने के लिए तोप। इनसेट: तोप के भीतर मछली का अभिविन्यास। (ई) मछली लोडिंग मॉड्यूल और माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग मछली को हेड स्टेज पर लोड करने के लिए किया जाता है। इनसेट: मॉड्यूल के भीतर मछली का अभिविन्यास। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. सिर संयम सर्जरी

  1. एक Ω आकार की हेड बार तैयार करें (चित्रा 1 बी; पूरक फाइल 4) जेब्राफिश के सिर को संयमित करने के लिए। ऐसा करने के लिए, तेल-आधारित मॉडलिंग मिट्टी के एक टुकड़े को तीन-अक्ष माइक्रोमैनिपुलेटर से संलग्न करें। सुनिश्चित करें कि मिट्टी सिर बार को पकड़ने के लिए पर्याप्त ठोस है, लेकिन सिर संयम के बाद हेड बार से अलग होने के लिए पर्याप्त नरम है।
  2. मिट्टी में हेड बार की एक बांह डालें और हेड बार को क्षैतिज रूप से उन्मुख करें (चित्रा 1 सी)। यह सुनिश्चित करेगा कि ज़ेबराफिश पर हेड बार का बाद का लगाव स्तर होगा।
    नोट: हेड बार टाइटेनियम (24 मिलीग्राम) या स्टेनलेस स्टील (43 मिलीग्राम) से बना हो सकता है और कई प्रयोगों के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है। हेड बार सामग्री सिर संयम के तहत वयस्क ज़ेब्राफिश (वजन 300-1,000 मिलीग्राम से होता है) के व्यवहार को प्रभावित नहीं करती है।
  3. सर्जरी के दौरान मछली के शरीर को पकड़ने के लिए तोप, एक खोखली ट्यूब तैयार करें (चित्रा 1 डी)।
  4. मछली टैंक के पानी में 0.03% और 0.01% ट्राइकेन मीथेनसल्फोनेट (टीएमएस; सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें। इसका उपयोग सर्जरी के दौरान मछली को बेहोश अवस्था में एनेस्थेटाइज करने और बनाए रखने के लिए किया जाएगा।
  5. खोपड़ी पर अनुलग्नक स्थलों से अतिरिक्त त्वचा और पानी को हटाने के लिए चार ऊतक स्वैब तैयार करें। प्रत्येक स्वैब तैयार करने के लिए, एक पेपर टॉवल को 3 सेमी वर्ग में काटें और ट्यूब जैसी संरचना बनाने के लिए इसके विकर्ण के साथ मोड़ें। ट्यूब के सिरों को एक बारीक बिंदु में मोड़ें। अनुलग्नक स्थल बहुत छोटा है, इसलिए एक अच्छा बिंदु स्वैब के बेहतर नियंत्रण की अनुमति देता है।
  6. माइक्रोमैनिपुलेटर (चित्रा 1 ई) के लिए एक मछली लोडिंग मॉड्यूल तैयार करें।
    नोट: मॉड्यूल में दो स्टील पोस्ट होते हैं जो एक राइट-एंगल पोस्ट क्लैंप द्वारा एक साथ रखे जाते हैं। एक पोस्ट माइक्रोमैनिपुलेटर से जुड़ी होती है, जबकि दूसरी पोस्ट में एक घूर्णन पोस्ट क्लैंप होता है जो मछली को ले जाता है। मॉड्यूल का उपयोग मछली को ठीक नियंत्रण के साथ सिर के मंच पर रखने के लिए किया जाता है। घूर्णन पोस्ट क्लैंप मछली के पिच कोण को बदलने के लिए पिच एडजस्टर के रूप में कार्य करता है।
