Summary
I detta protokoll diskuterar vi implementeringen av en modell för framgångsrik ortotopisk levertransplantation (OLT) i möss. Dessutom diskuteras adjuvans för att ytterligare analysera allograftpatency efter framgångsrik OLT i en mus, särskilt med hjälp av mikrodatortomografi (microCT) skanningar.
Abstract
Mikrodatortomografi (microCT) angiografi är en ovärderlig resurs för forskare. Nya framsteg inom denna teknik har gjort det möjligt att få högkvalitativa bilder av mikrovaskulatur och är högupplösta verktyg inom området organtransplantation. I denna modell av ortotopisk levertransplantation (OLT) på möss ger mikroCT möjlighet att utvärdera allograftanastomos i realtid och har den extra fördelen att man inte behöver offra försöksdjur. Valet av kontrast, liksom inställningarna för bildtagning, skapar en högupplöst bild, vilket ger forskarna ovärderlig information. Detta gör det möjligt att utvärdera de tekniska aspekterna av proceduren samt potentiellt utvärdera olika terapier under en längre tidsperiod. I detta protokoll beskriver vi stegvis en OLT-modell i möss och beskriver slutligen ett mikroCT-protokoll som kan ge bilder av hög kvalitet, vilket hjälper forskare att djupanalysera transplantation av solida organ. Vi ger en steg-för-steg-guide för levertransplantation i en mus, samt diskuterar kortfattat ett protokoll för att utvärdera transplantatets patens genom mikroCT-angiografi.
Introduction
Transplantation är den enda effektiva behandlingen för leversjukdom i slutstadiet. Nyttan av levertransplantation är onekligen utmärkt, med en medianöverlevnad på 11,6 år jämfört med 3,1 år på väntelistan1. Det finns dock betydande begränsningar som begränsar en bred tillämpning av levertransplantation, och viktigast av allt, bristen på lämpliga donatororgan av hög kvalitet. En utvidgning av donatororganpoolen kommer därför att kräva innovativa strategier som möjliggör användning av transplantat som för närvarande anses olämpliga i dag, vilket ökar säkerhetsmarginalen för transplantation. För att förbättra tillgången till levertransplantation är det därför absolut nödvändigt att genomföra prekliniska studier på smådjur.
Särskilt viktiga för transplantationsforskningen är in vivo-modeller av transplantation. Ortotopisk levertransplantation (OLT) har funnits i nästan 30 år2 och är avgörande för att studera många aspekter av transplantation, inklusive karakterisering av immunsvar, ischemi-reperfusionsskada, akut avstötning, terapeutiska effekter av nya läkemedel och långtidsöverlevnad 3,4,5,6,7. Användningen av möss för att studera transplantation är avgörande eftersom det möjliggör användning av transgena muslinjer för att studera effekten av specifika molekylära vägar på resultaten av transplantation. Etablerade protokoll för levertransplantation hos möss har beskrivits väl tidigare 8,9.
Det finns flera metoder för anastomoser för supra- och infralevern inferior vena cava (IVC), portvenen (PV) och den gemensamma gallgången (CBD). De förlitar sig vanligtvis på antingen handanastomos eller en modifierad vaskulär manschettteknik som liknar murin lungtransplantation 10,11,12. Ett viktigt steg i den långsiktiga studien och överlevnaden av mottagarmössen, samt utvecklingen av ett hållbart levertransplantationsprogram för möss, är möjligheten att utvärdera dessa kritiska anastomoser. Bildmetoder för att utvärdera leverallograftpatency förlitar sig ofta på ultraljud och datortomografi (CT) i den kliniska miljön13,14. CT har en klar fördel jämfört med ultraljud eftersom det kan erbjuda bilder av hela buken för att inkludera varje anastomos, även om det kan vara särskilt svårt att få dessa bilder med ultraljud hos små djur. Betydande forskning och resurser har ägnats åt att utveckla korrekt mikroCT i syfte att förbättra djurstudier och den information vi kan samla in från dessa modeller av skador och sjukdomar 15,16. Här beskriver vi ett protokoll för ortotopisk muslevertransplantation (Figur 1) och beskriver kortfattat ett protokoll för mikroCT för att utvärdera allograftpatency och varaktighet av anastomoser.
Protocol
Hanmöss av typen C57BL/6J (30 g kroppsvikt) inhystes under patogenfria förhållanden på Nationwide Children's Hospital Animal Facility. Alla procedurer utfördes humant i enlighet med NIH och National Research Council's Guide for the Humane Care and Use of Laboratory Animals och med godkännande av Nationwide Children's Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC Protocol AR17-00045). Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material, instrument och utrustning som används i detta protokoll.
1. Initialt upplägg för transplantationskirurgi
- Ställ in kirurgiska enheter.
