Summary
Denne undersøgelse beskriver en metode til at isolere og rense bakterielle ekstracellulære vesikler (BEV'er) beriget fra human afføring via densitetsgradientcentrifugering (DGC), identificerer BEV'ernes fysiske egenskaber fra morfologi, partikelstørrelse og koncentration og diskuterer de potentielle anvendelser af DGC-tilgangen i klinisk og videnskabelig forskning.
Abstract
Bakterielle ekstracellulære vesikler (BEV'er) er nanovesikler afledt af bakterier, der spiller en aktiv rolle i bakterie-bakterier og bakterie-værtskommunikation, der overfører bioaktive molekyler såsom proteiner, lipider og nukleinsyrer arvet fra moderbakterierne. BEV'er afledt af tarmmikrobiota har virkninger i mave-tarmkanalen og kan nå fjerne organer, hvilket resulterer i betydelige konsekvenser for fysiologi og patologi. Teoretiske undersøgelser, der udforsker typer, mængder og roller af BEV'er afledt af menneskelig afføring, er afgørende for at forstå udskillelsen og funktionen af BEV'er fra tarmmikrobiotaen. Disse undersøgelser kræver også en forbedring af den nuværende strategi for isolering og rensning af BEV'er.
Denne undersøgelse optimerede isolerings- og rensningsprocessen for BEV'er ved at etablere to densitetsgradientcentrifugeringstilstande (DGC): Top-down og Bottom-up. Den berigede fordeling af BEV'er blev bestemt i fraktionerne 6 til 8 (F6-F8). Effektiviteten af tilgangen blev evalueret baseret på partikelmorfologi, størrelse, koncentration og proteinindhold. Partikel- og proteingenvindingshastighederne blev beregnet, og tilstedeværelsen af specifikke markører blev analyseret for at sammenligne genvinding og renhed af de to DGC-tilstande. Resultaterne viste, at Top-down-centrifugeringstilstanden havde lavere kontamineringsniveauer og opnåede en genvindingshastighed og renhed svarende til bottom-up-tilstanden. En centrifugeringstid på 7 timer var tilstrækkelig til at opnå en fækal BEV-koncentration på 108/mg.
Bortset fra afføring kan denne metode anvendes på andre kropsvæsketyper med korrekt modifikation i henhold til forskellene i komponenter og viskositet. Afslutningsvis vil denne detaljerede og pålidelige protokol lette den standardiserede isolering og oprensning af BEV'er og dermed lægge et fundament for efterfølgende multi-omics-analyse og funktionelle eksperimenter.
Introduction
Tarmen er bredt anerkendt som det organ, der huser de mest rigelige mikrobielle samfund i menneskekroppen, med over 90% af bakterierne involveret i kolonisering og multiplikation 1,2. Omfattende beviser har vist, at tarmmikrobiotaen modulerer tarmmikromiljøet og samtidig interagerer med dysfunktion i fjerne organer, primært gennem en nedsat tarmbarriere 3,4. Stigende beviser indikerer en sammenhæng mellem ubalancen i tarmmikrobiota og progressionen af inflammatorisk tarmsygdom (IBD)5,6 samt kognitive lidelser gennem tarm-hjerneaksen 5,6,7,8. Bakterielle ekstracellulære vesikler (BEV'er) produceret af bakterier spiller betydelige roller i disse patologiske processer.
BEV'er er nanoskalapartikler, der indkapsler bakteriederivater med diametre fra 20 til 400 nm. De har vist sig at lette interaktioner mellem bakterier og deres værtsorganismer 9,10. På trods af deres usynlighed har disse partikler fået stigende opmærksomhed fra forskere på grund af deres potentielle brede anvendelser som diagnostiske biomarkører, terapeutiske mål og lægemiddelleveringskøretøjer11. Menneskelig afføring, der ofte bruges som bioprøver til undersøgelse af BEV'er, overvejende hentet fra tarmbakterier, indeholder en kompleks blanding af vand, bakterier, lipider, proteiner, ufordøjede madrester og eksfolierede epitelceller blandt andre. Den indviklede fækale sammensætning udgør udfordringer for isoleringen og renheden af BEV'er, hvilket forhindrer en omfattende, objektiv og realistisk analyse af BEV'er. Derfor har effektive strategier til at minimere interferens fra forurenende komponenter og øge udbyttet af BEV'er vist sig at være kritiske problemer, der kræver øjeblikkelig opmærksomhed.
