Summary
ここでは、脈絡叢の遺伝子発現を選択的に変化させながら、他の脳領域への影響を回避する方法について説明します。
Abstract
脈絡叢(ChP)は、生理学的および病理学的条件下で中枢神経系(CNS)への免疫細胞浸潤の重要なゲートウェイとして機能します。最近の研究では、ChP活性を調節することで、中枢神経系疾患に対する保護が得られる可能性があることが示されています。しかし、ChPはデリケートな構造をしているため、他の脳領域に影響を与えずにChPの生物学的機能を研究することは困難です。本研究は、アデノ随伴ウイルス(AAV)またはTAT配列からなる環化組換え酵素(Cre)リコンビナーゼタンパク質(CRE-TAT)を用いて、ChP組織における遺伝子ノックダウンのための新しい方法を提示する。この結果は、AAVまたはCRE-TATを側脳室に注入した後、蛍光がChPにのみ集中していたことを示しています。 このアプローチにより、RNA干渉(RNAi)またはX-overP1(Cre/LoxP)システムのCre/遺伝子座を使用して、ChPのアデノシンA 2A受容体(A2A R)をノックダウンすることに成功し、このノックダウンが実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の病態を緩和できることを示しました。この手法は、中枢神経系疾患におけるChPの役割に関する将来の研究に重要な意味を持つ可能性があります。
Introduction
脈絡叢(ChP)は、脳脊髄液(CSF)と脳由来神経栄養因子(BDNF)を分泌することにより、脳の機能的恒常性の維持に役立つと考えられていました1,2。過去30年間にわたる研究の増加により、ChPが中枢神経系(CNS)への免疫細胞浸潤の明確な経路であることが明らかになりました。
単層ChP上皮からなるChPのタイトジャンクション(TJ)は、高分子や免疫細胞が脳に侵入するのを防ぐことで免疫ホメオスタシスを維持しています3。しかし、特定の病理学的条件下では、ChP組織はCSFおよび血液中の危険関連分子パターン(DAMP)を検出して応答し、異常な免疫浸潤および脳機能障害を引き起こします4,5。ChPは重要な役割を担っているにもかかわらず、サイズが小さく、脳内のユニークな位置にあるため、他の脳領域に影響を与えずにその機能を研究することは困難です。したがって、ChPにおける遺伝子発現を特異的に操作することは、ChPの機能を理解するための理想的なアプローチです。
当初は、ChPに発現する遺伝子に特異的なプロモーターの制御下でCreを発現する環化組換え酵素(Cre)トランスジェニック株が、フロッサーした候補遺伝子と交配して標的遺伝子を欠失させるのが一般的であった6,7,8。例えば、転写因子Forkhead box J1(FoxJ1)は、マウスの出生前脳のChP上皮に排他的に発現している7。したがって、FoxJ1-Cre系統は、ChP6,9に位置する遺伝子を欠失させるためにしばしば使用された。しかし、この戦略の成功は、プロモーターの特異性に大きく依存しています。FoxJ1は脳や末梢系の他の部分の繊毛上皮細胞にも存在していたため、FoxJ1の発現パターンは十分に特徴的ではないことが徐々に発見されました7。この制限を克服するために、Creリコンビナーゼの脳室内(ICV)注射を実施して、フロッセ化されたトランスジェニック系統の心室にリコンビナーゼを送達しました。この戦略は、ChP組織のみにtdTomato蛍光が存在することからも明らかなように、高い特異性を示しました10,11。しかし、この方法は、フロックス処理されたトランスジェニックマウス株の利用可能性によってまだ制限されています。この問題に対処するために、研究者はアデノ随伴ウイルス(AAV)のICV注射を使用して、ChP特異的ノックダウンまたは標的遺伝子の過剰発現を達成しました12,13。ChP感染のさまざまなAAV血清型を包括的に評価したところ、AAV2/5およびAAV2/8はChPで強力な感染能力を示しますが、他の脳領域には感染しないことが明らかになりました。しかし、AAV2/8は脳室周囲の上衣に感染することがわかったのに対し、AAV2/5群は感染を示さなかった14。この方法は、フロッコスしたトランスジェニック動物を取得する際の限界を克服するという利点を有する。
