Summary
Dette papir giver en protokol til proteinkvantificering ved hjælp af Bradford-analysen og en smartphone som analytisk enhed. Proteinniveauer i prøver kan kvantificeres ved hjælp af farvedata ekstraheret fra et billede af en mikroplade taget med en smartphone.
Abstract
Proteinkvantificering er en vigtig procedure inden for biovidenskabelig forskning. Blandt flere andre metoder er Bradford-analysen en af de mest anvendte. På grund af dets udbredelse er begrænsningerne og fordelene ved Bradford-analysen blevet udtømmende rapporteret, herunder flere ændringer af den oprindelige metode for at forbedre dens ydeevne. En af ændringerne i den oprindelige metode er brugen af et smartphone-kamera som et analytisk instrument. Ved at udnytte de tre former for Coomassie Brilliant Blue-farvestoffet, der findes under betingelserne i Bradford-analysen, beskriver dette papir, hvordan man nøjagtigt kvantificerer protein i prøver ved hjælp af farvedata ekstraheret fra et enkelt billede af en mikroplade. Efter udførelse af analysen i en mikroplade tages et billede ved hjælp af et smartphone-kamera, og RGB-farvedata ekstraheres fra billedet ved hjælp af en gratis og open source billedanalysesoftwareapplikation. Derefter bruges forholdet mellem blå og grøn intensitet (i RGB-skalaen) af prøver med ukendte koncentrationer af protein til at beregne proteinindholdet baseret på en standardkurve. Der observeres ingen signifikant forskel mellem værdier beregnet ved hjælp af RGB-farvedata og dem, der beregnes ved hjælp af konventionelle absorbansdata.
Introduction
Uanset downstream-brugen (f.eks. ELISA, enzymkinetik, western blotting, proteinoprensning og massespektrometri) er proteinkvantificering afgørende for nøjagtig analyse i biovidenskabelige laboratorier. Ud over deres anvendelse som sekundære aflæsninger (dvs. til beregning af relative niveauer af analysander pr. Masse protein) kan proteinniveauer i en prøve også være det ønskede output selv. For eksempel kan man være interesseret i proteinniveauer i fødevareressourcer1 eller i urin2. Der findes mange metoder til måling af proteinkoncentration i prøver3, herunder direkte UV-absorbansaflæsninger4, protein-kobberchelation 5,6, proteinfarvestofbindende kolorimetriske assays7 og proteinfarvestofbindende fluorescerende assays8. Relevansen af proteinkvantificering fremgår af tilstedeværelsen af to artikler, der beskriver proteinmålemetoder 5,7 i top-3 i den mest citerede litteratur 9,10. På trods af at mange forfattere forsømmer deres faktiske citat ved at citere ikke-primære referencer eller slet ikke citere noget, udgør de originale papirer, der beskriver Lowry-proteinanalysen og Bradford-proteinanalysen, > 200.000 citationer hver10.
Populariteten af Bradford-analysen stammer fra dens overkommelighed, enkelhed, hastighed og følsomhed. Analysen er baseret på interaktionen mellem proteiner og farvestoffet Coomassie Brilliant Blue G under sure forhold. Under betingelserne for analysen (dvs. lav pH) findes farvestoffet i tre former: en rød kationisk form med λmax ved 470 nm; en grøn neutral form med λmax ved 650 nm; og en blå anionisk form med λmax ved 590 nm11,12 (figur 1). Den kationiske form dominerer i fravær af proteiner. Når proteiner interagerer med farvestoffet, stabiliserer de den blå anioniske form, hvilket forårsager en mærkbar ændring i opløsningens farve, fra brunlig til blå. Normalt kvantificeres ændringen i koncentrationen af farvestoffets blå form specrophotometrisk, hvis absorbans ved 590-595 nm er proportional med mængden af protein i analysen.