- Ställ in kirurgiska övervakningsenheter (t.ex. pulsövervakningsenhet, puls-ox, modulärt monitorsystem) och anestesimaskiner.
- Om tillgängligt, slå på den kirurgiska värmebrädan till 42 °C.
- Se till att ventilations- och anestesimaskiner är påslagna för att värma isofluranförångaren. Fyll anestesibehållaren med 30 ml flytande isofluran och se till att ventilatormaskinen är ansluten till syrgasen.
OBS: I detta protokoll intuberar vi inte djuret; Använd endast en näskon för syresättning.
- Anteckna kroppsvikten för mottagarens och donatormössen.
- Slå på det kraftfulla kirurgiska mikroskopet och justera höjden och fokus efter kirurgens önskemål. Se till att de återstående kirurgiska enheterna är påslagna (dvs. diatermianordning).
- Förbered och lägg ut kirurgiska instrument, samt kirurgiska band av 10-0 nylon (Figur 2).
OBS: Alla kirurgiska instrument autoklaverades vid 121 °C i 30 minuter. Dessutom kan olika konfigurationer av kirurgiska instrument vara lika effektiva. - Förbered manschetterna för portalvenstenten (PV) och den gemensamma gallgången (CBD) (Figur 3). Placera angiokatetern, liksom PE10, på en steril yta under högeffektsmikroskopet. Använd ett kirurgiskt blad #11 och skär angiokatetern så att den bildar en 1.5 mm lång manschett med en flik cirka 0.75 mm högst upp på manschettkroppen; kapa polyetenslangen (PE10) till 2.5 mm längd. Förvara manschetterna och stenten i steril koksaltlösning tills de ska användas.
OBS: Denna transplantationsmodell använder en 20 G angiokateter för att göra manschetter för PV-rekonstruktion, samt en polyetenslang 10 (PE10) för rekonstruktion av CBD. Alla andra anastomoser är handsydda. - Förbered lösningar. Förbered en heparininjektion som kommer att levereras vid 100 U i 0,5 ml histidin-tryptofan-ketoglutarat (HTK) lösning. Förvara saltlösning, heparin-saltlösning, PBS och HTK-konserveringslösning på is.
2. Anskaffning av donatormöss
- Inducera anestesi i donatormusen genom att placera den i en inhalationskammare för isofluran. Se till att isoflurankoncentrationen är cirka 2,5 % med ett syreflöde på 2 ml/min. Vänta 5 minuter tills ett kirurgiskt anestesiplan utvecklas. För att säkerställa rätt nivå av anestesi, nyp i musen för att framkalla en reaktion; Utebliven reaktion indikerar att rätt anestesinivå har uppnåtts.
- Raka musens buk med elektroniska klippare och placera musen i ryggläge på värmebrädan. Rengör buken med povidon-jod, sedan 70% etanol. Placera ögonsalva under mössens ögon för att förhindra torrhet.
- Placera musen under det kraftfulla mikroskopet och håll musen under narkos med en isofluraninhalation med en koncentration på 2 % med ett syreflöde på 2 ml/min.
- Utför en laparotomi i mittlinjen med en sax (kirurgpreferens) från xiphoid-processen till blygdbenssymfysen. Utför sedan ett extra tvärgående snitt för att skapa ett "korsliknande" mönster som är sämre än revbenen. Använd mygghemostatisk pincett och dra tillbaka xiphoid-processen för att uppnå adekvat exponering av bukinnehållet.
OBS: Tång kan säkras beroende på kirurgens önskemål. - Ta bort tarmarna och placera dem på vänster sida av bukhålan i en våt gasvävssvamp. Mobilisera levern genom att ta bort alla ligamentfästen.
- Exponera rätt leverartär (pHA). Skelettera kärlet med hjälp av en kurvpincett och ligera det med 10-0 nylonsutur.
- Dissekera hela längden av CBD med en kombination av skarp och trubbig dissektion. Utför en duktotomi (tillräckligt stor för CBD-stenten) så nära bukspottkörtelns övre kant som möjligt för att ge en tillräcklig längd för framtida användning (~1 cm från leverns nedre kant). Sätt in gallgångsstenten i CBD med en fin pincett och fäst den med en 10-0 nylonsutur. Ligate den distala aspekten av CBD med en 10-0 nylonsutur (Figur 4).
- Dra tillbaka den högra leverloben mot xiphoiden med en våt gasvävssvamp och exponera IVC. Mobilisera den infrahepatiska IVC (IHIVC) bort från retroperitoneum och kauterisera den högra binjurevenen med hjälp av en handhållen kauterianordning (se materialförteckning).
- Dissekera höger njurartär och ven och ligat med 7-0 respektive 10-0 nylon. Skär av höger njurven och artär och återstående ligamentfästen. Ta slutligen bort den högra njuren.
