Summary
提出了一种从药物产品（DP）中富集宿主细胞蛋白（HCP）和使用蛋白质组富集珠检测肽的方案。该方法使用内部制造的单克隆抗体 （mAb） 原料药 （DS） 进行演示，该物质是一种表征良好的参考物质，用于评估和比较不同方法的性能。
Abstract
宿主细胞蛋白 （HCP） 是会对治疗性蛋白质产生不利影响的杂质，即使是少量的。为了评估与药品相关的潜在风险，已经开发了识别低丰度HCP的方法。开发灵敏的HCP检测方法的一个关键方法是利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）在分析前富集HCP，同时去除单克隆抗体（mAb）。
该协议提供了使用市售蛋白质组富集珠富集宿主细胞蛋白的详细说明。这些磁珠包含对不同蛋白质具有特异性亲和力的多种六肽配体库。该方案还包括使用纳米LC-MS/MS进行有限的酶解和随后的肽检测。通过采用这些技术，低丰度的HCP可以富集超过7000倍，从而获得低至0.002 ppm的令人印象深刻的检测限。值得注意的是，该协议能够使用 NIST mAb 以高置信度检测 850 个 HCP。此外，它被设计为用户友好型，并包括一个视频演示，以协助其实施。通过遵循这些步骤，研究人员可以有效地富集和检测HCP，提高药品风险评估的灵敏度和准确性。
Introduction
宿主细胞蛋白 （HCP） 是从宿主生物体的细胞培养物中释放出来并与单克隆抗体 （mAb） 共纯化的杂质1,2,3,4。痕量HCPs会对药品的质量产生负面影响5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15，因此，需要一种灵敏的HCP分析方法来检测亚ppm至ppm水平的HCP。
正交方法可用于检测低丰度的 HCP。酶联免疫吸附测定 （ELISA） 通常用于定量整体 HCP，如果有相应的抗体，它也可以检测和定量单个 HCP16。然而，HCP特异性抗体的生产既费时又费力。相比之下，液相色谱-质谱联用（LC-MS）可以提供有关单克隆抗体药物产品中单个HCP的全面信息，并广泛用于HCP鉴定4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20， 21、22、23、24、25、26、27。
已经开发了几种使用 LC-MS/MS 检测 HCP 的方法，包括有限酶切20、过滤17、蛋白 A 缺失21、免疫沉淀 （IP） 和 ProteoMiner 富集 （PM）18。大多数方法旨在减少mAb的用量，并在LC-MS/MS分析之前富集HCP，从而减小mAb肽和HCP肽之间的动态范围。该协议提出了一种蛋白质组学样品富集方法，该方法结合了 ProteoMiner 技术和有限消化 （PMLD）28。ProteoMiner 富集原理涉及使用市售的蛋白质组富集微球，其中包含多种组合肽配体库。这些配体特异性地与抗体药物产品上的蛋白质结合，从而去除多余的分子，同时将低丰度宿主细胞蛋白 （HCP） 集中在它们各自的亲和配体上。另一方面，有限消化的原理涉及使用低浓度的胰蛋白酶。该浓度足以消化低丰度的HCP，但不足以消化所有抗体药物产品。这种方法能够从溶液中回收和富集消化的HCP肽。
与过滤方法相比，PMLD技术不受检测到的HCPs大小的限制17。蛋白 A 缺失方法特异性地检测与抗体相关的 HCP21，而免疫沉淀仅限于来自特定细胞系（例如中国仓鼠卵巢 （CHO） 细胞系）的预定义 HCP，其中产生抗 HCP 抗体4。相比之下，PMLD可用于检测来自任何药物模块的HCP，以及与来自不同细胞系的药物产品共同纯化的宿主细胞蛋白。此外，与上述方法相比，PMLD 表现出更好的灵敏度17、18、20、21、24。
