Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة مضان الحمض النووي الريبي في الموقع للتهجين لتوطين lncRNAs في خلايا الساركوما العظمية البشرية.
Abstract
تمت دراسة الأدوار المهمة للحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر (lncRNAs) في السرطان ، مثل تنظيم الانتشار ، والانتقال الظهاري الوسيطة (EMT) ، والهجرة ، والتسلل ، والالتهام الذاتي للخلايا السرطانية. يمكن أن يوفر اكتشاف توطين lncRNAs في الخلايا نظرة ثاقبة لوظائفها. من خلال تصميم تسلسل سلسلة مضادات الحساسية الخاصة ب lncRNA متبوعا بوضع العلامات باستخدام أصباغ الفلورسنت ، يمكن تطبيق مضان الحمض النووي الريبي في الموقع (FISH) للكشف عن التوطين الخلوي ل lncRNAs. جنبا إلى جنب مع تطوير الفحص المجهري ، تسمح تقنيات RNA FISH الآن بتصور lncRNAs التي تم التعبير عنها بشكل سيئ. لا يمكن لهذه الطريقة اكتشاف توطين lncRNAs وحدها فحسب ، بل يمكنها أيضا اكتشاف التمركز المشترك للحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتينات الأخرى باستخدام التألق المناعي مزدوج اللون أو متعدد الألوان. هنا ، قمنا بتضمين إجراء التشغيل التجريبي التفصيلي واحتياطات RNA FISH باستخدام الجين المضيف للحمض النووي الريبي lncRNA الصغير 6 (SNHG6) في خلايا الساركوما العظمية البشرية (143B) كمثال ، لتوفير مرجع للباحثين الذين يرغبون في إجراء تجارب RNA FISH ، وخاصة lncRNA FISH.
Introduction
لقد تم توسيع فهمنا للجينوم البشري بشكل كبير من خلال التطورات الحديثة في تكنولوجيا الجينوم الكامل. يمكن نسخ حوالي 93٪ من الجينوم البشري إلى الحمض النووي الريبي ، ولكن يمكن ترجمة 2٪ فقط من الحمض النووي الريبي إلى بروتينات. تسمى 98٪ المتبقية من الحمض النووي الريبي التي ليس لها وظيفة ترجمة البروتين الحمض النووي الريبي غير المشفر (ncRNA) 1. كفئة من الحمض النووي الريبي غير المشفر (ncRNAs) ، جذبت ncRNAs الطويلة (lncRNAs) ، التي تحتوي على أكثر من 200 نيوكليوتيدات2 ، اهتماما متزايدا بسبب مشاركتها في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية للخلايا ، مثل التمايز ، والتحكم في الدورة ، وموت الخلايا المبرمج ، والهجرة ، والغزو3،4،5. تلعب LncRNAs أدوارها من خلال آليات مختلفة ، مثل تنظيم بنية الكروماتين والتعبير الجيني النووي ، والتحكم في عملية ربط mRNA ، وتعديل ما بعد النسخ6. تنظم LncRNAs حدوث الأورام الخبيثة وتطورها وانتشارها على مستوى النسخ وما بعد النسخ. يتم تحقيق تنظيم النسخ في النواة من خلال التأثير على نسخ الحمض النووي الريبي عن طريق الارتباط بالهياكل الكروموسومية ، بينما يتحقق تنظيم ما بعد النسخ في السيتوبلازم عن طريق التحكم في الجينات المستهدفة عبر آلية RNA تنافسية داخلية المنشأ (ceRNA)5،7،8. كشف CeRNA عن آلية جديدة لتفاعل الحمض النووي الريبي ، وهي أن lncRNAs يمكن أن تعمل كإسفنجة لامتصاص miRNAs وتثبيط التدهور بوساطة miRNA للجينات المستهدفة ذات الصلة9. لذلك ، فإن المعلومات المتعلقة بالتوطين تحت الخلوي ل lncRNAs ، سواء كان lncRNA معينا موجودا في السيتوبلازم أو النواة ، مهمة للمساعدة في تحديد وظائفها البيولوجية.