Figur 1: Coomassie brilliant blue G-absorptionsspektre under Bradford-assayets betingelser. De tre hovedtoppe er markeret med pile, der angiver λmax for de røde (470 nm), grønne (650 nm) og blå (590 nm) former af farvestoffet. Spektre blev registreret i fravær af protein (gul linje) og i nærværelse af 3 μg (grå linje) og 10 μg (blå linje) bovint serumalbumin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Den udbredte anvendelse af Bradford-analysen har ført til identifikation af flere begrænsninger (f.eks. variable reaktioner på forskellige proteiner11 og interferens fra lipider13 og vaskemidler7) og udvikling af modifikationer for at forbedre dets ydeevne (f.eks. tilsætning af vaskemidler14,15, alkalisering14,16 og anvendelse af forholdet mellem absorbanser17). Ud over ændringer i selve analysen er brugen af alternative enheder, såsom smartphones eller kameraer, til at fange analytiske signaler også blevet beskrevet 18,19,20. Faktisk har udviklingen af metoder, der gør brug af smartphones som bærbare kemiske analysatorer, været et aktivt forskningsområde. Motivationen for brugen af smartphones stammer fra overkommeligheden, bærbarheden, brugervenligheden og den udbredte tilgængelighed af disse enheder.
Dette papir giver en protokol til proteinkvantificering ved hjælp af RGBradford-assay20, der bruger en smartphone som analytisk enhed. I modsætning til den originale RGBradford-publikation20 er der her indført en procedure, der strømliner farveudtrækningsprocessen. Det indebærer brug af en frit tilgængelig softwareapplikation til automatisk at udtrække farveinformation fra hver brønd i et mikropladebillede, hvilket sparer betydelig tid og kræfter. Dette er et alternativ til den tidligere metode til manuelt at erhverve farvedata fra hver brønd en efter en ved hjælp af en grafikredigeringssoftwareapplikation20. I sidste ende kan proteinniveauer i prøver kvantificeres ved hjælp af farvedata ekstraheret fra et billede af en mikroplade taget med en smartphone.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Bradford-proteinassayreagenset
- 100 mg Coomassie Brilliant Blue G opløses i 50 ml 95% (w/v) ethanol. Bland indtil Coomassie Brilliant Blue G er helt opløst.
FORSIGTIG: Ethanol er brandfarligt og forårsager øjenirritation. Undgå flammer og brug beskyttelsesbriller. - Til den forrige opløsning tilsættes forsigtigt 100 ml 85% (w/v) fosforsyre.
FORSIGTIG: Fosforsyre er ætsende for metaller og forårsager hudætsning, alvorlig øjenskade og akut oral toksicitet. Brug handsker og beskyttelsesbriller. - Tilsæt opløsningen indeholdende Coomassie Brilliant Blue G, ethanol og fosforsyre langsomt til 600 ml deioniseret vand.
- Fortynd opløsningen til et slutvolumen på 1.000 ml. Skaler op eller ned i henhold til antallet af prøver, der skal analyseres. Som beskrevet i den oprindelige metode7 bør slutkoncentrationerne i Bradford-reagenset være 0,01% (w/v) Coomassie Brilliant Blue G, 4,7% (w/v) ethanol og 8,5% (w/v) phosphorsyre.
- Fjern eventuel uopløselig materialefiltrering gennem filterpapir (Whatman #1 papir eller tilsvarende).
- Reagenset er stabilt i flere uger, når det opbevares ved stuetemperatur (RT) og beskyttes mod lys. Filtrer efter behov, da der kan dannes bundfald over tid.
BEMÆRK: Alternativt er Bradford-reagenser, der er klar til fortynding og brug, kommercielt tilgængelige. Følg producentens anvisninger til klargøring af reagenset, og fortsæt til næste trin.
2. Fremstilling af proteinstandardopløsninger
- Der fremstilles en stamopløsning (se trin 2.4) af et isoleret protein, der skal anvendes som standard. Et overkommeligt og almindeligt anvendt protein er bovin serumalbumin (BSA). Andre muligheder er ovalbumin og bovin gammaglobulin.
- Hvis den molære absorptionsevne af det protein, der anvendes som standard, er kendt, kontrolleres stamopløsningens koncentration i et spektrofotometer.
- For BSA er en almindeligt anvendt formel BSA (mg/ml) = (A280/6,6) × 10, hvor A280 er absorbansen ved 280 nm med en banelængde på 1 cm læst mod en passende blindprøve (dvs.ε 2801% = 6,6)7. For eksempel har 0,8 mg/ml BSA en absorbans på 0,528 ved 280 nm.