  7. मछली टैंक के पानी में 0.03% टीएमएस के साथ मछली को एनेस्थेटाइज करें। निम्नलिखित चरणों के दौरान, मछली के टैंक के पानी में 0.01% टीएमएस को हर 90 सेकंड में छोटी दालों में मुंह तक पहुंचाने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें। छिड़काव से पानी का प्रवाह गिल आंदोलन को प्रेरित करना चाहिए। यह सर्जरी के दौरान मछली को 40 मिनट से अधिक समय तक जीवित रहने की अनुमति देगा।
    नोट: टीजी [न्यूरोडी: जीसीएएमपी 6 एफ] का उपयोग लार्वा और वयस्क दोनों चरणों10 में फोरब्रेन में कैल्शियम संकेतक की व्यापक अभिव्यक्ति के कारण किया जाता है।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, सर्जरी में अवधि के दौरान मुंह को निरंतर पानी का प्रवाह प्रदान करने के लिए गुरुत्वाकर्षण छिड़काव का उपयोग करें जहां दोनों हाथ भरे हुए हैं।
  8. मछली को एक कैप्सूल (चित्रा 2 ए) में लपेटें जो मछली को तोप के अंदर रखता है।
    1. एनेस्थेटाइज्ड मछली को नम कागज के ऊतक के एक टुकड़े में लपेटें जो पूंछ की नोक से शुरू होकर गिल तक लगभग 1 मिमी पुच्छल तक होता है। सुनिश्चित करें कि मछली को ऊतक से बाहर फिसलने से रोकने के लिए रैपिंग तंग है।
    2. पूंछ के अंत से लगभग 2 मिमी पुच्छल से गिल तक मछली को कवर करने के लिए पेपर ऊतक के चारों ओर एक अनुदैर्ध्य स्लिट (जैसे, एक मध्यम आकार की गर्मी-सिकुड़ने वाली टयूबिंग कटी हुई) के साथ एक नरम प्लास्टिक टयूबिंग लपेटें। टयूबिंग यह सुनिश्चित करती है कि सर्जरी के दौरान मछली का शरीर सीधा रहे।
    3. टयूबिंग के चारों ओर एक पेपर तौलिया लपेटें जो मोटे तौर पर तोप के व्यास के समान हो।
    4. पेपर टॉवल के चारों ओर प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट के बल्ब से काटी गई एक नरम प्लास्टिक ट्यूब लपेटें। यह सुनिश्चित करता है कि कैप्सूल को तोप में आसानी से लोड किया जा सकता है।
    5. मछली को तोप में लोड करें।
  9. अनुलग्नक साइटों को कवर करने वाली त्वचा को हटाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें, खोपड़ी के दो त्रिकोणीय क्षेत्रों को सेरिबैलम के ऊपर और गलफड़ों के ऊपर (चित्रा 2 बी), फिर अनुलग्नक साइटों के बीच के क्षेत्र को कवर करने वाली त्वचा को हटा दें। अनुलग्नक साइटों को सूखने और किसी भी शेष त्वचा को साफ करने के लिए ऊतक स्वैब का उपयोग करें।
    1. त्वचा हटाने के दौरान सिर का समर्थन करने के लिए एक समायोज्य मंच का उपयोग करें, लेकिन ऑपरेशन के दौरान आंखों की चोट से बचने के लिए मंच को आंखों से संपर्क नहीं करना चाहिए।
      नोट: अनुलग्नक स्थलों पर त्वचा का पूरी तरह से निष्कासन इमेजिंग के दौरान गति कलाकृतियों को कम करने में महत्वपूर्ण है।
  10. 10 μL पिपेट टिप का उपयोग करके प्रत्येक अनुलग्नक साइट के केंद्र में ऊतक गोंद ( सामग्री की तालिका देखें) की एक बूंद लागू करें।