في الوقت الحاضر ، يتم الكشف عن توطين lncRNA بشكل أساسي بطريقتين ، واحدة عن طريق مقايسة عزل جزء النواة / السيتوبلازم ، والأخرى بواسطة RNA FISH. في السابق ، يتم استخراج الحمض النووي الريبي في السيتوبلازم والكسور النووية على التوالي ، ثم يتم إجراء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات lncRNA محددة للكشف عن نسبة lncRNAs في السيتوبلازم والنواة. ميزة هذه الطريقة هي كفاءة الوقت ، في حين أن العيب هو أن توطين lncRNA الفعلي لا ينعكس مباشرة من خلال النسبة النسبية ل lncRNAs في السيتوبلازم والنواة. يمكن ل RNA FISH اكتشاف توطين lncRNA في الخلايا من خلال تصميم تسلسلات سلسلة مضادة للحساسية خاصة ب lncRNA متبوعة بوضع العلامات باستخدام أصباغ الفلورسنت10. تم تحسين طرق RNA FISH مع التقدم في تقنيات المسبار وطرق الكشف ، بما في ذلك مجموعات مسبار oligo المتعددة ذات العلامات الفلوروفور 11 ، ومجسات LNA12 ، ومجسات الحمض النووي المتفرعة (bDNA)13. لا يمكن ل RNA FISH اكتشاف توطين lncRNA فحسب ، بل يمكنه أيضا اكتشاف التمركز المشترك للحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتينات الأخرى باستخدام التألق المناعي مزدوج اللون أو متعدد الألوان14.
في هذا العمل ، قمنا بتضمين بروتوكول الكشف عن التوطين المفصل داخل الخلايا للجين المضيف للحمض النووي الريبي الصغير lncRNA 6 (SNHG6) في خلايا الساركوما العظمية (143B) بواسطة RNA FISH كمثال. SNHG6 هو 600-730 نيوكليوتيد lncRNA في شكله الناضج المقسم ويتم تحديده على أنه جين ورمي جديد في سرطانات بشرية متنوعة ، بما في ذلك سرطان القولون والمستقيم وسرطان المعدة وسرطان الخلايا الصافية المبيض وساركوما العظام وسرطان الخلايا الكبدية15،16،17،18. أكدت الدراسات تورط SNHG6 في السلوكيات البيولوجية للخلايا السرطانية ، مثل الانتشار ، EMT ، والالتهام الذاتي ، وأظهرت توطين السيتوبلازم ل SNHG6 حيث قد يؤثر على الجينات المستهدفة عن طريق ربط (إسفنجة) miRNAs15،16،17. يتم تقديم بروتوكول الكشف التفصيلي هذا للتوطين داخل الخلايا SNHG6 بواسطة RNA FISH هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول. يوضح الشكل 1 البروتوكول العام لأسماك الحمض النووي الريبي. يحتوي الجدول 1 على تكوين جميع الحلول ويحتوي الجدول 2 على تسلسلات التمهيدي المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. إعداد التحقيق
- تحديد والحصول على تسلسل FASTA لهدف lncRNA ذي الأهمية ، على سبيل المثال ، من GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). باتباع المؤشرات الموجودة على موقع الويب ، صمم مجسات ISH عبر الإنترنت19 ، وراجع اقتراحات خوارزمية التصميم لسرد المجسات التي سيتم طلبها باستخدام ملصق Cy3.
- احتضان المخزن المؤقت للتهجين عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مقدما.
- قم بإذابة 4 مسبار كثافة بصرية (OD) في 160 ميكرولتر من ddH2O المعالج بثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) بتركيز 1 مجم / مل بعيدا عن الضوء.
ملاحظة: تمثل الكثافة الضوئية (OD) وحدة قياس الحمض النووي والحمض النووي الريبي. عادة ، 1 وحدة OD = 33 ميكروغرام / مل من الحمض النووي. - قم بإعداد 200 ميكرولتر من خليط المسبار لكل بئر (1.2 ميكرولتر -10 ميكرولتر من المسبار ، 70 ميكرولتر من محلول التهجين ، قم بتكوين الحجم باستخدام ddH2O المعالج ب DEPC إلى 200 ميكرولتر) ، وقم بإعداد سلسلة من 50 ميكروغرام / مل ، 25 ميكروغرام / مل ، 12.5 ميكروغرام / مل ، و 6 ميكروغرام / مل.
ملاحظة: يجب استكشاف تركيز المسبار تجريبيا مسبقا. سيؤدي تركيز المسبار العالي إلى ارتباط غير محدد ل lncRNAs ، بينما سيؤدي تركيز المسبار المنخفض إلى اكتشاف غير حساس أو فاشل ل lncRNAs. - قم بتعكير مزيج المسبار على حرارة 73 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: إذا كان مسبار الحمض النووي المسمى Cy3 مزدوج الشريط ، فقم بفك طبيعة المسبار إلى الحمض النووي أحادي الشريط عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم يبرد بسرعة لمدة 2 دقيقة على الجليد.