OBS: Detta görs för att få bättre exponering när man slutligen skär IHIVC. - Injicera 0,5 ml kall HTK med 100 U heparinlösning genom PV med en 30 G nål. Vänta 1 minut tills heparinet har fördelats systematiskt. Skär portalvenen precis ovanför mjältvenen och den överlägsna tarmkäxvenen.
- Injicera långsamt kall HTK-konserveringslösning med heparin i IHIVC med en 30 G nål för att perfundera donatorlevern. Sluta injicera lösningen när vätskan som kommer från PV är klar. När injektionen är klar placerar du en mikroklämma på IHIVC precis ovanför den högra njurvenen och skär strax nedanför klämman. När detta steg är klart, stäng av ventilatorn och stoppa isofluran eftersom djuret just har avlivats.
- Skär CBD distalt till stenten som tidigare placerades i steg 2.7. Identifiera dessutom den cystiska kanalen och ligera kanalen med en 10-0 nylonsutur. Ta sedan tag i gallblåsans kupol med en pincett och dissekera fri från gallblåsans fossa med en kombination av skarp och trubbig dissektion. När gallblåsan är tillräckligt mobiliserad, använd en fjädersax, slutför kolecystektomin genom att klippa av cystkanalen ovanför den tidigare placerade suturen.
- Dra tillbaka levern sämre för att exponera suprahepatisk IVC (SHIVC). Klipp SHIVC och var särskilt uppmärksam på att ge en tillräcklig längd för anastomosen hos mottagardjuret.
- Dissekera ytterligare ligamentösa fästen i levern och tillför donatorlevern ex-vivo och placera organet i en behållare med kall koksaltlösning.
3. Beredning av levertransplantat på bakbordet
- Lägg is i en isolerad behållare och placera en petriskål på isbädden. Fyll petriskålen med kall koksaltlösning. Placera levertransplantatet i skålen så att den viscerala ytan exponeras.
- Placera PV genom den tidigare valda manschetten och evert venen så att den inre endotelytan exponeras. Fäst manschetten med 10-0 nylonsutur. Se till att suturen ligger inom manschettens spår för bästa resultat (Figur 5).
- Justera levertransplantatet för att exponera SHIVC och placera två 8-0 Nylonstagsuturer vid 3' respektive 9 orientering för eventuell anastomos hos mottagardjuret. Justera levertransplantatet igen för att exponera IHIVC och placera två 8-0 Nylonstagsuturer vid 3' respektive 9 orientering för eventuell anastomos hos mottagardjuret.
4. Åtgärd av mottagare
OBS: Eftersom detta är en steril operation, använd handskar och lämplig personlig skyddsutrustning och administrera antibiotika. Administrera 0,1 mg/kg Buprenorfin subkutant som preoperativ analgesi vid operationstillfället.
- Exponera pHA som i donatoroperationen; Använd endast en laparotomi i mitten av buken i stället för det tidigare beskrivna buksnittet.
- Mobilisera levern och skär av alla ligamentfästen. Dessutom ligerar de vänstra freniska och paraoesofageala kärlen med 10-0 nylonsutur.
- Dra tillbaka levern inferiorly och dissekera SHIVC från retroperitoneum. Dra sedan tillbaka levern överlägset och dissekera IHIVC från retroperitoneum. Kauterera små överbryggande vener och ländryggsven vid behov med samma teknik som tidigare beskrivits.
- Bränn höger binjure med handhållen kautery och exponera leverhilum. Ligate pHA med 10-0 nylonsutur. Dissekera sedan CBD fri från PV och ligera CBD med 7-0 sutur nära förgreningen av CBD för att ge en tillräcklig längd för CBD-anastomosen.
- Använd en mikroklämma för att klämma infrahepatisk IVC och tillfälligt ligera PV med en 7-0-sutur. Starta den an-hepatiska fasen. Stoppa inhalationen av isofluran.
OBS: Efter klämning av portvenen och IVC blockeras levervenreturen helt i det anhepatiska stadiet. Det inhalerade bedövningsmedlet isofluran metaboliseras av levern; Således stoppas inandningen tillfälligt eftersom ackumulering kan leda till hjärt- och lungkollaps. - Injicera 0,5 ml heparin-saltlösning med en 30 G nål genom leverns PV för att spola organet.
- Placera mikrovaskulära klämmor på SHIVC och IHIVC så proximalt och distalt som möjligt för att lämna en tillräcklig längd för anastomos. Skär av den naturliga SHIVC, IHIVC, PV (nära den tidigare placerade suturen) och eventuella återstående ligamentösa fästen till mottagarens naturliga lever och leverera den naturliga levern ex vivo.