本稿では、アデノシンA 2A受容体(A 2A R)のshRNAを運ぶAAV2/5のICVと、A2A RのChP特異的ノックダウンを達成するためのTAT配列(CRE-TAT)リコンビナーゼからなるCreリコンビナーゼタンパク質の2つの方法を用いて、ChPにおける遺伝子ノックダウンの段階的なプロトコルについて説明します。この研究結果は、ChP中のA2ARをノックダウンすることで、実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を緩和できることを示唆しています。この詳しいプロトコルはChPの機能調査およびChPの遺伝子の特定の打撃に有用な指導を提供する。
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Protocol
この研究で説明されているすべての動物手順は、実験動物のケアと使用に関するNIHガイドに概説されているガイドラインに従って実施され、温州医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1.動物
- 8〜12週齢、体重20〜22gの雄のC57BL / 6マウスを購入します。
- トランスジェニックRosa-LSL(Lox-StoP-Lox)-tdTomato(Ai9)マウス系統、および雄のA2ARflox/flox マウスを入手します。
- マウスを無作為に2つのグループに割り当て、ケージごとに最大5匹のマウスをケージに入れ、標準的な12時間のライト/12時間の暗サイクルで1週間飼育します。
- マウスに十分な餌と水を与え、25°Cで一定の温度に保ちます。
2. AAV2/5-shRNAによるA 2A RsのChP特異的ノックダウン
- 各マウスの重量を量り、値を書き留めます。
- 60〜80 mg / kgのペントバルビタールに相当する6〜8 mL / kgの投与量で1%ペントバルビタールナトリウムでマウスを腹腔内に麻酔し、マウスを加熱パッドの上に置いて保温します。.
注:手術を成功させるには、マウスの体重に応じて正しい用量のペントバルビタールナトリウムを投与することが重要です。麻酔は死に至る可能性があるため深すぎてはいけませんが、処置中にマウスが目を覚まし、ウイルス注射の効果に影響を与える可能性があるため、浅すぎてはいけません。つま先をつまんで適切な麻酔量を確認し、マウスが反応しないことを確認します。 - 専用のマウスシェーバーを使用して、麻酔をかけたマウスの上毛を刈ります。
- 乾燥を防ぐために両眼に軟膏を塗り、マウスを脳定位固定装置に固定して脳を固定します。滅菌ドレープで動物を覆います。
- マウスの頭頸部の皮膚をヨードフォア消毒剤と75%アルコールで3回徹底的に殺菌し、術後の感染を減らします。次に、1%リドカインをマウスの頭皮に局所的に塗布し、顕微鏡下で頭蓋骨を完全に露出させるために小さな切開を行います。
注意: 手順全体を通して滅菌器具を使用してください。 - 10 μLシリンジを2本用意し、1本はAAV2/5-A 2A R-shRNA(力価:6.27 × 10 9 vg/μL)を、もう1本はAAV2/5-Scramble(力価:6.21× 109 vg/μL)を購入したシリンジを用意します。
注:シリンジを使用する場合は、前端をガラスキャピラリーに接続する必要があり、ガラスキャピラリーの長さを制御することで10μLの範囲を得ることができます。 - 顕微鏡を使用してブレグマとラムダの位置を特定し、座標点を設定します(AP:-0.58;ML:±1.10;DL:-2.20)を10 μLシリンジに装着しました(図1)。座標点は、マウス脳定位固定装置アトラス15に基づく。
- 調整した座標点で頭蓋骨に小さな穴を開けます。
注:顕微鏡下では、頭蓋骨の表面に対して滅菌マイクロドリルを使用して穴あけが行われます。穿孔後、脳を覆っている髄膜を取り除き、その下にある脳実質を露出させることで、血管の損傷を防ぎます。このステップは、ガラス毛細血管の先端が髄膜によって壊れるのを防ぎます。ドリルで開けた穴の直径は、針先が脳組織に入るのに十分なものでなければなりません。 - AAV2/5-A2AR-shRNAウイルス2μLを100nL/minの定常速度で横方向注射 により 脳室に投与する。針を10分間所定の位置に置いてから引き抜きます。なお、ウイルスは一方的な注射で投与された。
- 医療用バイオフィブリン接着剤を使用して損傷した皮膚を速やかに密封し、ウイルスの損失を防ぎ、接着剤をすばやく塗布しない場合は、針を外した後にCSFで洗い流すことができます。また、綿棒を使用してCSFを拭くと、ウイルスの損失を引き起こす可能性があるため、使用しないでください。
- 回復を促進するために、マウスを加熱パッドの上に置き、体温を37.0±0.5°Cに維持し、マウスの頭皮に1%リドカインを局所的に塗布します。.AAV2/5-A2AR-shRNAウイルスの発現とその後のA2ARノックダウンに必要であるため、EAEモデルを誘導する前にマウスを2週間回復させます。