这种方法可以将HCP浓度富集7000倍，并将检测限降低到0.002 ppm28。实验设置如图 1所示。
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Protocol
协议中使用的缩写列于 补充表1中。
1. 溶液和缓冲液的制备
注：所有试剂的商业细节均列在 材料表中。
- 通过将 1 mL 的 1 M Tris-HCl（pH 8.0）加入玻璃小瓶中的 9 mL 去离子水中，制备 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）溶液，并通过涡旋充分混合。在4°C下储存长达3个月。
- 通过将 10 mg SDC 溶解在 1 mL 的 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）中来制备 24 mM 脱氧胆酸钠 （SDC）。
- 通过将 7 mg SLS 溶解在 1 mL 的 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）中，制备 24 mM 月桂酰肌氨酸钠 （SLS）。
- 通过以 1：1 （v/v） 的比例混合 24 mM SDC 和 24 mM SLS 来制备洗脱缓冲液。
- 通过将 400 μL 去离子水加入 20 μg 胰蛋白酶中来制备 50 ng/μL 胰蛋白酶溶液。
- 通过将 308 μL 的 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）加入 7.7 mg DTT 中，制备 25 mg/mL 二硫苏糖醇 （DTT）。
- 通过将 1.2 mL 的 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）加入 56 mg IAM 中，制备 0.25 M 碘乙酰胺 （IAM）。
- 通过将 1 mL 三氟乙酸 （TFA） 加入 9 mL 去离子水中来制备 10% TFA。涡旋 4 秒并向下旋转。在4°C下储存长达3个月。
- 通过将 1 mL 10% TFA 加入 99 mL 去离子水中来制备缓冲液 A。
- 通过将 1 mL 10% TFA 和 49 mL 去离子水加入 50 mL 乙腈 （ACN） 中来制备缓冲液 B。
- 通过将 37 mg L-组氨酸和 54.8 mg L-组氨酸一水合物加入 50 mL 水中，制备 10 mM 组氨酸缓冲液。
2. 单克隆抗体（mAb）溶液的制备
- 对于浓度高于 50 mg/mL 的药品，在 2 mL 微量离心管中用去离子水稀释 15 mg 单克隆抗体 （mAb）（参见 材料表），总体积为 300 μL，最终 pH 值为 ~6。如有必要，使用乙酸或Tris-HCl调节pH值。
- 对于浓度低于 50 mg/mL 的药品，请按照步骤 2.2.1 至 2.2.5 进行缓冲液置换。
- 将每个样品的20mg转移到10k离心过滤装置（参见 材料表）中，并以14,000× g 离心25分钟（室温，RT），直到剩余约100μL体积。
- 将 350 μL 10 mM 组氨酸（参见 材料表）、pH 6.0 缓冲液加入过滤器中，涡旋并在室温下以 14,000 x g 离心 25 分钟。 重复一次。
- 倒置过滤器并将其放入样品收集管中，然后在室温下以1000× g 离心样品5分钟，以检索收集管中的全部体积。用 200 μLof 10 mM 组氨酸缓冲液洗涤过滤器并上下移液以回收任何剩余的蛋白质样品。将整个溶液转移到同一个收集管中，涡旋并向下旋转。
- 通过NanoDrop测量样品浓度。在与富集珠孵育之前，通过添加组氨酸缓冲液将每个蛋白质样品的浓度调节至 50 mg/mL。