2. إعداد الخلية
- بذر 50000 خلية 143B لكل بئر على أغطية زجاجية معقمة في صفيحة استزراع خلايا مكونة من 12 بئرا واحتضانها لمدة 24 ساعة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) في DMEM.
ملاحظة: يختلف رقم الخلية المحدد المصنف هنا باختلاف حجم الخلية ، وهو مناسب للخلايا المصنفة للوصول إلى التقاء بنسبة 50٪ بعد حضنها لمدة 24 ساعة. أغطية الزجاج المعقمة مستديرة لتكون مناسبة للوحة 12 بئرا. - قم بإزالة الوسط واغسله لمدة 2 × 5 دقائق باستخدام 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
ملاحظة: قم بإعداد 1x PBS مع DDH2O. المعالج ب DEPC لا يمكن استخدام PBS بدون علاج DEPC لأنه يحتوي على RNase. قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية في ظروف خالية من RNase. - قم بإزالة 1x PBS وأضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ في كل بئر لإصلاحه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة الإيثانول ، وأضف 200 ميكرولتر من 0.1٪ Triton X-100 (في 1x PBS) في كل بئر ، واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يجب التحكم في الوقت بشكل صارم باستخدام نفاذية Triton X-100 ولا يمكن أن يكون طويلا جدا. - إزالة 0.1٪ تريتون X-100 وغسل 2 × 5 دقائق مع 1x PBS.
ملاحظة: إذا كان لا بد من إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ، فاستبدل PBS بإيثانول 70٪ (تخفيف الإيثانول بنسبة 100٪ باستخدام ddH2O الخالي من RNase) وقم بتخزين العينة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر. - قم بإزالة 1x PBS ، وأضف 200 ميكرولتر من محلول سترات محلول ملحي الصوديوم (SSC) (تخفيف 20x SSC مع DDH2O الخالي من RNase) في كل بئر ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- قم بإزالة 2x SSC buffer ، وأضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ في كل بئر ، واحتضانها لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تخلص من الإيثانول بنسبة 70٪ ، وأضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 85٪ (تخفيف الإيثانول بنسبة 100٪ مع ddH2O الخالي من RNase) في كل بئر ، واحتضانه لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تخلص من الإيثانول بنسبة 85٪ ، وأضف 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ في كل بئر ، واحتضن لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- امتصاص وتجاهل الإيثانول 100 ٪. دع الآبار تجف.
3. التهجين الفلوري في الموقع (FISH)
- أضف 200 ميكرولتر من خليط المسبار (مشوه كما في الخطوة 1.5) إلى كل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية طوال الليل (16-18 ساعة).
ملاحظة: هناك علاقة إيجابية قوية بين درجة حرارة التهجين وتركيز المسبار. لذلك ، لتحسين الخلفية ، يجب تقليل درجة حرارة التهجين وتركيز المسبار. - في اليوم التالي ، أخرج عينات من 37 درجة مئوية وتخلص من خليط المسبار. أضف 200 ميكرولتر من 0.4x SSC / 0.3٪ Tween-20 buffer إلى كل بئر (مسخن مسبقا عند 65 درجة مئوية) واغسله لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة المخزن المؤقت 0.4x SSC / 0.3٪ Tween-20 ، وأضف 200 ميكرولتر من 2x SSC / 0.1٪ Tween-20 buffer إلى كل بئر ، واغسله لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة 2x SSC / 0.1٪ Tween-20 buffer ، أضف 200 ميكرولتر من محلول تلطيخ 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1 ميكروغرام / مل) ، وصمة عار لمدة 20 دقيقة بعيدا عن الضوء.
- تخلص من محلول صبغة DAPI واغسله باستخدام 1x PBS لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- أضف 50 ميكرولتر من وسط التثبيت الذي يحتوي على العلكة على الشريحة وضع الغطاء الزجاجي على الشريحة لإصلاحها.
ملاحظة: تأكد من وضع شريحة الغطاء على الشريحة بحيث يكون جانب الخلية لأسفل. - مراقبة تحت المجهر مضان.