3. X-overP1(Cre/LoxP)系Cre/遺伝子座を有するA 2A RのChP特異的ノックダウン
注: 次の手順は、前述の方法で実行できます。詳細な注入方法については、手順2.1〜2.11を参照してください。
- 実験群としてRosa-LSL(Lox-StoP-Lox)-tdTomatoマウスの各側脳室に2μLのCRE-TATリコンビナーゼを注入し、対照群として2μLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を注入します。上記と同じプロトコル(セクション2)を使用して、2μLのCRE-TATリコンビナーゼをA2ARフロックス/フロックス マウスの各側脳室に、対照群として2μLの滅菌PBSとともに注入します。
- 凍結組織切片を調製し、CRE-TATリコンビナーゼ注射の2週間後に核染色を行います。詳細については、手順4.1〜4.3を参照してください。
4. マウスの経心灌流
- 60〜80 mg / kgのペントバルビタールナトリウムを投与して、マウスに深く麻酔をかけます。.つま先をつまんで麻酔面を確認し、40 mL の滅菌 PBS 溶液とそれに続く 20 mL の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を使用して経心灌流を行います。
注:灌流の成功は肝臓の白色で示されますが、灌流中の肺の肥大または口からのPBSの流出の存在は、手順の失敗を示唆しています。 - マウスの脳を迅速に抽出し、タンパク質の分解を最小限に抑えます。
- マウスの脳を4% PFA/PBSに一晩浸して固定後、30%スクロースPB溶液で72時間交換します。
注:脳組織の過度の脱水を避けることが重要であるため、脳をスクロースPB溶液に長時間放置しないでください。
5. 凍結組織の切片化と染色
- 以前に脱水したマウスの脳を最適切断温度(OCT)接着剤に埋め込み、埋め込まれた脳を凍結し、スライド式ミクロトームを使用して冠状切片を厚さ20μmで切断します。
- スライドガラスの上に脳の切片を置きます。脳切片が乾いたら、その後の実験のために-20°Cの冷蔵庫に保管します。
- 各スライドガラスをフレームケースに入れ、PBSで満たされた容器にフレームを沈めて、スライドを完全にすすいでください。ブレインスライドをPBS溶液で3回、毎回10分間静かにすすぎます。
注意: 脳の部分がスライドガラスから落ちないように注意する必要があります。 - 脳スライドを4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)溶液で10分間染色します。
- 脳スライドをPBS溶液で5分間すすぎます。
- 褪色防止剤封入剤を脳切片に1滴塗布します。
- 脳切片にカバーガラスを置き、マニキュアでカバーガラスを密封し、従来の蛍光顕微鏡を使用して切片を分析します。
6. EAE誘導
注:shRNAまたはCRE-TATリコンビナーゼ注入の2週間後にEAE誘導を行います11。
- 2.5 mgのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG35-55)と2 mLのPBSを混合して水溶液を作成します。 結核菌 (H37Ra)と不完全なフロイントアジュバント(IFA)を混合して、完全なフロイントアジュバント(CFA)オイル溶液を調製します。
- 水溶液と油溶液を1:1の比率で混合します。ティーパイプを使用して、混合物を水中油状態に泡立てます。
注:ティーパイプは三方パイプとも呼ばれます。MOG35-55 とCFAを完全に混合するために溶液の流れる方向を制御できるプラスチックチューブです。 - 高速ホモジナイザーを使用して、氷浴条件下でEAEモデル用のMOG抗原エマルジョンを作製します。
- 60〜80 mg / kgのペントバルビタールに相当する6〜8 mL / kgの投与量で、1%ペントバルビタールナトリウムでマウスを腹腔内に麻酔します。.
- MOG抗原エマルジョンを4つの異なるポイント(首、背中、左右の腰)に10mL / kgの容量でそれぞれ合計4回の注射で皮下注射します。
注:注射部位が異なれば、マウスの罹患率や死亡率にさまざまな影響を与える可能性があるため、注射部位を慎重に選択することが重要です。さらに、MOG注射を繰り返すと免疫寛容につながる可能性があるため、研究チームはこの潜在的な問題を防ぐために単一の注射方法を選択しました。 - MOG注射後、直ちに500 ng / mLの百日咳毒素(PT)を5 mg / kgの投与量で腹腔内に注射します。.