OBS: IHIVC-klämman ska vara ovanför höger njurven. - Placera donatorns levertransplantat inuti bukhålan och dra tillbaka hilum på donatortransplantatet för att exponera PV. Spola både donatorn och den ursprungliga PV med 0,5 ml heparinsaltlösning med en 30 G nål för att avlufta kärlen för att undvika luftemboli. Sätt sedan in den tidigare gjorda manschetten av donator-PV i lumen på mottagarens lever-PV och placera vid behov stagsuturer för att hjälpa till med anastomosen (8-0 sutur). Säkra anastomosen med 7-0 sutur (Figur 6).
- Vrid brädan 180°. Utför en handsydd anastomos med 10-0 nylonsutur med donatorn och inbyggd SHIVC. Efter avslutad anastomos i bakre väggen, spola med 0,5 ml heparinsaltlösning för att avlufta för att undvika luftemboli. Fullständig anastomos av den övre väggen (Figur 7).
- Ta bort ligeringssuturen av PV först; Ta sedan bort kärlklämmorna från SHIVC för att påbörja reperfusionen. Avsluta den an-hepatiska fasen och återuppta inhalationen av isofluran. Utför handsydd anastomos med 10-0 nylonsutur, på samma sätt som för SHIVC-anastomosen, för att rekonstruera IHIVC. När rekonstruktionen är klar, ta bort mikroklämman från den ursprungliga och donator-IHIVC för att reperfuse (Figur 8).
- Utför CBD-anastomosen genom att skapa en duktotomi på mottagarens CBD nära den tidigare placerade suturen. Sätt in stenten i donatorns CBD i mottagarens CBD-lumen och fäst anastomosen med 10-0 sutur (Figur 9).
- Skölj bukhålan med 1 ml saltlösning; Kontrollera hemostas och bränn eventuella kvarvarande blödande kärl. Stäng buksnittet i två lager med 6-0 sutur.
- Placera djuret i en varm kuvös (42 °C) för återhämtning och lämna inte djuret utan uppsikt förrän det har återfått medvetandet och tillräcklig aktivitet. Administrera 0,1 mg/kg buprenorfin subkutant efter operationen och fortsätt administreringen var 8:e till 12:e timme i 48 timmar efter operationen. Administrera dessutom karprofen (0,2 ml upplöst i 400 ml vatten) genom mottagardjurets vattenflaska i upp till 7 dagar efter operationen. Observera mottagardjuret i 4-5 timmar, och när det har återhämtat sig helt, sätt tillbaka det på inhysningsplatsen eftersom det nu är säkert att vara med andra djur.
OBS: Smärtstillande läkemedel och antibiotika kan administreras enligt rekommendationer från lokala djurförsöksetiska kommittéer.
5. Mus mikroCT angiografi avbildning
- Efter att ha observerat musen under det förutbestämda studieintervallet, förbered musen för att utvärdera allograftets patens med hjälp av mikroCT-angiografi.
- Se till att ventilations- och anestesimaskinerna är påslagna för att värma isofluranförångaren. Fyll anestesibehållaren med 30 ml flytande isofluran och se till att ventilatormaskinen är ansluten till syrgasen. Slå på microCT-skannern och se till att all programvara fungerar korrekt.
- Starta exponeringsprogrammet på microCT-skannersystemet.
- På monitorn på microCT-enheten klickar du på Initiera systemet och väljer CT-skanningsläge.
- Mata ut sängen; Fäst musbädden och lås den.
- Slå på värmebrädan till 42 °C för återvinningsburen.
- Fyll en 1 ml spruta med 100 μL CT kontrastmedel. Fäst en 30-gauge nål för framtida intravenös administrering av kontrastmedel. Se till att det inte finns några luftbubblor i sprutan.
- Placera en mus i svansvenens fasthållningssystem. När musen är helt inne i fasthållningssystemet, stäng systemets grind, låt svansen falla vertikalt och torka försiktigt av den med en alkohollösning (70 % etanol).
OBS: Framgången med kanylering av svansvenen kan ökas genom att värma djurets svans genom att hålla den i en handskbeklädd hand i flera minuter. - Ta tag i svansen mot den distala aspekten och placera två fingrar (pek och mitten) runt svansen proximalt om det planerade injektionsstället. Placera den distala delen av svansen (under injektionsstället) mellan tummen och ringfingret.
- Med båda fingrarna trycker du lätt och för in nålen i venen på ett grunt djup, se till att sprutan och nålen är parallella med svansen. Medan du släpper trycket från pekfingret vid den proximala svansen, administrera CT-kontrastmedlet intravenöst. Undvik aspiration med sprutan eftersom det kan få venen att kollapsa.