- For at generere standardkurven fremstilles flere fortyndinger af BSA inden for 0,025 mg/ml og 1,0 mg/ml. Disse vil resultere i 0,25-10 μg BSA pr. brønd efter tilsætning af et prøvevolumen på 10 μL pr. brønd.
BEMÆRK: Proteinstandardopløsninger skal fremstilles i et medium med samme sammensætning (slutkoncentration) af det medium, der anvendes til fremstilling af prøver.
3. Indhold
- Fortynd prøverne for at opnå en proteinkoncentration inden for standardkurveområdet på 0,025-1,0 mg / ml. Der skal være flere (mindst 3) prøvefortyndinger inden for området.
BEMÆRK: Prøver kan fortyndes med fosfatbufret saltvand (PBS) eller enhver anden medium/buffersammensætning, der er kompatibel med Bradford-reagenset. Den endelige koncentration af mediumkomponenter bør ikke afvige mellem standard og prøver. - Der tilsættes 10 μL af hver proteinstandardopløsning til tre huller (dvs. i tre eksemplarer) af en mikroplade med 96 huller. For proteinpunktet 0 (nul) tilsættes 10 μL af det buffer/medium, der anvendes til fremstilling af standardopløsninger og prøvefortyndinger.
- Til et andet sæt brønde tilsættes 10 μL af hver prøvefortynding til tre huller (dvs. i tre eksemplarer) af den samme mikroplade med 96 brønde. En fremgangsmåde er at tilføje forskellige volumener af en prøve og komplet med et medium på op til 10 μL pr. hul (f.eks. 0,5 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL og 8 μL af prøven plus 9,5 μL, 9 μL, 8 μL, 6 μL og 2 μL medium).
- Der tilsættes 250 μL Bradford-proteinassayreagens til alle huller. En typisk mikropladeopsætning er vist i figur 2. I dette eksempel blev et sæt tomme brønde indeholdende 260 μL (det endelige volumen pr. brønd) vand inkluderet for at tjene som tomme i en mikropladelæser (trin 4.5). Dette kræves kun, hvis der også indsamles absorbansdata.
BEMÆRK: Forbered en standardkurve i den samme mikroplade af prøver, hver gang analysen udføres. Med andre ord, hvis antallet af prøver kræver en anden plade, skal du forberede en anden standardkurve i den anden plade osv. - Optag resultater (sektion 4) inden for 5-15 min.
Figur 2: Et typisk pladelayout for Bradford-proteinanalysen. Blank refererer til tre brønde indeholdende 260 μL vand, der skal bruges som blind i en mikropladelæser. STD refererer til proteinstandarder. S1-S6 er seks forskellige prøver. SX_1-SX_4 er fire forskellige prøvefortyndinger for hver prøve. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Registrering af resultater
- I et godt oplyst rum skal du holde mikropladen parallelt med bænken mod en ensartet hvid baggrund (f.eks. Et papirark) med den ene hånd. Sørg for nøjagtig justering ved at placere et bobleniveau på pladen.
- Med den anden hånd skal du holde smartphonen parallelt (nogle kameraapplikationer angiver nyttigt enhedens hældning) til bænken og mikropladen og tage et eller flere billeder af hele mikropladen (figur 3). På iOS-enheder skal du tænde kameraniveauindikatoren i kameraindstillingerne ved at aktivere indstillingen Grid . På Android-enheder skal du aktivere kameraniveauindikatoren i kameraindstillingerne ved at aktivere Indramningstip.
- Der kræves ikke noget specielt belysningsapparat, men pas på at undgå skygger og refleksioner. Undgå for eksempel at skygge pladen eller baggrunden med smartphonen, og undgå at skygge baggrunden med mikropladen. Små refleksioner i kanterne af brøndområdet er ikke et problem; Farvedata kan udvindes fra et meget lille område i midten af hver brønd.
- Kontroller kort billedet for baggrundsensartethed, skygger og refleksioner. Se også på brøndenes vinkel; Midten af hver brønd skal være direkte synlig (dvs. ikke bag brøndvægge).
- Hvis sammenligningen mellem mikropladeabsorbansaflæsninger og billedfarvedata ønskes, aflæses mikropladen ved 590 nm og 450 nm i en mikropladelæser21.