    नोट: ऊतक गोंद अनुलग्नक साइटों को कवर करता है और जल्दी से सूख जाता है। ऊतक गोंद खोपड़ी और दंत सीमेंट के बीच एक बंधन इंटरफ़ेस प्रदान करता है जिसका उपयोग हेड बार को गोंद करने के लिए किया जाता है, और गलफड़ों से पानी को अनुलग्नक स्थल तक पहुंचने से रोकता है।
  11. मछली के शरीर को एक सीधी स्थिति में रखें और हेड बार को थोड़ा ऊपर रखें और हेड बार चिपकाने की तैयारी में अटैचमेंट साइटों पर पुच्छल रखें।
  12. दंत सीमेंट तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें) और सिर बार को खोपड़ी से चिपकाने के लिए तुरंत इसका उपयोग करें (चित्रा 2 सी)। प्रक्रिया समय के प्रति संवेदनशील है और 45 सेकंड के भीतर किया जाना चाहिए।
    1. एक छोटे चम्मच बहुलक को त्वरित मोनोमर की चार बूंदों और उत्प्रेरक V की एक बूंद के साथ मिलाएं। मिश्रण को 15 सेकंड के लिए समान रूप से हिलाएं।
    2. संलग्नक साइटों और साइटों के बीच के क्षेत्र पर मिश्रण को लागू करने के लिए एक माइक्रोपिपेट और 10 μL पिपेट टिप का उपयोग करें। गलफड़े और आंखों को ढंकने से बचें।
    3. माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके सीमेंट पर हेड बार को धीरे से दबाएं। शेष सीमेंट के साथ हेड बार को कवर करें।
    4. दंत सीमेंट के इलाज की अनुमति देने के लिए 12 मिनट तक प्रतीक्षा करें। सीमेंट के साथ पानी के संपर्क से बचें।
  13. कैल्शियम इमेजिंग के लिए फोरब्रेन तक ऑप्टिकल पहुंच में सुधार करने के लिए, टेलेसेफ्लोन के ऊपर की त्वचा को हटा दें। स्केलपेल (चित्रा 2 डी) का उपयोग करके पांच कट के साथ त्वचा को हटाने को 3 मिनट में किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि खोपड़ी की सतह का पालन करने वाली लिपिड बूंदों को हटा दिया जाता है।
  14. ठीक होने के बाद, मिट्टी को हेड बार से हटा दें।
  15. माइक्रोमैनिपुलेटर के मछली लोडिंग मॉड्यूल में तोप से पूरे कैप्सूल को पिच एडजस्टर में स्थानांतरित करें।
  16. मछली को स्थिति में रखने के लिए माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करें। हेड बार को हेड स्टेज के धातु पदों के शीर्ष पर स्थित किया जाना चाहिए। मछली के पिच कोण को थोड़ा बढ़ाएं ताकि दो-फोटॉन इमेजिंग के दौरान फोरब्रेन की सतह को ऑप्टिकल प्लेन से बेहतर संरेखित किया जा सके।
  17. पराबैंगनी (यूवी) -इलाज योग्य गोंद के साथ धातु के पदों पर हेड बार को गोंद दें। इलाज के लिए 15 एस यूवी एक्सपोजर पर्याप्त है।
  18. कैप्सूल से मछली को बाहर निकालें और अर्ध-हेक्सागोनल टैंक के भीतर बेस प्लेट पर सिर के चरण को लॉक करें।
  19. मछली के टैंक के पानी में जानवर को डुबोएं। मछली को सांस लेना शुरू करना चाहिए और 1-2 मिनट के भीतर संज्ञाहरण से ठीक हो जाना चाहिए।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, मुंह में ताजा पानी पहुंचाने के लिए सिरिंज छिड़काव का उपयोग करें।