OBS: Inget motstånd ska kännas under injektionen om nålen är korrekt placerad i venen. Om det finns motstånd, ta bort nålen och sätt tillbaka den ovanför det ursprungliga injektionsstället. Om kanyleringen av venen misslyckas även efter två försök, byt ut nålen. - Efter att ha injicerat kontrasten och tagit bort nålen, applicera ett försiktigt tryck på injektionsstället med steril gasbinda för att stoppa blödningen.
- Överför musen till isofluraninhalationskammaren och ställ in koncentrationen på 2,5 % med ett syreflöde på 2 ml/min och vänta 3-4 min. När ett anestesiplan har etablerats, överför du snabbt musen till mikroCT-skannerbädden och lägger den i bukläge på skannerbordet (figur 10).
- Täck djurets ögon med rätt mängd ögonsalva. Placera noskonen på lämpligt sätt över djuret och se till att luft och isofluran flödar ordentligt genom noskonen. Använd samma anestesiparametrar som beskrivits tidigare (steg 5.12). Smörj och sätt in en rektal temperatursond för att kontinuerligt övervaka djurets kroppstemperatur under avbildning.
- Placera ett andningsskydd i kontakt med musen.
- Använd tejp för att fästa en EKG-dyna på vänster, höger fram och vänster bakben. Använd ultraljudsgel för att förbättra signalen mellan EKG-dynan och huden.
- Kontrollera EKG och andningssignalen på datorprogramvaran för att säkerställa att korrekta QRS-komplex syns på monitorn. Det gör du genom att markera Logic Lead på fliken Source Set Up (Källinställning ) och välja den avledning som har den tydligaste EKG-kurvan.
OBS: Logikledningarna motsvarar de tre EKG-kuddarna som är anslutna till höger, vänster bröst och underben. Varje avledning representerar en EKG-kurva. - Ställ in förstärkning för korrekt signalhöjd, vanligtvis är 4 eller 8 bra. Välj dubbel gating. Under fliken Bildskärmsinställning justerar du bildskärmsinställningarna för en tydlig signalvy: markera rutorna bredvid EKG och RESP och ställ in var och en på 500. Under fliken Trigger Set Up bekräftar du att kanal A, kanal B och DualTrig är markerade.
- Se till att följande parametrar också är inställda: Tröskel: när signalen sjunker under detta värde; ange värdet till 2 500; Hysteres: se till att signalen korsar hysteres för att skapa en programvaruutlösningspunkt vid vilken en ny utlösningscykel startar; ange värdet till 300; Fördröjning: vänta innan utlösaren skickas; ange värdet till 100; Spärra: ingen signal kan genereras under denna period, ställ in värdet till 200.
- Se till att tröskeln för EKG är under hysteresvärdet och över toppen av sT-segmentet på skärmen.
- För in djuret i skannern och tryck på Uppdatera bild. Skaffa en röntgenbild av djuret för att välja lämpligt synfält och anatomisk skanningstäckning för den efterföljande mikroCT-bilden.
- Utför bildtagning med mikroCT-angiografi med hjälp av följande parametrar: Förstoringar: Ultrafokus, Skanningsvinkel: Full (360) skanning, Energi: Enkel, Skanningsläge: Gated, Inställning: Standard (full 360° rotation, röntgenrörets standardinställningar på 0,33 mA och 55 kV, 0,750° grader per steg, 1 projektion per steg, 1 x 1 binning och 40 ms exponeringstid; dubbel gating betyder hjärt- och andningsgating) (Figur 11).
- När skanningen är klar, överför djuret till en förvärmd återhämtningsbur. När djuret har återhämtat sig helt och hållet flyttar du tillbaka det till sin primära bur.
- Rekonstruera mikroCT-bilder med hjälp av systemprogramvara. När du har laddat upp bilden, ställ in de blå staplarna så att den sträcker sig över det anatomiska intresseområdet; Förhandsgranska ett segment för att göra volymen mindre och så begränsad till musen som möjligt (det här steget hjälper till att minska storleken på den rekonstruerade bilden).
- Aktivera volymen av intressekontur för att optimera bildgränsen. Välj 40 μm voxelstorlek, Hann-projektionsfilter och Gaussiskt volymfilter (80 μm). Gå till Avancerat | Bildbaserad gating och justera triggerfönstren och fasen till 0,5 respektive 0,6, välj 10 faser för hjärtgallring och tryck sedan på volymrekonstruktionsknappen .
Representative Results
För de forskare som inte är kirurger, obekanta med anatomi eller obekväma med att tolka radiologiska resultat, bör korrekt bildanalys göras av personal med rätt utbildning. Framgången för en OLT i en mus demonstreras i ovanstående protokoll. Dessutom, för att förbättra studiemåtten och ge feedback i realtid för framgången av en transplantation, samt eliminera behovet av obduktion, kan en mikroCT-angiografiskanning användas för att ge exakta och tydliga bilder. Representativa bilder ingår i detta manuskript (Figur 11). Representativa bilder av in vivo misslyckad anastomos kan ses i figur 12.