ملاحظة: استخدام المجهر مضان أو المجهر البؤري الليزر; هذا الأخير ينتج حساسية أعلى ووضوح التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم عرض صور تمثيلية ل SNHG6 FISH في خلايا الساركوما العظمية البشرية (الشكل 2). يتم التعامل مع عنصر التحكم السلبي باستخدام مسبار Ctrl السلبي ؛ يتم التعامل مع التحكم الإيجابي باستخدام مسبار U6 20. يتم تمييز مسبار SNHG6 ومسبار U6 ب Cy3 ، الذي ينبعث منه مضان أحمر. DAPI هي صبغة تلطخ الحمض النووي ، الذي ينبعث منه مضان أزرق. تظهر هذه النتيجة أن SNHG6 موضعي بشكل أساسي في السيتوبلازم ، ويمكن أن توفر هذه المعلومات اتجاها مهما لمزيد من الدراسة ل SNHG6.
إذا تم استخدام تركيز عال جدا من المسبار ، يمكن رؤية لون الخلفية تحت المجهر الفلوري. يوضح الشكل 3 الصور التمثيلية عند استخدام تركيز عال من مسبار SNHG6 في RNA FISH. تمثل الأسهم البيضاء تلطيخا غير محدد.
الشكل 1: مخطط انسيابي لبروتوكول RNA FISH ل lncRNA. يوضح هذا الرسم البياني البروتوكول الرئيسي لعملية تجربة RNA FISH. الاختصارات: FISH = التهجين الفلوري في الموقع . lncRNA = الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توطين LncRNA (SNHG6) في خلايا الساركوما العظمية البشرية (143B). يتم التعامل مع السيطرة السلبية مع مسبار التحكم السلبي. يتم التعامل مع التحكم الإيجابي باستخدام مسبار U6 . يتم تمييز مجسات SNHG6 و U6 ب Cy3 ، والتي تنبعث منها مضان أحمر. DAPI هي صبغة تلطخ الحمض النووي وتنبعث منها مضان أزرق. دمج الأحمر والأزرق لجعل اللون الوردي. يتم التقاط الصور باستخدام مجهر مضان. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: LncRNA = الحمض النووي الريبي الطويل غير المشفر ؛ DAPI = 4 '، 6-دياميدينو -2-فينيليندول. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الصور التمثيلية للتركيز العالي لمسبار SNHG6 في أسماك الحمض النووي الريبي.يتم تمييز مجسات SNHG6 ب Cy3 ، والتي تنبعث منها مضان أحمر. DAPI هي صبغة تلطخ الحمض النووي وتنبعث منها مضان أزرق. دمج الأحمر والأزرق لجعل اللون الوردي. يتم التقاط الصور باستخدام مجهر مضان. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الجدول 1: تركيب المحاليل المستخدمة في تجربة تهجين RNA FISH. يجب أن تتم جميع التخفيفات بماء معقم خال من RNase. جميع المياه المضافة معالجة ب DEPC ddH2O. الاختصارات: FISH = التهجين الفلوري في الموقع ؛ DEPC = ثنائي إيثيل بيروكربونات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: جميع تسلسلات المسبار المستخدمة في هذه التجربة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لا يمكن لبروتوكول RNA FISH هذا اكتشاف توطين lncRNAs في الخلايا فحسب ، بل يمكنه أيضا اكتشاف التمركز المشترك للحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتينات الأخرى في الخلايا ، والتي يمكن استخدامها أيضا للكشف عن موقع lncRNAs في الأنسجة المضمنة بالبارافين. ومع ذلك ، فإن البروتوكول المحدد في مثل هذه الحالات يختلف لأن الأنسجة المضمنة في البارافين تحتاج إلى إزالة الشمع21. يمكن تطبيق هذا الإجراء التجريبي في ألواح 48 أو 96 بئرا ، لكن ألواح 384 بئرا صغيرة جدا بحيث لا يمكن استخدامها هنا.