注:PTは血液脳関門(BBB)の透過性を高め、T細胞の脳への浸潤を促進します。 - 48時間後、PT溶液を同じ量で腹腔内に注射する。
7.神経学的欠損スコア
- 0〜15の範囲の評価スケール16 を使用してマウスを毎日評価および等級付けし、次の神経学的欠損に従ってEAEの発生率と重症度を評価します。
尾: 0 は兆候がないことを示し、1 は半麻痺の尾を表し、2 は完全に麻痺した尾を示します。
手足: 0 は兆候がないことを示し、1 は歩行が弱いか変化していることを表し、2 は麻痺を示し、3 は完全に麻痺した手足を表します。 - 完全な麻痺を持つ四肢麻痺の動物にスコア 12 を割り当て、死亡率のスコアを 15 に割り当てます。
8. ヘマトキシリン-エオシン(H&E)染色
- 脱水したマウスの脳を、溶融パラフィンに埋め込みます。後で使用するために、パラフィンブロックを冷まして固化させます。
注意: パラフィンブロックは、組織の損傷を避けるために完全に乾燥して冷却する必要があります。 - マウス脳パラフィンブロックを厚さ5 μmのスライドにカットします。パラフィンマウスの脳切片をスライドガラス上に置き、60°Cのオーブンで3時間乾燥させます。
- スライドをキシレン溶液Iに10分間、キシレン溶液IIに10分間、100%アルコールIに3分間、100%アルコールIIに3分間、95%アルコールに3分間、90%アルコールに3分間、80%アルコールに3分間、70%アルコールに3分間、蒸留水に1分間浸します。
9. 定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)分析
- マウスにPBSを灌流した後、心室からChPを除去し、TrizolでRNAを抽出します。最初の鎖cDNA合成キットを使用してcDNAを合成します。
- Ex Taq SYBR-green プレミックスとリアルタイム PCR システムを使用して qPCR 解析を実施します。次のA 2ARプライマーを使用してください:フォワード-GCCATCCCATTCGCCATCA;逆 - GCAATAGCCAAGAGGCTGAAGA。
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Representative Results
AAV2/5-shRNAまたはCRE-TATのICV注入によるChP特異的A2ARノックダウン
EAEの病因における神経情報の強力な調節因子としてのChPにおけるA2ARの役割は、依然として不明である。ChP特異的なA 2A Rの発現をノックダウンすることで、EAEやその他の神経系の炎症における中枢免疫系に対するA2AR調節効果に光を当てることができる可能性があります。この研究では、CRE-TATのICV注入を使用して、A 2A Rフロックス/フロックスマウスのChPにおけるA2AR発現を減少させました。ChP特異性を確認するために、まずRosa-LSL(Lox-StoP-Lox)-tdTomato(Ai9)マウスの側脳室にCRE-TATを注入しました。画像は、自発的なtdTomato蛍光がChP組織に限定されていることを示しています(図2)。同様に、AAV2/5-CMV-A2AR-shRNA-CMV増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)をC57BL/6マウスに投与したところ、EGFP蛍光はChPの上皮細胞層に限定され、側脳室付近の周囲の実質細胞には感染しないことがわかりました(図3)。
MOG35-55によるEAE誘導
安定したEAEを誘導するために、マウスにMOG35-55 とCFAからなるエマルジョンを皮下注射し、免疫後0日目と2日目にPTを腹腔内注射しました(図4)。臨床症状尺度を使用して、尾と四肢の状態に基づいて、EAE スコアを毎日評価しました。EAEの発症は、EAEスコアが≥1の初日として定義され、発症からEAEスコアのピークまでの期間は進行期と呼ばれました。
ChP特異的A2ARノックダウンによりEAEの病態を緩和
EAEの病理学におけるA 2A Rシグナルの関与を調査するために、この研究ではChP特異的なA2ARノックダウンを採用しました。この研究では、CRE-TATまたはAAV2/5-A2AR-shRNAのICV注入を使用して、ChP中のA2ARを特異的にノックダウンしました。ノックダウン後2週間で、EAEはMOG35-55免疫によって誘導された。その結果、A2ARノックダウンのマウスは、対照群と比較して、スコアが低く、脊髄への免疫細胞の浸潤が減少することで証明されるように、より軽度のEAE病態を発症することが示されました(図5A、B、E、F)。さらに、MOG35〜55免疫後の20日目に各群から5匹のEAE誘発マウスを無作為に選択した。PBSによる灌流後、ChPを単離し、RNA抽出およびqPCRを行いました。qPCR解析では、AAV2/5-shRNA(A 2A R-Kd)およびCRE-TAT群では、各コントロールと比較して、A2ARのmRNAレベルが明らかに低下していることが示されました(図5C、D)。