Figur 3: Indfangning af resultaterne af Bradford-proteinanalysen. I et godt oplyst rum placeres mikropladen parallelt med bænken mod en ensartet baggrund med den ene hånd. Med den anden hånd holdes smartphonen parallelt med bænken og mikropladen. Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Udpakning af farvedata-Automatisk
- Download ImageJ og ReadPlate22, et ImageJ-plugin er tilgængeligt på https://imagej.nih.gov/ij/plugins/readplate/index.html (dette er en .txt-fil).
- Åbn ImageJ, klik på Plugins > Install , og vælg den fil, der blev downloadet i trin 6.1.
- Indstil måleparametrene ved at klikke på Analysér > Indstil målinger , og kontroller følgende indstillinger: Areal; Standardafvigelse; Min & max grå værdi; Gennemsnitlig grå værdi; Modal grå værdi. Nederst i vinduet skal du indstille Omdiriger til: Ingen og Decimaler (0-9): 3.
- Gå til Filer > Åbn , og vælg billedet af mikropladen taget i trin 4.
- Gå til Plugins > ReadPlate. Læs vejledningen, og klik derefter på OK.
- Vælg antallet af brønde: 96.
- Brug det rektangulære markeringsværktøj, der automatisk indlæses af pluginet, til at oprette et rektangel, der begynder i midten af A1-brønden og slutter i midten af H12-brønden. Klik derefter på OK.
- Vælg den blå kanal, og klik på OK.
- Bekræft standardparametrene ved at klikke på OK.
- Kontroller, om softwaren afgrænsede et område inde i hver brønd, og om de valgte områder ikke dækker områder med unormale skygger eller refleksion. Klik på OK.
- Gem resultaterne, og gentag trin 5.8-5.10 for den grønne kanal.
- Beregn forholdet mellem blå og grøn ved hjælp af tilstanden for hver farve.
BEMÆRK: Beregningen kan udføres manuelt eller ved hjælp af softwaren i læserindstillingerne, såsom R, Microsoft Excel eller GraphPad Prism.
6. Udpakning af farvedata-manuelt
- Download Inkscape, en gratis og open source grafikeditor.
BEMÆRK: Enhver software med farvevælgerværktøjet (normalt afbildet som en øjendråber) kan bruges til at identificere farven og udtrække RGB-data. - Åbn Inkscape, gå til File > Open. Vælg billedet af mikropladen taget i trin 4.
- Vælg værktøjet Vælg og transformer objekter (S), der er afbildet som en pil øverst til venstre, og klik på billedet. En stiplet linjekant angiver markeringen.
- Vælg værktøjet Vælg farver fra billede (D), der er afbildet som en øjendråber i venstre side.
- Klik i midten af en brønd. Farven på bundpanelet ("Fyld:") ændres tilsvarende. Klik på farven, og en Udfyld og streg fane vises i højre side.
- Skift rullemenuen Flad farve til RGB. Registrer de værdier, der vises for de blå og grønne kanaler for hvert felt.
- Beregn forholdet mellem blå og grøn ved hjælp af de registrerede værdier.
BEMÆRK: Beregningen kan udføres manuelt eller ved hjælp af softwaren i læserindstillingerne, såsom R, Microsoft Excel eller GraphPad Prism.
7. Opbygning af standardkurver og ekstrapolering af ukendte
- Det gennemsnitlige grøn-til-blå intensitetsforhold plottes som funktion af proteinstandardkoncentrationen.
BEMÆRK: Afbild dataene manuelt eller ved hjælp af softwaren i læserindstillingerne, såsom R, Microsoft Excel eller GraphPad Prism. - Beregn det gennemsnitlige forhold mellem grøn og blå intensitet for hver prøve og fortynding.
- Kontroller, om signalet opnået for prøven ligger inden for proteinstandardens lineære område.
- Ignorer værdier under eller over minimum- eller maksimumværdierne for standardkurven.