يجب ملاحظة العديد من الخطوات الحاسمة لهذه الطريقة ، بما في ذلك البيئة الخالية من RNase ، وتركيز المسبار ، ودرجة حرارة التهجين ، ووضع عناصر تحكم سلبية وإيجابية. أولا ، تعتبر الحالة الخالية من RNase أمرا بالغ الأهمية لأن RNase يكسر الروابط بين النيوكليوتيدات ويؤدي إلى تدهور lncRNAs بشكل عام. ثانيا ، يتراوح تركيز المسبار الموصى به بشكل شائع من 5 إلى 50 ميكروغرام / مل. سيؤدي تركيز المسبار العالي إلى ارتباط غير محدد ل lncRNAs ، بينما سيؤدي تركيز المسبار المنخفض إلى اكتشاف غير حساس أو فاشل ل lncRNAs19. إذا تم استخدام تركيز عال جدا من المسبار ، يمكن رؤية لون الخلفية تحت المجهر الفلوري حتى في وجود مسبار مخلوط (تحكم سلبي) فقط ؛ لذلك ، عادة ما يتم استخدام نفس تركيزات الضوابط السلبية لإعداد خط الأساس (مثل التحكم الداخلي) أثناء التجارب الأولية لاستكشاف تركيز المسبار المناسب لتجنب أي ارتباط غير محدد. تم استخدام أعلى تركيز للمسبار بدون لون الخلفية في مجموعة التحكم السلبية ، حيث يقدم أقوى إشارة بدون ربط غير محدد ، في التجارب التالية. ثالثا ، يوصى بتصميم مجسين أو ثلاثة تحقيقات على الأقل للتحسين باستخدام lncRNA محدد. في الوقت نفسه ، يمكن أيضا خلط مجسين أو أكثر لتحسين حساسية الكشف عن lncRNAs المستهدفة. رابعا ، درجة حرارة التهجين العادية لمسبار lncRNA هي 37 درجة مئوية. أثناء عملية التهجين ، يجب أن تظل درجة حرارة التهجين ثابتة وموحدة. نطاق درجة حرارة التهجين بين المجسات المختلفة هو 34 إلى 38 درجة مئوية. ترتبط درجة حرارة التهجين ارتباطا إيجابيا وثيقا بتركيز المسبار ؛ لذلك ، لتحسين الخلفية ، يجب تقليل تركيز المسبار. أخيرا ، من الأهمية بمكان أيضا وضع ضوابط سلبية وإيجابية. يتم استخدام المجموعة بدون مسبار كعنصر تحكم سلبي للحصول على إشارات الخلفية. يستخدم مسبار U6 أو مسبار الحمض النووي الريبوزي الريبوسوم كعنصر تحكم إيجابي لاستبعاد احتمال حدوث نتائج إيجابية خاطئة.
هذا النهج له العديد من المزايا. يمكن تغيير اللون الفلوري لتحقيقات lncRNA. ينبعث التألق الأخضر من الفلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC) والفلوريسئين (FAM) و Alexa Fluor 488 ، بينما ينبعث التألق الأحمر بواسطة Cy3 و Alexa Fluor 555. يستخدم FITC للأخضر النموذجي و Cy3 للأحمر النموذجي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الحصول على الصور باستخدام مجهر مضان أو مجهر ليزر متحد البؤر. صور الأخير أكثر حساسية ووضوحا من تلك التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر مضان.
الحد من طريقة RNA FISH هو أن هذه طريقة نوعية. لذلك ، فإن النتائج غير قابلة للقياس الكمي. نظرا للتغير في وقت التهجين وتأثير العوامل الذاتية أثناء مراقبة المجهر الفلوري ، لا يمكن قياس تعبير lncRNA بدقة في الخلايا. لا يمكن تقييم مستويات التعبير عن lncRNAs في الكسور الخلوية المختلفة إلا نوعيا. ومع ذلك ، مع تحسين التقنية ، تم تطوير طريقة التهجين الفلوري في الموقع (smFISH) أحادية الجزيء22 لتحديد مستوى تعبير الحمض النووي الريبي. قد يتم الإبلاغ عن المزيد من اكتشاف smFISH في المستقبل.
تقنية RNA FISH لديها مجموعة واسعة من التطبيقات. سيفيد الكشف عن التوطين داخل الخلايا ل lncRNAs دراسة الآليات البيولوجية ل lncRNAs. في الوقت نفسه ، يمكن أيضا استخدام هذه التقنية للكشف عن توطين الحمض النووي الريبي الآخر غير المشفر في الخلايا ، بما في ذلك circRNAs و miRNAs و tRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
يتم دعم هذا العمل بمنح من (1) البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2020YFE0201600) ؛ (2) المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة (81973877 و 82174408) ؛ (3) مركز شنغهاي للابتكار التعاوني للتحول الصناعي لإعداد الطب الصيني التقليدي للمستشفى ؛ (4) المشاريع البحثية في حدود ميزانية جامعة شنغهاي للطب الصيني التقليدي (2021LK047).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Cell culture plate-12 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 3513,corning | Place the coverslips in the plate |
| Cell line (143B) | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences | CRL-8303 | osteosarcoma cancer cell line |
| Centrifuge tube (15 mL, 50 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| Coverslips | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | abs7026 | The cells are seeded on the coverslips |
| Cy3 label-SNHG6 DNA probe | Shanghai GenePharma Co.,Ltd | A10005 | Detect SNHG6 location |
| DMEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Dry Bath Incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | DKT200-2 | Incubation at different high temperatures |
| Ethanol 100% | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | dehydration |
| Fluorescence microscope | Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD | Olympus BX43 equipped with a camera of Olympus U-TV0.5XC-3(SN:5J01719),olympus | Observation and positioning |
| Incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD | DHP-9051 | The samples were incubated at 37 °C. |
| Mounting Medium | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E675004 | Attach the coverslips to the slide |
| Shaker | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd. | TS-8S | Washing sample |
| Slide | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 188105 | The coverslips is placed on the slide |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600198 | Permeable membrane and nuclear membrane |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Tween-20 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600560 | detergent |
References
- Djebali, S., et al.
- Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular Biology. 326, 33-65 (2016).
- Pan, R., et al. lncRNA FBXL19-AS1 regulates osteosarcoma cell proliferation, migration and invasion by sponging miR-346. OncoTargets and Therapy. 11, 8409-8420 (2018).
- Jia, D., Niu, Y., Li, D., Liu, Z. lncRNA C2dat1 promotes cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-34a-5p in osteosarcoma cells. Oncology Research. 26 (5), 753-764 (2018).
- Liu, Y., Wang, D., Ji, Q., Yan, J. LncRNA MATN1-AS1 for prediction of prognosis in osteosarcoma patients and its cellular function. Molecular Biotechnology. 64 (1), 66-74 (2022).
- Luo, M. L. Methods to study long noncoding RNA biology in cancer. Advances in Experimental Medicine and Biology. 927, 69-107 (2016).
- Zhao, A., et al. lncRNA TUSC7 inhibits osteosarcoma progression through the miR-181a/RASSF6 axis. International Journal of Molecular Medicine. 47 (2), 583-594 (2021).
- Tong, C. J., et al. LncRNA RUSC1-AS1 promotes osteosarcoma progression through regulating the miR-340-5p and PI3K/AKT pathway. Aging. 13 (16), 20116-20130 (2021).
- Qi, X., et al. ceRNA in cancer: possible functions and clinical implications. Journal of Medical Genetics. 52 (10), 710-718 (2015).
- Tripathi, V., Fei, J., Ha, T., Prasanth, K. V. RNA fluorescence in situ hybridization in cultured mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 1206, 123-136 (2015).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Thomsen, R., Nielsen, P. S., Jensen, T. H. Dramatically improved RNA in situ hybridization signals using LNA-modified probes. RNA. 11 (11), 1745-1748 (2005).
- Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
- Hazra, R., Spector, D. L. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 986261 (2022).
- Xu, M., et al. lncRNA SNHG6 regulates EZH2 expression by sponging miR-26a/b and miR-214 in colorectal cancer. Journal of Hematology & Oncology. 12 (1), 3 (2019).
- Yan, K., Tian, J., Shi, W., Xia, H., Zhu, Y. LncRNA SNHG6 is associated with poor prognosis of gastric cancer and promotes cell proliferation and EMT through epigenetically silencing p27 and sponging miR-101-3p. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 42 (3), 999-1012 (2017).
- Zhu, X., Yang, G., Xu, J., Zhang, C. Silencing of SNHG6 induced cell autophagy by targeting miR-26a-5p/ULK1 signaling pathway in human osteosarcoma. Cancer Cell International. 19, 82 (2019).
- Birgani, M. T., et al. Long non-coding RNA SNHG6 as a potential biomarker for hepatocellular carcinoma. Pathology Oncology Research: POR. 24 (2), 329-337 (2018).
- Nielsen, B. S., et al. Detection of lncRNA by LNA-based in situ hybridization in paraffin-embedded cancer cell spheroids. Methods in Molecular Biology. 2348, 123-137 (2021).
- Li, Y., et al. Long noncoding RNA SNHG6 regulates p21 expression via activation of the JNK pathway and regulation of EZH2 in gastric cancer cells. Life Sciences. 208, 295-304 (2018).
- Traylor-Knowles, N. In situ hybridization techniques for paraffin-embedded adult coral samples. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e57853 (2018).
- Wang, S. Single molecule RNA FISH (smFISH) in whole-mount mouse embryonic organs. Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 79 (2019).