Eksisterende isolationsstrategier er i vid udstrækning afhængige af teknikker som ultrahøjhastighedscentrifugering (UC), densitetsgradientcentrifugering (DGC) og størrelseseksklusionskromatografi (SEC) 12,13,14,15,16,17. I øjeblikket er DGC en af de mest anvendte metoder inden for BEV-separation, der omfatter to sedimenteringsflydende tilstande, "Top-down" og "Bottom-up", som bestemmes af prøvens indledende belastningsposition. Disse metoder adskiller ekstracellulære vesikler (EV'er) fra andre komponenter baseret på størrelses- og densitetsforskelle, hvilket giver variabel renhed og genvindingshastigheder. Tidligere forskning har vist, at enkelttilgangsstrategier er utilstrækkelige til tilstrækkeligt at adskille EV'er fra opløselige proteiner i kropsvæskeprøver, såsom lipoprotein i blod18 og Tamm-Horsfall-protein i urin19. Derudover overlapper størrelsesfordelingen af eukaryote ekstracellulære vesikler (EEV'er) ofte med BEV'ernes, hvilket nødvendiggør yderligere metodologiske forbedringer for at optimere BEV-udbyttet. Fremskridt i undersøgelsen af BEV'er afhænger derfor af udviklingen af effektive separations- og rensningsmetoder. Især anvendte Tulkens et al 15 en ortogonal biofysisk strategi til at adskille fækale BEV'er fra EEV'er, hvor centrifugeringstiden for en bottom-up DGC-tilstand var op til18 timer. I modsætning hertil reducerede denne undersøgelse den til 7 timer, hvilket i høj grad sparede gradient-ultracentrifugeringstiden og forenklede processen.
I denne undersøgelse isolerede og rensede vi fækale BEV'er ved hjælp af to DGC-tilstande under optimerede bufferforhold efter berigelse af BEV'er med en række differentielle centrifugeringshastigheder fra lav til ekstremt høj hastighed. Evalueringer baseret på morfologi, partikelstørrelse og koncentration indikerede en prisværdig præstation ved denne forbedrede metode. Denne undersøgelse kunne tjene som grundlag for fremtidig forskning, udvide dens anvendelser til et bredere domæne og give indsigt i heterogeniteten af BEV'er i menneskekroppen. Det bidrager også til standardisering af BEV-separations- og analyseteknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den etiske komité på Nanfang Hospital, Southern Medical University, sanktionerede denne undersøgelse, som blev udført med deltagernes informerede samtykke. Alle metoder, der anvendes heri, overholdt standardretningslinjerne for drift leveret af International Human Microbiome Standards (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Alle efterfølgende væskehåndteringsprocedurer blev pålagt at blive udført i et biosikkerhedsskab eller en ultraren bænk.
1. Indsamling og aliquotering af fækale prøver
- Fordel en afføringsprøveudtager, en forseglet pose og en iskasse, og giv omfattende instruktioner til deltagerne om, hvordan man anskaffer og bevarer prøverne.
- Instruer hver deltager i at indsamle deres fækalprøve ved hjælp af den medfølgende prøveudtager og transportere den til laboratoriet ved en temperatur på 4 °C inden for et vindue på 24 timer.
- Ved modtagelse i laboratoriet skal du bruge en steril ske til at alikvote mindre end 3,5 g afføring i et forvejet 50 ml centrifugerør. Notér fækalprøvens vægt på røret til efterfølgende forbehandlingsprocedurer.
PAUSEPUNKT: Hvis øjeblikkelig behandling af prøverne ikke er mulig, fordeles prøven til langtidsopbevaring ved -80 °C efter passende anmærkning.
2. Forberedelse af afføringsprøve
- 500 ml fosfatbufret saltvand (PBS) afkøles ved 4 °C. Det forkølede PBS filtreres gennem et 0,22 μm polyethersulfon (PES) filter ved hjælp af en 50 ml sprøjte i ti 50 ml centrifugeringsrør.
- Placer to 50 ml rør på is, der hver indeholder 3,5 g fækale prøver. Der tilsættes 35 ml PBS til hvert rør.
BEMÆRK: Beregn den nødvendige mængde PBS til afføringsopløsning, hvilket sikrer en maksimal prøvekoncentration på 10% (w / v). Hvis du behandler yderligere prøver, skal du anvende flere rør efter behov. - Prøverne rystes ved 300 o/min i 2 timer ved 4 °C, eller de anbringes i mindst 4 °C i 8 timer, indtil afføringen er helt synligt opslæmmet.
3. Centrifugering med differentiel hastighed
- Den nedkølede centrifuge med høj hastighed afkøles til 4 °C.
- Vægten af de to reagensglas indeholdende prøverne fremstillet i trin 2.3 med PBS justeres, så de når en samlet vægt på 0,1 g.
- Prøverne centrifugeres ved 3.000 × g i 20 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten pipetteres forsigtigt ned i to rene 50 ml centrifugeglas, så der efterlades ca. 1 ml over pelletsen. Brug en engangsplast Pasteur-pipette til denne proces.