- Brug den lineære ligning, der beskriver standardkurven, til at ekstrapolere mængden af protein i prøven. De beregnede værdier multipliceres med fortyndingsfaktoren i overensstemmelse hermed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 er et billede af en mikroplade, hvorfra farvedata blev ekstraheret, og absorbans ved 450 nm og 590 nm blev registreret. RGB-farvedataene, der her rapporteres som repræsentative, blev indhentet automatisk som beskrevet i afsnit 5. Et typisk mønster af farvedata er en stigning i de blå værdier og et fald i de røde og grønne værdier (figur 5). Bemærk, at på trods af den tydelige refleksion i alle brønde og en ikke perfekt justeret mikroplade (figur 4), afspejler farvedata udtrukket fra billedet nøjagtigt absorbansaflæsninger (figur 6). Der er også et lineært forhold mellem prøvefortynding og signal for både absorbansaflæsninger og farvedata (figur 7). Til disse repræsentative resultater blev der anvendt to prøver, et BV-2-cellelysat (B001) og et Galleria mellonella-homogenat (G001) fremstillet som tidligere beskrevet20, hvoraf 0,5 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL og 8 μL blev anvendt til hver brønd. Volumenet blev justeret til 10 μL med buffer før tilsætning af 250 μL Bradford-reagens.
Figur 4: Et repræsentativt billede af en Bradford-analysemikroplade. Bemærk lamperefleksionen på hver brønd og forkert justering af brønde (dvs. højre side af pladen vippes ned). Disse bør minimeres som muligt, men perfekt justering og belysning er ikke nødvendig (se repræsentative resultater). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Farveintensitet fra de tre RGB-kanaler som funktion af proteinkoncentrationen. Hvert punkt repræsenterer en brønd med standardkurven i mikropladen vist i figur 4. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Absorbansaflæsninger versus RGB-farvedata udtrukket fra et billede. Hvert punkt repræsenterer en brønd med standardkurven i mikropladen vist i figur 4. Den gule skygge repræsenterer 95 % konfidensintervallet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Signalintensitet versus prøvevolumen. Kolonner er forskellige signaler fra forskellige metoder: absorbansaflæsninger (absorbans) og RGB-farvedata ekstraheret (RGB-data). Rækker er forskellige prøver: et BV-2-cellelysat (B001) og et Galleria mellonella-homogenat (G001). Hvert punkt er gennemsnitsværdien af tre brønde af et givet prøvevolumen. Den gule skygge repræsenterer 95 % konfidensintervallet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Standardkurven (signal versus BSA-koncentration) skal være strengt lineær, som vist for en repræsentativ standardkurve bygget med BSA-koncentrationer på 0,025 mg / ml, 0,05 mg / ml, 0,1 mg / ml, 0,2 mg / ml, 0,4 mg / ml, 0,6 mg / ml, 0,8 mg / ml og 1,0 mg / ml (figur 8).
Figur 8: En typisk standardkurve, der illustrerer lineariteten af blå-til-grøn-forholdet med koncentrationen af bovin serumalbumin (BSA). De koncentrationer, der anvendes til en typisk standardkurve, er 0 mg / ml, 0,025 mg / ml, 0,05 mg / ml, 0,1 mg / ml, 0,2 mg / ml, 0,4 mg / ml, 0,6 mg / ml, 0,8 mg / ml og 1,0 mg / ml. Hvert punkt er gennemsnitsværdien af tre brønde i hver BSA-koncentration. Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelsen. Den gule skygge repræsenterer 95 % konfidensintervallet. Klik her for at se en større version af denne figur.
I dette eksempel på repræsentative resultater lå nogle af fortyndingerne ikke inden for standardkurvens lineære område (figur 9). For prøve B001 resulterede 8 μL i et signal over standardkurvens højeste punkt. I tilfældet G001 resulterede 0,5 μL og 1 μL i signaler under standardkurvens laveste punkt. For begge prøver skal disse fortyndinger, der ligger uden for standardkurvens lineære område, kasseres. Efter at have ignoreret aflæsninger uden for standardkurvens område adskiller proteinniveauerne beregnet ved hjælp af absorbansaflæsninger sig ikke fra dem, der beregnes ved hjælp af RGB-data for begge prøver (figur 10). Sammenligningen mellem absorbansdata og RGB-data ved hjælp af en t-test resulterede i p = 0,63 for prøve B001 og p = 0,17 for prøve G001.