Figure 2

चित्रा 2: सिर संयम सर्जरी के दौरान महत्वपूर्ण कदम । (ए) तोप के अंदर कैप्सूल की संरचना। (बी) खोपड़ी पर अनुलग्नक स्थल (लाल)। लाल तीर रक्त वाहिका साइटों को निर्दिष्ट करते हैं। (सी) शीर्ष: मछली की खोपड़ी से जुड़ी हेड बार। नीचे: मछली सिर के मंच पर लोड की जाती है। (डी) अग्रमस्तिष्क के ऊपर की त्वचा को हटाने के लिए आवश्यक कट। संख्याएं काटने के अनुक्रम को दर्शाती हैं। जानवर के रक्तस्राव को रोकने के लिए चिह्नित साइट (तीर) पर त्वचा हटाने से बचें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. दो-फोटॉन इमेजिंग

  1. लेजर चालू करें और बिजली को स्थिर करने के लिए 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें। नमूने पर तरंग दैर्ध्य को 920 एनएम और शक्ति को लगभग 50 किलोवाट पर सेट करें।
    नोट: अनुनाद स्कैनर द्वारा नियंत्रित लेजर बीम स्कैन पथ के टर्नअराउंड बिंदुओं पर धीरे-धीरे चलता है। ऊतक क्षति को रोकने के लिए, टर्नअराउंड बिंदुओं पर लेजर शक्ति को कम करने के लिए एक पोकेल्स सेल का उपयोग किया जाता है।
  2. प्रयोगात्मक मंच पर हेड-संयमित ज़ेब्राफिश वाले रिकॉर्डिंग कक्ष को रखें (चित्रा 3 ए)। प्लेटफ़ॉर्म को अनुवाद चरण की सीमा को हिट किए बिना एक्स और वाई दिशाओं में स्थानांतरित करने में सक्षम होना चाहिए।
  3. ऑब्जेक्टिव लेंस को फोरब्रेन सतह के जितना संभव हो उतना करीब रखें। उद्देश्य लेंस को पुतली के सामने के किनारे पर लक्षित किया जाना चाहिए (चित्रा 3 बी)।
  4. लेजर शटर खोलें और पीएमटी को सक्षम करें। धीरे-धीरे उद्देश्य लेंस (~ 1 मिमी) को ऊपर उठाएं जब तक कि प्रतिदीप्ति छवि (चित्रा 3 सी) में पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क प्रकट न हो जाए।
  5. दर्ज किए गए न्यूरॉन्स की संख्या बढ़ाने के लिए, कई गहराई (छह छवि विमान, 15 μm अलग) पर छवियों को प्राप्त करने के लिए एक पीजो एक्ट्यूएटर का उपयोग करें। यह फ्रेम दर की कीमत पर डेटा उपज में वृद्धि करेगा। पीजो एक्ट्यूएटर को नियंत्रित करने के लिए तेज जेड-अक्ष स्कैनिंग सक्षम करें (समान मोड, स्लाइस की संख्या = 6, चरण आकार = 15 μm, तरंग = सॉटूथ, फ्लाईबैक समय = 4 एमएस, एक्ट्यूएटर लैग = 8 एमएस)।
  6. व्यवहार रिकॉर्डिंग के लिए, टैंक के दोनों किनारों पर 810 एनएम इन्फ्रारेड (आईआर) रोशनी चालू करें। पूरे शरीर को रोशन करने के लिए कोण को समायोजित करें, जो कैमरे में स्पष्ट रूप से दिखाई देना चाहिए।
  7. प्रोजेक्टर चालू करें।
  8. डेटा रिकॉर्ड करना प्रारंभ करें.

Figure 3
चित्रा 3: कैल्शियम इमेजिंग, व्यवहार रिकॉर्डिंग, और दृश्य उत्तेजना प्रदर्शन करने के लिए सेटअप। (ए) तीन प्रोजेक्टर अर्ध-हेक्सागोनल टैंक की दीवारों पर एक दृश्य उत्तेजना प्रस्तुत करते हैं। साइड में आईआर लाइट्स का उपयोग जेब्राफिश के शरीर को रोशन करने के लिए किया जाता है। (बी) उद्देश्य लेंस की स्थिति। बाएं: सामने का दृश्य। दाएं: साइड व्यू। 16x उद्देश्य लेंस और लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र के बीच की दूरी लगभग 2.5 मिमी है। बाएं: टीजी में पूरे पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क का अधिकतम प्रक्षेपण[न्यूरोडी: जीसीएएमपी 6 एफ]। दाएं: कई मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन्स को प्रकट करने के लिए ज़ूम-इन छवि। इनसेट: एक अलग मस्तिष्क क्षेत्र से एक उच्च आवर्धन। छवियां 5 Hz पर रिकॉर्ड किए गए 10 s डेटा का औसत हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