図1:側脳室注射部位の解剖学的局在。 (a)ウイルス注入のポイントを示す模式図。(B)側脳室の注射部位は、赤い点で示すように、ブレグマの下0.58mm、矢状縫合糸の外側1.1mmに位置しています。(C)マウスにウイルスを注入した部位を示す画像。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ChPにおけるtdTomato蛍光の局在 。 (A,B)CRETATのICV注射で処理したRosa-LSL(Lox-StoP-Lox)-tdTomatoマウスの代表画像。2週間後、tdTomatoの自家蛍光はChP組織に特異的に局在しました(n = 3/グループ)。(C、D)tdTomatoの自家蛍光とDAPIの合成画像。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:AAV2/5-scramble-EGFPまたはAAV2/5-shRNA-EGFPのICV注入から2週間後に撮影されたC57BL/6マウスの代表的な画像。 (A,B) AAV2/5-scramble-EGFPを注射したマウスの代表画像(n=3/群)。(C、D)AAV2/5-shRNA-EGFPを注入したマウスの代表画像(n = 3/群)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:EAEモデルの誘導。 (A)まず、MOG抗原エマルジョンを赤い点で示した4か所(首、背中、左右の腰)に皮下注射します。(B)PTは、免疫時に腹腔内注射され、2日後に繰り返されます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:A 2A RのChP特異的ノックダウンにより、EAEの病態が緩和されました。 (A)CRE-TATのICV注射によって達成されたA2ARフロックス/フロックスマウスにおけるA2ARのChP特異的ノックダウンは、EAE臨床スコアの低下につながりました(n = 6-7 /グループ)。統計解析は、二元配置RM ANOVAとそれに続くSidakの多重比較検定を用いて行った。(B)AAV2/5-shRNAのICV注射で達成された野生型(WT)マウスにおけるA2ARのChP特異的ノックダウンは、EAE臨床スコアを低下させた(n = 7-8/グループ)。統計解析は、二元配置RM ANOVAとそれに続くSidakの多重比較検定を用いて行った。(C、D)ChP 組織中の A2AR mRNA レベルの qPCR 分析結果 (n = 5/グループ)。統計解析は対応のないt検定を用いて行った。(E、F)H&E染色。ChP特異的A2ARノックダウンは、脊髄への免疫細胞浸潤を弱めました。統計的有意性は、###p < 0.001、**p < 0.01、***p < 0.001 として表されます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この研究では、ChP遺伝子の標的ノックダウンのための2つの異なるアプローチが提示されました。最初のアプローチは、Creリコンビナーゼを含むCRE-TATをA2ARflox/floxマウス にICV注入することでした。2番目のアプローチは、A2ARのshRNAを運ぶAAV2/5のICV注入を伴いました。これら2つの戦略を利用することにより、この研究はChP内のA2ARの選択的ノックダウンを達成し、EAE病理学に対するChPのA2ARシグナル伝達を阻害する保護効果を実証することができました。注目すべきは、このプロトコルには2つの重要なステップが含まれていることです。まず、定位固定装置の位置特定操作が不可欠であり、提案された座標から大きく逸脱すると、ランダムな故障が発生する可能性があります。第二に、1μL未満のウイルス(~6 x 1012)の注入も一定の失敗の可能性があることがわかっているため、注入されるウイルスの量は重要です。これは、十分な感染のために十分な量のウイルス粒子が必要であることが原因である可能性があります。
Cre/LoxPシステムを使用しても、ICV注射後の脳内のCRE-TATリコンビナーゼの正確な分布を観察することはできませんでした。その結果、Rosa-LSL(Lox-StoP-Lox)-tdTomatoマウスを用いて、tdTomatoタンパク質の自家蛍光を用いてCRE-TATの分布を追跡しました。tdTomatoの蛍光は、CRE-TATを脳室内に注入してから2週間後にChP組織にのみ存在し、リコンビナーゼが主にChPに吸収されたことを示しています。次に、A 2A Rflox/floxマウスにCRE-TATを投与したところ、ChP組織においてA2AR mRNAレベルの低下が観察された。この標的ノックダウン戦略は、心理的ストレスの媒介におけるChPにおけるコルチコステロイドシグナル伝達の役割を調査するために使用されました17。また、AAV2/5を用いて、ChP遺伝子を標的とするように設計されたshRNAを送達しました。以前の研究では、ChP組織におけるAAVとレンチウイルスのさまざまな血清型の感染能力を評価し、AAV2 / 5およびAAV2 / 8が最も効果的であることがわかりました14。この研究により、AAV2/5は、他の脳領域に明らかな感染を引き起こすことなく、ChPに特異的に感染できることが明らかになりました。これら2つの方法は、2つのトランスジェニック系統(Cre系統とFlox系統)を必要とする古典的なノックアウト戦略よりも手間がかかりません6,18。この研究の限界の1つは、遺伝子の過剰発現による機能獲得実験がないことです。しかし、これを達成するための可能なアプローチは、完全なcDNAをクローニングし、それをAAV2/5ウイルスにパッケージ化し、ICV感染を介して投与することです。以前の研究では、AAV2 / 5を使用したChPでのNKCC1の過剰発現は、CSFクリアランスを促進し、in vivoで心室肥大を減少させることがわかりました9。AAV2/5戦略とCre/LoxP戦略のどちらにも独自の利点があることに注意することが重要です。トランスジェニックマウスへのCRE-TATのICV注入は、標的遺伝子が細胞のDNAから直接欠失するため、高いノックダウン効率を保証します。ただし、この方法は、フロッセマウスの生産と繁殖に依存します。一方、AAV2/5のICV注入は、トランスジェニックマウスの繁殖に時間のかかるプロセスを回避できます。しかし、この手法のノックダウン効率は、設計したshRNAの性能に大きく依存します。したがって、研究者は実験条件に基づいて適切な方法を選択できます。