- 将 300 μL 样品转移到 2 mL 微量离心管中。
3. 蛋白质组富集微球的制备
- 从商业蛋白质富集试剂盒获得的每个离心柱上取下顶盖和底盖（参见 材料表）。不要丢弃盖子，因为它们稍后会用到。
- 取离心柱并将其放置在不带盖的 2 mL 微量离心管中。在室温下以1,000× g 离心30-60秒，以消除储存溶液。处理在此步骤中收集的材料。
- 将 200 μL 洗涤缓冲液加入市售富集珠中（参见 材料表），并上下移液数次。将离心柱置于 2 mL 微量离心管中，并在室温下以 1,000 x g 离心 30-60 秒以除去缓冲液。丢弃收集的材料。
注：洗涤缓冲液包含在商业蛋白富集试剂盒中。 - 重复步骤 3.3 两次。
- 更换底盖并加入 200 μL 水，然后更换顶盖。
4. 蛋白质富集
- 上下移液（从步骤3.5开始），并将40μL浆液转移到步骤2中制备的样品中。在室温下孵育并旋转试管2小时。
- 使用 16 G 针头制作带有筛板的吸头（参见 材料表）以获得合适的筛板尺寸，然后将其插入 200 μL 吸头的尖端。
- 将带有珠子的样品转移到步骤4.2中制备的尖端。用 2 mL 微量离心管以 200 x g 离心 3 分钟，在室温下除去溶液。
- 通过向吸头中加入 200 μL 洗涤缓冲液洗涤珠子，并用 2 mL 微量离心管以 200 x g 在室温下离心 2 分钟以除去洗涤溶液。重复该步骤两次。
- 通过向吸头加入 200 μL 水来洗涤珠子，并在室温下用 2 mL 微量离心管以 200 x g 离心吸头 2 分钟以除去水分。
- 通过向吸头中加入 10 μL 洗脱缓冲液（步骤 1.4）从珠子中洗脱蛋白质，并将浆液移液在吸头中移液 10 次，以确保珠子被洗脱缓冲液浸泡。
- 在室温下用新的 0.5 mL 微量离心管以 200 x g 离心吸头 30 秒以收集洗脱液。重复步骤4.6-4.7两次，并将所有洗脱液合并到一个0.5mL微量离心管中。
- 将1.5μL胰蛋白酶溶液（步骤1.5）加入洗脱液中，在28°C下过夜消化。 加入1.5μL的25mg / mL DTT（步骤1.6），并在90°C下加热样品20分钟。
- 加入1.5μL的0.25M IAM（步骤1.7），并在室温下在黑暗中孵育20分钟。 加入3.5μL 10%TFA（步骤1.8），涡旋2分钟，并确保pH值为~2-3。
- 在室温下以 14,400 × g 离心 10 分钟以沉淀 SDC 和 SLS。收集上清液进行脱盐。
- 按照以下步骤进行脱盐。
- 向 GC 脱盐吸头中加入 50 μL 缓冲液 B（步骤 1.10）（参见 材料表）。在室温下用支架以1000× g 离心吸头3分钟。 丢弃收集的材料。
- 向吸头中加入 50 μL 缓冲液 A（步骤 1.9）。在室温下用支架以1000× g 离心吸头3分钟。 丢弃收集的材料。
- 将酸化样品添加到吸头中。在室温下用支架以500× g 离心吸头6分钟。
- 通过向吸头中加入 50 μL 缓冲液 A 来清洗吸头。在室温下用支架以500× g 离心吸头3分钟。 丢弃收集的材料。重复一次。
- 通过向 GC 脱盐尖端加入 50 μL 缓冲液 B，从尖端洗脱肽。在室温下用新管以500× g 离心3分钟。重复该步骤一次并合并洗脱液。
- 用真空浓缩器干燥洗脱液（参见 材料表）。
- 将干燥的洗脱液重悬于 30 μL 0.1% 甲酸 （FA） 溶液中。
- 用分光光度计测量肽混合物在214nm处的UV（参见 材料表）。肽混合物的浓度应在 0.1 至 0.5 mg/mL 之间。
- 将 10 μL 每个消化样品转移到 LC 样品瓶中，然后将 1 μg 每个消化样品注入纳米 LC-MS/MS 中（参见 材料表）。按照步骤 5 执行分析。将其余消化的样品储存在-80°C冰箱中。