प्रोटोकॉल में दो भाग होते हैं: सिर संयम सर्जरी और फोरब्रेन में न्यूरोनल गतिविधियों की दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग। सर्जरी की सफलता को जानवर के अस्तित्व और सिर संयम की स्थिरता से परिभाषित किया गया है। सर्जरी के दौरान मुंह के माध्यम से 0.01% टीएमएस समाधान के लगातार छिड़काव से जीवित रहने की दर में काफी सुधार किया जा सकता है। मछली को संज्ञाहरण से ठीक होना चाहिए और मछली के टैंक के पानी में डूबने के बाद 1-2 मिनट के भीतर सक्रिय रूप से सांस लेनी चाहिए। दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग बरकरार खोपड़ी (~ 40 μm मोटाई) के माध्यम से मस्तिष्क की सतह से 200 μm तक की गहराई पर पृष्ठीय अग्रमस्तिष्क में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की गतिविधि रिकॉर्डिंग को सक्षम बनाता है। इस इमेजिंग रेंज में पृष्ठीय टेलेसेफ्लोन (डी) के कई क्षेत्र शामिल हैं, जिसमें मेडियल ज़ोन (डीएम), केंद्रीय क्षेत्र (आरडीसी) का रोस्ट्रल हिस्सा, केंद्रीय क्षेत्र (सीडीसी) का पुच्छल हिस्सा और पार्श्व क्षेत्र (डीएल) शामिल हैं। साथ में वे वयस्क ज़ेबराफिश में टेलेन्सेफ्लोन का 30% बनाते हैं (चित्र 3 सी)। पीज़ो एक्ट्यूएटर का उपयोग करके वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग के साथ, हम आम तौर पर डीएल या सीडीसी में 150 न्यूरॉन्स की गतिविधि को रिकॉर्ड करते हैं, और टीजी में डीएम और आरडीसी में 300 न्यूरॉन्स [न्यूरोडी: जीसीएएमपी 6 एफ] 10। मस्तिष्क इमेजिंग के दौरान एक साथ व्यवहार रिकॉर्डिंग की जाती है, जो मोटर आउटपुट (चित्रा 4) के न्यूरोनल सहसंबंधों की पहचान को सक्षम बनाती है।

दो-फोटॉन इमेजिंग के दौरान, पूंछ आंदोलनों को छवि में एक दृश्य गति विरूपण साक्ष्य को प्रेरित नहीं करना चाहिए। अत्यधिक संघर्ष के दौरान एक छोटी (<1 μm) और क्षणिक गति देखी जा सकती है। ये गतियां आमतौर पर प्रतिवर्ती होती हैं, इसलिए इमेजिंग को बाद में जारी रखा जा सकता है। हम पार्श्व और अक्षीयदिशाओं में एक धीमी बहाव (<1 μm min-1) भी देखते हैं। अक्षीय नमूना बहाव के कारण न्यूरॉन्स के नुकसान को रोकने के लिए, हम आम तौर पर हमारे इमेजिंग सत्र को 10 मिनट तक सीमित करते हैं। कैल्शियम संकेतक का फोटोब्लीचिंग निर्दिष्ट लेजर पावर के तहत 10 मिनट इमेजिंग सत्र के बाद नहीं देखा जाना चाहिए।