Figur 9: Blå-til-grøn-forhold som opnået ved hjælp af RGBradford-metoden versus prøvevolumen. De vandrette linjer afgrænser minimums- og maksimumsforholdet mellem blå og grøn for standardkurven (figur 8). Blå cirkler repræsenterer et BV-2-cellelysat (B001), og røde symboler repræsenterer et Galleria mellonella-homogenat (G001). Fejlbjælker repræsenterer standardafvigelsen. Bemærk, at nogle prøvefortyndinger ligger uden for standardkurvens område. Den gule skygge repræsenterer 95 % konfidensintervallet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Proteinkoncentration i to biologiske prøver kvantificeret med Bradford-proteinanalysen ved hjælp af konventionelle absorbansaflæsninger (ABS) og RGBradford-metoden (RGB). Blå symboler repræsenterer et BV-2-cellelysat (B001), og røde symboler repræsenterer et Galleria mellonella-homogenat (G001). Hver cirkel repræsenterer en enkelt brønd, hvorfra data blev opnået. Diamanter angiver middelværdien, og de lodrette linjer spænder fra minimums- til maksimumsværdierne for hver prøve/metode. Der er ingen forskelle mellem metoder (B001, t test, p = 0, 63; G001, t test, p = 0,17). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Signaler opnået ved hjælp af forskellige smartphones. Pearson korrelationskoefficienter for signalet (blå-til-grønt forhold) opnået med forskellige smartphone-modeller og signalet (A590 / A450) fra Spectramax iD3 mikropladelæser. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver RGBradford, en metode, der bruger et smartphone-kamera til at registrere data fra et Bradford-proteinassay, ekstrahere farvedata og nøjagtigt kvantificere proteinniveauer i biologiske prøver som oprindeligt beskrevet for nylig20. En forskel fra den originale RGBradford-metode er, at her blev der brugt en procedure til automatisk hentning af farvedata med et ImageJ-plugin22 . Den vigtigste nyhed ved RGBradford-metoden er brugen af RGB-data som analytiske signaler; således kan man bruge den rutinemæssige protokol, der bruges i sit laboratorium til proteinbestemmelse med Coomassie Brilliant Blue G og derefter tage et billede af det og udtrække farvedata. Med andre ord kan trin 1-3 i protokollen ændres i henhold til den sædvanlige procedure, der anvendes i et givet laboratorium. I betragtning af eksistensen af flere modifikationer af det oprindelige Bradford-proteinassay kan man bruge det, der fungerer bedst for dets prøvetype / natur og fortsætte til dataregistrering.
Denne protokol har to kritiske trin, billedoptagelse og farvedataudtræk. Her og tidligere20 var der ikke behov for specielle belysningsapparater, og der blev opnået tilfredsstillende resultater (dvs. der var ingen forskel mellem resultaterne fra absorbansaflæsninger og farvedata ekstraheret fra et billede). Ikke desto mindre kan man vælge at bruge en platform til at optimere billedoptagelsen, for eksempel ved hjælp af en transilluminator19,22. Hovedproblemet er at sikre en ensartet baggrund og belysning. Desuden kan der opnås tilsvarende resultater med forskellige smartphone-modeller. På trods af små forskelle i signalet opnået med hver enhed er der stærke (Pearsons r > 0.99) og signifikante (p < 0.0001) korrelationer mellem fire testede smartphone-modeller (Samsung S22 Ultra, Apple iPhone 11, Apple iPhone 14 Pro og XIAOMI Redmi Note 9 Pro). Der er også signifikante korrelationer mellem det signal, der opnås med dem, og signalet fra en pladelæser (supplerende figur 1). I tilfælde af farvedataekstraktion skal man være forsigtig, når man bruger ReadPlate-pluginet, især i gitterkontroltrinnet, når man skal inspicere, om gitteret passer til placeringen af hver brønd. Man bør sørge for, at gittercirklerne ikke omfatter brøndenes vægge eller et unormalt område (f.eks. et område med lysrefleksion). Gitterjustering kan være særlig vanskelig, hvis pladen på billedet ikke er vinkelret placeret på baggrunden, hvilket gør det vanskeligt at tegne et rektangulært udvalg af brønde fra centrum til center korrekt (fra øverste venstre til nederste højre hjørne).