5. 纳米LC-MS/MS分析
- 将肽混合物注入与质谱仪偶联的纳米LC系统中。将肽混合物（~1μg）加载到 具有表1A 中提供的梯度的C18捕获柱上进行脱盐，然后在40°C下加载到C18分析柱上进行分离。
注：流动相A缓冲液由0.1%FA的超纯水溶液组成，流动相B由0.1%FA的80%乙腈溶液组成。 - 分离肽，并以 表1B 中提供的梯度洗脱，流速为250nL/min。
注：质谱仪在数据相关模式（DDA）下运行，循环时间为3秒。离子通过高能碰撞解离 （HCD） 发生碎裂，每次完整 MS 扫描的归一化碰撞能量为 30%。扫描分辨率为60,000，自动增益控制（AGC）目标为3e6，最大注入时间为20 ms，m/z范围为380-1600。MS/MS事件的分辨率为15,000，AGC目标为1e5，最大进样时间为60 ms，m/z范围为200-2000。排除持续时间设置为 45 秒。离子源属性见表 1C，具体质谱参数见 表2A-F。
6. 数据分析
- 根据 UniProt mus+musculus 数据库29 搜索 NISTmAb 质谱原始文件。此外，在 UniProt Cricetulus Griseus 数据库30 中搜索重组蛋白加标 mAb DS 质谱原始文件。
注：这些搜索是在Proteome Discoverer软件（见 材料表）中使用Sequest HT和Mascot搜索引擎进行的。使用的数据库没有冗余条目。 - 对于质谱搜索，应用10 ppm的质量公差，并将片段质量公差设置为0.02 Da。
注：检索标准包括半胱氨酸残基的静态脲甲基化（+57.0214 Da）和蛋氨酸残基氧化的可变修饰（+15.9949 Da）。此外，还应用了脱氨的可变修饰（+0.984 Da）。 - 使用胰蛋白酶消化进行数据库搜索，最多允许两个遗漏的切割。将蛋白质和肽的误发现率设置为 0.01。
注：为了明确鉴定宿主细胞蛋白 （HCP），至少需要两种独特的肽。 表 3 提供了通过 Proteome Discoverer 软件分析的与 NIST mAb 相关的已鉴定 HCP 的代表性摘要。
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Representative Results
该协议提供了一种样品制备工作流程，称为蛋白质富集与有限消化（PMLD）相结合，用于分析单克隆抗体（mAb）样品中的宿主细胞蛋白（HCP）。图 1 说明了 PMLD 的分步过程。研究人员比较了使用直接消化（如图 2 顶部面板所示）和 PMLD（如图 2 底部面板所示）的 HCP 分析结果。总离子色谱图（TIC）图谱表明，PMLD显著减少或消除了主要的mAb肽，同时可以观察到一些与mAb肽相当的HCP肽。提供了纳米LC（表1）和MS/MS（表2）分析的详细参数。此外，表3还汇总了与NIST单克隆抗体相关的已鉴定HCP，包括种质号、HCP名称、物种、覆盖率、PSM、独特肽、分子量、预期等电点（pI）、Mascot评分、Sequest HT评分以及Mascot和Sequest HT鉴定的肽数等信息。
图 1：蛋白质富集与有限酶切 （PMLD） 相结合的样品制备工作流程。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：NIST mAb HCP 分析的总离子色谱图 （TIC） 图。上图：使用直接酶切对 NIST mAb 进行 HCP 分析的 TIC 曲线。下图：使用 PMLD 对 NIST mAb 进行 HCP 分析的 TIC 曲线。从TIC图中可以明显看出，与直接酶解相比，大多数主要的mAb肽在PMLD后已经减少或消除，而一些属于HCP的肽可以观察到，并且与mAb肽相当。请点击这里查看此图的较大版本.