Figure 4
चित्रा 4: वयस्क ज़ेब्राफिश में व्यवहार ट्रैकिंग और तंत्रिका गतिविधि पैटर्न। (ए) व्यवहार की कैमरा रिकॉर्डिंग का एक उदाहरण फ्रेम (वेंट्रल व्यू)। (बी) फोरब्रेन न्यूरॉन्स की गतिविधि (एफ, ब्लैक) और पूंछ आंदोलन तीव्रता (नीला)। पूंछ आंदोलन की तीव्रता को क्रमिक वीडियो फ्रेम के बीच पूर्ण पिक्सेल-वार अंतर के माध्यम से निर्धारित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: आधार प्लेट का डिजाइन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: परिपत्र प्लेट का डिजाइन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: अर्ध-हेक्सागोनल टैंक का डिजाइन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 4: हेड बार का डिजाइन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: समस्या निवारण विवरण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यहां, हम दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग के लिए वयस्क ज़ेबराफिश के सिर को रोकने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। सिर संयम प्राप्त करने के लिए दो महत्वपूर्ण कदम हैं जो लेजर स्कैनिंग इमेजिंग के लिए पर्याप्त स्थिर हैं। सबसे पहले, हेड बार को खोपड़ी के विशिष्ट अनुलग्नक स्थलों से चिपकाया जाना चाहिए। खोपड़ी के अन्य भाग अक्सर यांत्रिक स्थिरता प्रदान करने के लिए बहुत पतले होते हैं और यहां तक कि मजबूत शरीर आंदोलनों के दौरान फ्रैक्चर भी हो सकते हैं। दूसरा, अनुलग्नक साइटों के ऊपर की त्वचा को अच्छी तरह से हटा दिया जाना चाहिए। अवशिष्ट पानी को भी अच्छी तरह से सुखाया जाना चाहिए। यह खोपड़ी को ऊतक गोंद से कसकर बांधने की अनुमति देता है। एक तालिका जो संभावित समस्याओं, उनके कारणों और समाधानों को सूचीबद्ध करती है, प्रदान की जाती है (पूरक तालिका 1)।

जेब्राफिश फोरब्रेन की घुमावदार ज्यामिति के कारण, उत्तेजना बीम और परिणामी उत्सर्जन इमेजिंग प्लेन में मस्तिष्क के ऊतकों की विभिन्न मोटाई के माध्यम से यात्रा करते हैं। इस प्रकार, एक ऑप्टिकल खंड के भीतर चित्रित न्यूरॉन्स की प्रतिदीप्ति मस्तिष्क सीमा से न्यूरॉन की दूरी के आधार पर भिन्न होती है। यह एक रिकॉर्डिंग सत्र के भीतर कम डेटा उपज की ओर जाता है। डीएल और सीडीसी (चित्रा 3 सी) की इमेजिंग करते समय समस्या विशेष रूप से गंभीर है। यहां, हम कई अक्षीय स्थितियों में रिकॉर्डिंग करने के लिए एक पीजो एक्ट्यूएटर का उपयोग करते हैं, जो फ्रेम दर से समझौता करते हैं लेकिन दर्ज न्यूरॉन्स की संख्या में वृद्धि करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, जैसा कि कई अक्षीय पदों पर न्यूरोनल गतिविधियों को एक ही व्यवहार सत्र के भीतर दर्ज किया जाता है, डेटा में कई व्यवहार सत्रों से दर्ज गतिविधि डेटा की तुलना में उच्च सांख्यिकीय शक्ति होती है। वैकल्पिक रूप से, तीन-फोटॉन इमेजिंग2 और अनुकूली प्रकाशिकी11 गहरे ऊतकों में न्यूरोनल गतिविधियों को रिकॉर्ड कर सकते हैं और उच्च वक्रता समस्या को आराम दे सकते हैं। हालांकि, तीन-फोटॉन लेजर की पुनरावृत्ति दर और खोपड़ी की हेटरोजेनस संरचना पर विचार किया जाना चाहिए।