De som är bekanta med leverns anatomi och kärl kan se uppenbara venösa anastomoser av IVC. Under vissa omständigheter kan portalvenen också visualiseras, vilket enkelt görs i denna modell på grund av portalvenmanschetten. Visningen av öppna anastomoser indikerar operationens tekniska framgång. Dessutom kan 3D-rekonstruktion av dessa bilder ge ytterligare information till forskare och en mer detaljerad bild av den vaskulära anatomin. Med hjälp av denna modell ovan är dödligheten i OLT-muskohorten ~40-45%.
Figur 1: Översikt över ortotopisk levertransplantation. (A) Grafisk ritning som visar de fyra olika anastomoserna: i) suprahepatisk IVC-anastomos, ii) infrahepatisk IVC-anastomos, iii) portalvenanastomos, iv) vanlig gallgångsanastomos. Varje pil anger en relativ plats för var kärlet eller kanalen ska skäras – suprahepatisk IVC (protokollsteg 2.13), infrahepatisk IVC (protokollsteg 2.11), portven (protokollsteg 2.10) och gemensam gallgång (protokollsteg 2.7). (B) In vivo-diagram över anastomoser. Skalstreck = 2 mm. Förkortning: IVC = inferior vena cava. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Kirurgiska verktyg som används vid kirurgi. (A) 45° fin pincett, (B-E) fin pincett, (F) böjd nålhållare/pincett, (G) rak pincett, (H) vaskulär klämapplicerare, (I) hemostat, (J) nålhållare, (K) elektrokauterianordning, (L) #11 blad, (M) bukupprullningsdon, (N,O) mikrosax, (P) fin sax, (Q) kirurgisk sax, (R,S) Yasargil klämmor, (T) bulldoggsvenklämma, (U) mikrovaskulär klämma. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Portal vencuff och gallgångsstent. Ex vivo-bild av stentar och manschetter före användning. Skalstreck = 3,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Gemensam gallgångsstentning under donatoroperation. (A) Gallgångsstent som förs in i den gemensamma gallgången. (B) Gallgångsstent fäst i gallgången. Skalstreck = 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Placering av portalvensmanschetten under förberedelse av levertransplantatet på bakbordet. (A) Trä portvenen genom venmanschetten. (B) En ven över manschetten. Skalstreck = 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Portalvenanastomos under mottagaroperation. (A) Införande av venmanschetten i mottagarportalvenen. (B) Portalvenanastomos säkrad med sutur. Skalstreck = 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Suprahepatisk IVC-anastomos under mottagaroperation. (A) Anastomosens bakre vägg är fullständig. (B) Avslutad SHIVC-anastomos. Skalstreck = 2 mm. Förkortningar: IVC = inferior vena cava; SHIVC = suprahepatisk IVC. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Infrahepatisk IVC-anastomos under mottagaroperation. (A) Anastomosens bakre vägg är komplett. (B) Avslutad IHIVC-anastomos. Skalstreck = 2 mm. Förkortningar: IVC = inferior vena cava; IHIVC = infrahepatisk IVC. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Gemensam gallgångsanastomos under drift av mottagaren. (A) Placering av gallgångsstent i mottagarens gemensamma gallgång. (B) Säkring av gallgångsanastomos. Skalstreck = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Förberedelse av mikroCT-angiografi hos möss. A) Injektion av vener i mussvansen för att administrera kontrastmedel. (B) Mus som passerar genom microCT-maskin. Förkortning: microCT = mikrodatortomografi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 11: Representativa bilder som visar mikroCT-angiografi av allograftets öppenhet. (A,B) Kontrast kan ses i hela IVC, vilket visar att de suprahepatiska och infrahepatiska anastomoserna är öppna. (C) Kontrast i portal-venen, vilket återigen visar öppenhet. (D) 3D-rekonstruktion av kärlen. Förkortningar: microCT = mikrodatortomografi; IVC = inferior vena cava; PV = portåder. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 12: Representativa bilder som visar misslyckade in vivo-anastomoser . (A) Misslyckad portalvenanastomos på grund av förvrängning av venen som resulterar i brist på blodflöde. (B) Misslyckad suprahepatisk IVC-anastomos på grund av kraftig blödning. Skalstreck = 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
OLT hos gnagare har beskrivits väl i litteraturen 2,8. För att utföra detta tekniskt krävande ingrepp krävs ofta flera års mikrokirurgi (eller kirurgi i allmänhet) eftersom detta kräver en gedigen förståelse för anatomi och teknisk förmåga. När vi utvecklade den här modellen stötte vi på flera tekniska problem som alla kretsade kring anastomoserna. Särskilt med PV-anastomos är det ofta svårt att stabilisera venen för anastomos. Vi har funnit att placering av en eller två suturer (kirurgpreferens) hjälper till att underlätta manschettplaceringar. Det bör noteras att placering av fler stygn ökar operationstiden.