表1：nano LC的参数。 （A）加载泵梯度。（B）NC泵梯度。（C） 离子源特性。 请按此下载此表格。
表 2：MS/MS 的参数。 （A） 全扫描属性。（B） MIPS特性。（C） 强度特性。（D） 电荷状态属性。（E） 动态排除。（F） 与数据相关的 MS2 扫描属性。 请按此下载此表格。
表 3：通过 Proteome Discoverer 软件分析的与 NIST mAb 相关的已鉴定 HCP 的代表性汇总表。 该表包括种令号、HCP名称、物种、覆盖率、肽谱匹配数（PSM）、独特肽数、分子量、预期等电点（pI）、Mascot评分、Sequest HT评分以及Mascot和Sequest HT鉴定的肽数等信息。 请按此下载此表格。
补充表1：使用的缩略语列表。请按此下载此表格。
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Discussion
市售的蛋白质富集微球有两种版本：一种容量较小，另一种容量较大（参见 材料表）。两种版本的富集微球在包装中都含有十种制备物。制造商的说明表明，小容量试剂盒中的每个制备都可用于富集 10 mg 总蛋白。然而，为了实现 DS 宿主细胞蛋白 （HCP） 富集的最佳性能，每次制备都适合 5 个 DS 样品。因此，每个试剂盒可用于从 50 个样品中富集 HCP。对于大容量试剂盒的每种制备方法，它都有利于从 25 个 DS 样品中富集 HCP，从而可以从总共 250 个样品中检测 HCP。
步骤 3.1 建议不要丢弃顶盖或底盖，因为它们将在整个协议中重复使用。如果珠子沉淀在顶盖中，请在取下底塞并离心后更换它们，同时将顶盖保持在色谱柱上。要将底盖用作塞子，请将其倒置并将其牢固地放置在离心柱的底部。
该程序的一个关键步骤是步骤 4.1，其中珠浆沉淀在管的底部。因此，在将浆液转移到单克隆抗体 （mAb） 样品中时，保持上下连续移液至关重要。另一个关键步骤是步骤4.6，在步骤4.6中，当珠子被洗脱缓冲液饱和时，必须在吸头内移液浆液十次。步骤4.3-4.5,4.7和4.10中的离心持续时间可能因累积的宿主细胞蛋白（HCP）的量而异。因此，在进行下一步之前，检查并确保吸头中的液体已正确旋转至关重要。同样，当初始量为 15 mg 抗体药物产品时，可以洗脱大约 30 μg 抗体和富集的宿主细胞蛋白 （HCP）。为了在有限消化的情况下实现 400：1 的蛋白质酶比，添加了 75 ng 胰蛋白酶。当使用较少量的输入材料时，需要测量洗脱蛋白质样品的浓度。该测量有助于相应地调整必须添加的胰蛋白酶量。步骤4.9显示加入10%TFA后出现白色沉淀。为了防止表面活性剂对MS信号产生任何干扰，在加入三氟乙酸（TFA）后检查pH值以确保从上清液中完全去除洗涤剂至关重要。
在将洗脱液干燥并重悬于水中后，有必要对肽混合物进行UV测量。这种测量至关重要，因为加载到色谱柱上的肽的数量会影响使用MS进行检测。经过评估，发现约1 μg的肽混合物在MS中表现出最佳性能。因此，需要将该最佳量注入纳米LC-MS/MS中进行进一步分析。
PMLD 方法在样品制备中具有多项优势，包括充分减少单克隆抗体 （mAb） DS，同时保留大多数低丰度宿主细胞蛋白 （HCP）。与免疫沉淀 （IP） 不同，该技术不依赖于抗 HCP 抗体，从而消除了与预定义抗体相关的偏倚，并减少了生产抗 HCP 抗体所需的劳动力和时间。此外，与基于截留分子量17 的过滤方法不同，PMLD 可富集 HCP，无论其大小如何。它可用于富集各种药物模块（如抗体、融合蛋白、ScFv 等）的 HCP，与蛋白 A 缺失方法相比，它是一种通用的方法21。
除了这些优点外，与其他方法相比，PMLD 还具有较低的检测限，并且能够从 NISTmAb（一种广泛表征的参考标准品）中检测出更多的 HCP。然而，值得注意的是，PMLD需要自制设备，这限制了其自动化应用。为了扩大其可用性，可以用市售的替代品替换某些设备，例如带有熔块的尖端。此外，使用这种方法，在 96 孔板上进行脱盐可以实现更高的通量。在未来的实验中探索自动化或半自动化可能是扩大PMLD更广泛应用的合乎逻辑的下一步。
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Disclosures
作者没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
没有。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
| Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
| C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
| Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
| GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
| in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
| Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
| Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
| Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
| Milli-Q | Millpore | 30035 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
| Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
| Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
| Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
| ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
| ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
| Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
| Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
| SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
| Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
| Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
| Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
| UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
| Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
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