पिछलेतरीकों 9,12 की तुलना में जो सिर को स्थिर करने के लिए कई धातु भागों का उपयोग करते हैं, वर्तमान दृष्टिकोण ने Ω आकार के सिर बार के एकल टुकड़े का उपयोग करके एक महत्वपूर्ण सुधार किया है। यह सरलीकृत डिजाइन सर्जरी के समय को 50% तक कम कर देता है। प्रोटोकॉल सीखना भी आसान है और आमतौर पर प्रशिक्षण के 2 सप्ताह के भीतर महारत हासिल की जा सकती है। यद्यपि पिछले प्रोटोकॉल9 की तुलना में सर्जरी का समय काफी हद तक कम हो गया है, हमने सिर संयम के तहत जीवित रहने की दर और न ही व्यवहार में स्पष्ट अंतर नहीं देखा। उदाहरण के लिए, समय की अवधि जिसके दौरान जानवर माइक्रोस्कोप के तहत सक्रिय रहता है, समान है (3-8 घंटे, जानवर के आधार पर)। सर्जरी के बाद एनेस्थीसिया से जागने के लिए जानवर को आवश्यक समय की मात्रा भी समान है (1-2 मिनट)। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली ट्रांसजेनिक लाइन10 में एक एकल ट्रांसजेन शामिल है जो लार्वा चरण से वयस्कता तक अग्रमस्तिष्क में कैल्शियम संकेतक को एन्कोड करता है, जो पिछले अध्ययन12 में उपयोग किए गए ट्रिपल ट्रांसजेनिक लाइन की अभिव्यक्ति समयरेखा के समान है।

वर्तमान में, प्रोटोकॉल में निम्नलिखित सीमाएँ हैं। सबसे पहले, न्यूरोनल गतिविधि को दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके मस्तिष्क की सतह से 200 μm तक की गहराई पर खोपड़ी के माध्यम से चित्रित किया जा सकता है। विभिन्न गहराई पर छवि की गुणवत्ता पहले 9,12 निर्धारित की गई है। ये इमेजिंग गहराई पृष्ठीय फोरब्रेन क्षेत्रों डीएम, डीसी और डीएल तक पहुंच की अनुमति देती है, लेकिन संभावित रूप से वयस्क ज़ेबराफिश में वेंट्रल फोरब्रेन क्षेत्रों वीवी, वीएस, वीपी और वीडी को बाहर करती है। इसके अलावा, मिडब्रेन और हिंडब्रेन के बहुमत तक ऑप्टिकल पहुंच हेड बार और डेंटल सीमेंट की उपस्थिति से बाधित होती है। इन मस्तिष्क क्षेत्रों में इमेजिंग करने के लिए प्रोटोकॉल में अतिरिक्त संशोधनों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, हम आमतौर पर महत्वपूर्ण नमूना बहाव को रोकने के लिए एक इमेजिंग सत्र को 10 मिनट तक सीमित करते हैं। बहाव का संभावित कारण जोरदार पूंछ आंदोलनों के बाद खोपड़ी और ऊतक गोंद के बीच संबंध का कमजोर होना है। यदि लंबे रिकॉर्डिंग सत्रों की आवश्यकता होती है, तो 3 डी छवि पंजीकरण के बाद छोटे अक्षीय चरणों के साथ वॉल्यूमेट्रिक इमेजिंग की जा सकती है।