Fordelene ved RGBradford-metoden sammenlignet med de konventionelle spektroskopiske aflæsninger er de samme som andre metoder, der bruger smartphones i stedet for specialiserede enheder (f.eks. Mikropladelæsere). Smartphones er bredt tilgængelige, billigere end spektrofotometre, fungerer på batteri i timevis, har datalagringskapacitet og kommunikerer trådløst og eksternt med andre enheder. Alt i alt tillader disse brugen af Bradford-proteinanalysen på fjerntliggende steder eller ikke-standardiserede laboratorieforhold, såsom point-of-care-enheder, klasseværelser, feltekspeditioner og samfund med lav ressource. Det optagne billede kan derefter analyseres yderligere og fortolkes senere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Council for Scientific and Technological Development (CNPq, Brasilien) [bevillingsnumre 428048/2018-8 og 402556/2022-4] og University of Brasilia (Brasilien). Forfatteren takker Dr. Duarte Nuno Carvalho og Dr. Evelyn Santos (i3s, Porto, Portugal) for at give adgang til deres smartphones, der bruges i denne forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates | Jet Biofil, Guangzhou, China | TCP011096 | Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice. |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2153 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B0770 | |
| Ethyl alcohol | |||
| iPhone 11 | Apple | MWM02BR/A | Can be substituted with other smartphone equiped with a camera |
| iPhone 14 Pro | Apple | N/A | |
| Phosphoric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 695017 | |
| Redmi Note 9 Pro | XIAOMI | N/A | |
| S22 Ultra | Samsung | N/A | |
| SpectraMax 384 Plus. Microplate reader. | Molecular Devices, San Jose, CA | PLUS 384 | Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader. |
References
- Zaguri, M., Kandel, S., Rinehart, S. A., Torsekar, V. R., Hawlena, D. Protein quantification in ecological studies: A literature review and empirical comparisons of standard methodologies. Methods in Ecology and Evolution. 12 (7), 1240-1251 (2021).
- Koga, T., et al. Mild electrical stimulation and heat shock ameliorates progressive proteinuria and renal inflammation in mouse model of Alport syndrome. PLoS One. 7 (8), e43852 (2012).
- Peterson, G. L.
- Goldfarb, A. R., Saidel, L. J., Mosovich, E. The ultraviolet absorption spectra of proteins. The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 397-404 (1951).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Smith, P. K., et al.
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Datki, Z., et al. Application of BisANS fluorescent dye for developing a novel protein assay. PLoS One. 14 (4), e0215863 (2019).
- Van Noorden, R., Maher, B., Nuzzo, R.
- Elsevier, B. V. Scopus. , Available from: https://www.scopus.com/ (2022).
- Compton, S. J., Jones, C. G. Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Analytical Biochemistry. 151 (2), 369-374 (1985).
- Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G. Analytical Biochemistry. 209 (2), 258-266 (1993).
- Pande, S. V., Murthy, M. S. R. A modified micro-Bradford procedure for elimination of interference from sodium dodecyl sulfate, other detergents, and lipids. Analytical Biochemistry. 220 (2), 424-426 (1994).
- Gogstad, G. O., Krutnes, M. -B. Measurement of protein in cell suspensions using the Commassie brilliant blue dye-binding assay. Analytical Biochemistry. 126 (2), 355-359 (1982).
- Friedenauer, S., Berlet, H. H. Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analytical Biochemistry. 178 (2), 263-268 (1989).
- Stoscheck, C. M. Increased uniformity in the response of the Coomassie blue G protein assay to different proteins. Analytical Biochemistry. 184 (1), 111-116 (1990).
- Zor, T., Selinger, Z. Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: Theoretical and experimental studies. Analytical Biochemistry. 236 (2), 302-308 (1996).
- Gee, C. T., Kehoe, E., Pomerantz, W. C. K., Penn, R. L. Quantifying protein concentrations using smartphone colorimetry: A new method for an established test. Journal of Chemical Education. 94 (7), 941-945 (2017).
- de Camargo, C., Vicentini, M., Gobbi, A., Martinez, D., Lima, R. Smartphone for point-of-care quantification of protein by Bradford assay. Journal of the Brazilian Chemical Society. 28 (4), 689-693 (2016).
- Moreira, D. C. RGBradford: Accurate measurement of protein concentration using a smartphone camera and the blue to green intensity ratio. Analytical Biochemistry. 655, 114839 (2022).
- Ernst, O., Zor, T.
- Angelani, C. R., et al. A metabolic control analysis approach to introduce the study of systems in biochemistry: the glycolytic pathway in the red blood cell: Metabolic control analysis and the glycolytic pathway. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (5), 502-515 (2018).