Dessutom är SHIVC djupt inne i bukhålan och är svår att placera en klämma på för att ge tillräcklig exponering. Vi har funnit att om musen är så avslappnad som möjligt i sin fasthållning, kommer det att öka venens flexibilitet. I slutändan är det upp till kirurgen att bestämma rätt placering med praktiken. Dessutom, med CBD-anastomos, är kanalen återigen mycket känslig. Det kan vara svårt att placera stagsuturer för att stabilisera kanalen, och möjligen kan det hjälpa till att stabilisera den genom att placera den på en liten bit gasbinda. Slutligen, eftersom alla små däggdjur är unikt känsliga när det gäller anestesitid, är det viktigt att utföra operationen så snabbt som möjligt. Idealiska operationstider är följande: 1) donatoroperation, 45-60 min; 2) förberedelse av bakbordet, 15 min; 3) Mottagaroperation, 60-80 min. Övning hjälper till att minska slöseri med rörelse.
I takt med att djurmodeller utvecklas har också förmågan att utvärdera framgången med studieinterventioner utvecklats. MicroCT användes först för att genomföra studier på kärl hos råttor i slutet av 1990-talet17. Det finns många utmaningar med att utföra noggranna och tydliga mikroCT-angiografistudier på gnagare. De flesta av utmaningarna uppstår dock på grund av dessa däggdjurs korta hjärt- och andningscykler. Detta övervinns genom att använda korta exponeringar för att begränsa rörelseartefakter samt högre fotonfluenshastigheter18. Generellt fann vi att användningen av hjärtgrinding, liksom justeringen av isoflurankoncentrationerna för att minska andningsfrekvensen, gav de tydligaste bilderna. Vi har också funnit att användning av gnagarspecifik kontrasttiming för specifika faser: leverartärfas, portalvenös fas och fördröjd fas också har förbättrat visualisering19. Användningen av ExiTron nano 12000 kontrast har flera fördelar och kan förbättra den övergripande bildkvaliteten. Det ger den starkaste kontrastförbättringen i levern20 och blodet21. En annan fördel är att kontrasten finns i levern i upp till 120 timmar efter den första injektionen, vilket kan minska associerad levertoxicitet eftersom mindre kontrast behövs om upprepade skanningar krävs20.
Dessutom, eftersom skanningar utförs med musen sederad med isofluran, förändras inte kontrastförbättringen med denna förändring i fysiologi20. Genom att använda dessa avbildningstekniker och ExiTron-kontrast är en tydlig utvärdering av framgångsrika anastomoser i OLT möjlig. MicroCT möjliggör icke-invasiv utvärdering av in vivo-transplantat under en längre period. Detta protokoll minskar antalet djur som måste offras för att utvärdera vaskulära anastomoser och ger möjlighet att studera terapier under flera veckor och deras effekt på kärlen.
Begränsningar
Det bör noteras att även om flera revideringar av OLT-modellen har skett för att fullända dess teknik, är visualiseringen av anastomoserna med hjälp av mikroCT fortfarande en pågående process. Dessutom ger mus OLT en unik inblick i transplantationsmedicin. Det är dock inte en heltäckande modell då det är svårt att hålla dessa möss vid liv efter 1 vecka. Ytterligare transplantationsmodeller bör också användas för att ytterligare underbygga prekliniska experiment.