यह हेड संयम प्रोटोकॉल भविष्य के कई अनुप्रयोगों को खोलता है। सबसे पहले, दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग, ऑप्टोजेनेटिक जोड़तोड़, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, या यहां तक कि अल्ट्रासाउंड इमेजिंग विवो में किया जा सकता है। तीन-फोटॉन इमेजिंग के साथ, पूरे फोरब्रेन में न्यूरोनल गतिविधि भी दर्ज की जा सकतीहै। इसके अलावा, हेड बार के दो सिरों को विपरीत रूप से पकड़ने और छोड़ने के लिए एक यांत्रिक उपकरण का निर्माण किया जा सकता है, जो दिनों में तंत्रिका गतिविधि और सर्किट आकृति विज्ञान की अनुदैर्ध्य जांच को सक्षम बनाता है। अंत में, हमारे द्वारा वर्णित दृश्य प्रदर्शन सेटअप जानवर को दृश्य का 180 ° क्षैतिज क्षेत्र प्रदान करता है। सेटअप का उपयोग एक इमर्सिव आभासी वास्तविकता वातावरण बनाने के लिए किया जा सकता है जो सिर-संयमित मछली9 के साथ बातचीत करता है। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल वयस्क ज़ेब्राफिश के व्यवहार के पैलियम में न्यूरोनल आबादी की गतिविधि माप को सक्षम बनाता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम को आणविक जीव विज्ञान संस्थान, एकेडेमिया सिनिका, और राष्ट्रीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी परिषद, ताइवान द्वारा समर्थित किया गया था। भौतिकी संस्थान, एकेडेमिया सिनिका में मशीन शॉप ने कस्टम-डिज़ाइन किए गए भागों को बनाने में मदद की। हम हेड स्टेज के त्वरित-लॉक तंत्र के डिजाइन के लिए पी आर्गास्ट (फ्रेडरिक मिशर इंस्टीट्यूट फॉर बायोमेडिकल रिसर्च, बेसल, स्विट्जरलैंड) को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acquisition card MBF Bioscience Vidrio vDAQ Microscope
Back-projection film Kimoto Diland screen - GSK present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm) Chroma ET510/80m Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank custom made see supplemental files recording chamber
Camera filter (<875 nm) Edmund optics #86-106 Behavior recording
Camera filter (>700 nm) Edmund optics #43-949 Behavior recording
Camera lens Thorlabs MVL50M23 Behavior recording
Chameleon Vision-S Coherent Vision-S Laser
Circular plate for the head stage custom made see supplemental files recording chamber
Controller for piezo actuator Physik Instrumente  E-665. CR Microscope
Current amplifier Thorlabs TIA60 Microscope
Elitedent Q-6 Rolence Enterprise Q-6 Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm Chroma ET510/80m Microscope
Head bar custom made see supplemental files recording chamber
Infrared light Thorlabs M810L3 Behavior recording
LED projector AAXA P2B LED Pico Projector present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe) Kimtech Science 34155 Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage Zaber X-LRM050 Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission) Thorlabs NE203B present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder ThorLabs PH1.5V Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post ThorLabs TR150/M Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA Nikon CF175 Microscope
Oil-based modeling clay Ly Hsin Clay C4086 Surgery: head bar holder
Optical adhesive Norland Products NOA68 Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube Hamamatsu H11706P-40 Microscope
Piezo actuator Physik Instrumente  P-725.4CA PIFOC Microscope
Pockels Cell Conoptics M350-80-LA-BK-02 Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm) Edmund optics #53-699 present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System INSS RGE-02 Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post ThorLabs RA90/M Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post ThorLabs SWC/M Surgery: fish loading module
ScanImage MBF Bioscience Basic version Microscope
Semi-hexagonal tank custom made see supplemental files recording chamber
Super-Bond C&B Kit Sun Medical Co. Super-Bond C&B Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate Sigma Aldrich E10521 Surgery: anesthetic
USB Camera FLIR BFS-U3-13Y3M-C Behavior recording
Vetbond 3M 1469SB Surgery: tissue glue

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 197 वयस्क ज़ेबराफ़िश व्यवहार संज्ञानात्मक कार्य ऑप्टिकल इमेजिंग विधियां मस्तिष्क गतिविधि रिकॉर्डिंग पृष्ठीय फोरब्रेन हेड संयम सर्जरी न्यूरॉन रिकॉर्डिंग इमर्सिव दृश्य वातावरण नेत्रहीन ट्रिगर व्यवहार
वयस्क ज़ेब्राफिश के व्यवहार में फोरब्रेन गतिविधि की दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग
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Bandonil, J. S., Liao, Y. H., Fathi, … More

Bandonil, J. S., Liao, Y. H., Fathi, A., Huang, K. H. Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (197), e65526, doi:10.3791/65526 (2023).

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