多発性硬化症(MS)は、中枢神経系に白質の炎症と脱髄を引き起こす自己免疫疾患です19。多発性硬化症の病理学的メカニズムを研究するために、研究者は脱髄や免疫浸潤などの疾患の症状をシミュレートするEAEモデルを使用しました。このモデルは、多発性硬化症を理解するのに理想的であると考えられています。2009年には、多発性硬化症の病理学における免疫細胞の侵入の重要な経路であるChPを介して免疫細胞が中枢神経系に浸潤することが発見されました。免疫細胞の「第1波」はChPを介してCSFに入り、続いて「第2波」はBBB20を介して脳実質に入ります。免疫細胞の「第一波」は炎症を促進し、BBB漏出を加速させるため、ChPでの免疫浸潤を阻害することは、MSへの早期介入に役立つ可能性があります。 ケモカインと接着分子はChPのゲーティング活性を調節し、リンパ球がChP全体に浸潤する能力を制御します21,22,23。
以前の研究では、全身ノックアウトまたは薬理学的技術(中和抗体など)を使用してChP中のシグナル伝達分子を調査していましたが、これらの方法では、MSの病理学的プロセスにおける生物学的機能を正確に定義していませんでした。最近の研究では、研究者はA 2A Rフロックス/フロックスマウスのChPに位置するA2ARをノックダウンし、EAEスコアと免疫浸潤が有意に減少することを発見しました11。この研究は、EAE病理学におけるChPにおけるA2ARシグナル伝達の役割を確認し、ChP特異的ノックダウン法が中枢神経系病理学におけるChP機能を研究するための有用なツールであることを実証しています。
結論として、ChP特異的操作プロトコルは、パーキンソン病、アルツハイマー病、MSなどの中枢神経系の変性疾患に関与するChPの生物学的機能を探索するための理想的なツールです。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益や宣言すべきその他の開示はないと述べています。
Acknowledgments
この研究に対する中国国家自然科学基金会(助成金第31800903号、W. Zheng氏)および温州科学技術プロジェクト(第Y2020426号、Y. Y. Weng氏)の支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
| AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
| antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
| borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
| brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
| C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
| CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
| DAPI | Absin | B25A031 | |
| frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
| H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
| Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
| Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
| Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
| MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
| OCT glue | Epredia | 6502p | |
| paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
| pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
| Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
| PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
| Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
| Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
| sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
| super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
| xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
References
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