Slutsatser
Framstegen inom mikroCT har gått snabbt framåt under det senaste decenniet, vilket ger forskare ovärderliga nya verktyg inom området djurmodeller och transplantation. I framtiden kommer mer detaljerad 3D-avbildning att ge ytterligare insikter i forskning och upptäckter.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
SMB stöds av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) anslag R01DK1234750. BAW stöds genom National Institutes of Healths National Heart Lung and Blood Institute-anslag R01HL143000.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 Blade | Fisher Scientific | 3120030 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| 10-0 nylon suture | AD Surgical | M-N510R19-B | |
| 20 G Angiocath | Boundtree | 602032D | |
| 30 G Needle | Med Needles | BD-305106 | |
| Baytril (enrofloxacin) Antibacterial Tablets | Elanco | NA | |
| Bovie Chang-A-Tip High Temp Cauterizer | USA Medical and Surgical Supplies | BM-DEL1 | |
| Bulldog Vein Clamp 1 1/8 | Ambler Surgical USA | 18-181 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | ||
| Castroviejo Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Store | RS-5668 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11252-50 | |
| Dumont Medical #5/45 Forceps - Angled 45° | Fine Science tools | 11253-25 | |
| ExiTron nano 12000 | Miltenyi Biotec | 130 - 095 - 698 | CT contrast agent |
| Forceps | Fine Science tools | 11027-12 | |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Roboz Surgical | RS-7112 | |
| heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| histidine-trypotophan-ketoglutarate | University Pharmacy | NA | |
| Insulated Container | YETI | ROADIE 24 HARD COOLER | https://www.yeti.com/coolers/hard-coolers/roadie/10022350000.html |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Mirco Serrefines | Fine Science tools | 18055-05 | |
| Mouse Rectal Temperature Probe | WPI Inc | NA | |
| NEEDLE HOLDER/FORCEPS straight | Micrins | MI1540 | |
| PE10 Tubing | Fisher Scientific | BD 427400 | |
| perfadex | XVIVO Perfusion AB | REF99450 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Dechra | NA | |
| saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science tools | 14090-11 | |
| Small Mouse Restraint – 1” inner diameter | Pro Lab Corp | MH-100 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent scientific | SS-MVG-Module | |
| Surgical microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| U-CTHR | MI Labs | NA | CT Scanner software |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasagil clamp | Aesculap | FT351T | |
| Yasagil clamp | Aesculap | FT261T | |
| Yasagil clamp applicator | Aesculap | FT484T |
References
- Rana, A., et al. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surgery. 150 (3), 252-259 (2015).
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E.
- Nakano, R., et al. Dendritic cell-mediated regulation of liver ischemia-reperfusion injury and liver transplant rejection. Frontiers in Immunology. 12, 705465 (2021).
- Nakamura, K., et al. Antibiotic pretreatment alleviates liver transplant damage in mice and humans. Journal of Clinical Investigation. 129 (8), 3420-3434 (2019).
- Lee, S. K., et al. Patient-derived Avatar mouse model to predict the liver immune homeostasis of long-term stable liver transplant patients. Frontiers in Immunology. 13, 817006 (2022).
- Li, S. P., et al. Characterization and proteomic analyses of proinflammatory cytokines in a mouse model of liver transplant rejection. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 5188584 (2022).
- Huang, D. R., Wu, Z. J., Zhu, Y. Modified arterialization of orthotopic liver transplantation in a mouse model. Hepatobiliary Pancreatic Disease International. 9 (3), 264-268 (2010).
- Yokota, S., et al. Orthotopic mouse liver transplantation to study liver biology and allograft tolerance. Nature Protocols. 11 (7), 1163-1174 (2016).
- Chen, X. C., et al. Reduced complications after arterial reconnection in a rat model of orthotopic liver transplantation. Journal of Visual Experiments. (165), e60628 (2020).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visual Experiments. (96), e52309 (2015).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Lee, Y. G., et al. A rat lung transplantation model of warm ischemia/reperfusion injury: optimizations to improve outcomes. Journal of Visual Experiments. (176), e62445 (2021).
- Di Martino, M., et al. Imaging follow-up after liver transplantation. British Journal of Radiology. 89 (1064), 20151025 (2016).
- Vardar, B. U., Dupuis, C. S., Goldstein, A. J., Vardar, Z., Kim, Y. H. Ultrasonographic evaluation of patients with abnormal liver function tests in the emergency department. Ultrasonography. 41 (2), 243-262 (2022).
- Marx, J. Imaging. Animal models: live and in color. Science. 302 (5652), 1880-1882 (2003).
- Maehara, N. Experimental microcomputed tomography study of the 3D microangioarchitecture of tumors. European Radiology. 13 (7), 1559-1565 (2003).
- Garcia-Sanz, A., Rodriguez-Barbero, A., Bentley, M. D., Ritman, E. L., Romero, J. C. Three-dimensional microcomputed tomography of renal vasculature in rats. Hypertension. 31, 440-444 (1998).
- Badea, C., Hedlund, L. W., Johnson, G. A. Micro-CT with respiratory and cardiac gating. Medical Physics. 31 (12), 3324-3329 (2004).
- Ma, G., et al. Assessment of hemodynamics in a rat model of liver cirrhosis with precancerous lesions using multislice spiral CT perfusion imaging. BioMed Research International. 2013, 813174 (2013).
- Mannheim, J. G., et al. Comparison of small animal CT contrast agents. Contrast Media and Molecular Imaging. 11 (4), 272-284 (2016).
- Rothe, J. H., et al. Time course of contrast enhancement by micro-CT with dedicated contrast agents in normal mice and mice with hepatocellular carcinoma: comparison of one iodinated and two nanoparticle-based agents. Academic Radiology. 22 (2), 169-178 (2015).