- Vægten af de to glas med PBS justeres for at nå en samlet vægt inden for ± 0,1 g.
- Den overførte supernatant centrifugeres ved 12.000 × g i 30 minutter ved 4 °C.
- Opsug supernatanten med en 20 ml sprøjte, fjern kanylen, og filtrer den gennem 0,22 μm filtre i 50 ml reagensglas. På dette tidspunkt bør supernatantens rumfang være ca. 30 ml.
BEMÆRK: Hvis en betydelig mængde urenheder stadig er synlige efter centrifugeringen på 12.000 × g, er det nødvendigt at gentage centrifugeringstrinnet ved 12.000 × g i 30 minutter ved 4 °C. I modsat fald kan det resultere i et betydeligt tab af BEV'er på grund af poreblokering under filtrering.
4. Centrifugering med ultrahøj hastighed
- Rengør rotoren og skovlen ved at tørre dem af med 75% (v/v) alkohol for at fjerne eventuel resterende forurening.
- Anbring et 38,5 ml ultracentrifugerør i rørholderen.
BEMÆRK: Vælg det passende ultracentrifugeglas baseret på prøvevolumenet. Undgå ultraviolet stråling og uegnede kemiske reagenser til sterilisering af centrifugalrør som angivet i produktmanualen. - Ca. 30 ml af den filtrerede fækale supernatant overføres fra trin 3.7 til ultracentrifugeglasset.
- Fyld ultracentrifugerøret med ca. 8 ml PBS, så der er et mellemrum på 3 mm fra rørets åbning.
- Placer de to ultracentrifugerør med prøverne i modsatte ultracentrifugeringsspande, for eksempel svarer spand 1 til 4 (1-4), 2-5, 3-6.
- Juster vægten af de to spande med PBS for at opnå en samlet vægt inden for ± 0,005 g.
- Installer alle spande på rotoren, uanset om rørene er belastet.
- Vakuummet initieres, og prøverne centrifugeres ved 160.000 × g i 70 minutter ved 4 °C.
- Slip kammerstøvsugeren, og åbn døren, når Klar vises på instrumentets hjemmeside.
- Fjern rotoren fra ultracentrifugen.
- Flyt skovlene fra rotoren til stativet, og hent rørene ved hjælp af en nipper.
- Supernatanten, som indeholder synlige brune pellets i bunden, kasseres.
- Pellets resuspenderes ved gentagne gange at pipettere dem op og ned med en 1.000 μL pipette med 1 ml forkølet (4 °C) PBS, indtil de er helt opslæmmet. Rør fyldes med ca. 37 ml PBS, så der er et mellemrum på 3 mm fra åbningen.
- Udfør endnu en ultracentrifugering efter trin 4.5-4.11 ved 160.000 × g i 70 minutter ved 4 °C for at fjerne delvist fastgjorte kontaminerende komponenter fra rørvæggene.
- Supernatanten kasseres, vendes de to ultracentrifugeglas på hovedet i 5 min, og eventuel resterende opløsning på indervæggen fjernes med viskere.
BEMÆRK: Rengøring af den indvendige væg minimerer interferens fra resterende kontaminering, der klæber til den ultracentrifuge rørvæg. Vælg viskere, der ikke påvirker BEV-analysen, især med hensyn til partikelstørrelse. - Resuspender pillerne i hvert rør ved at pipettere dem op og ned med 1,2 ml forkølet (4 °C) PBS ved hjælp af en 1.000 μL pipette.
- Overfør 1,2 ml PBS/BEV-opløsningen fra et ultracentrifugerør til et rent 1,5 ml mikrorør.
PAUSEPUNKT: PBS/BEV-opløsningen opsamlet fra et ultracentrifugerør kan fortsætte til trin 6. Opløsningen opbevares fra det andet glas ved -80 °C.
5. Forberedelse af opløsning til centrifugering af densitetsgradient
- Fremstilling af 0,02 M HEPES buffer
- Kombiner 0,477 g HEPES pulver og 0,8 g NaCl med 90 ml autoklaveret deioniseret vand.
- pH-værdien justeres til 7,2 ved tilsætning af 1 M natriumhydroxid (NaOH). Bring volumen til 100 ml med deioniseret vand og filtrer opløsningen gennem 0,22 μm PES-membraner.
FORSIGTIG: Natriumhydroxid er en stærk kaustisk alkali. Operatørerne skal håndtere og forberede det omhyggeligt i et stinkskab.
- Fremstilling af densitetsgradientbuffer
- Beregn det krævede volumen af hver densitetsgradientbuffer baseret på antallet af ultracentrifugerør til densitetsgradientcentrifugering (trin 6) (I denne protokol var volumenerne for 60%, 50%, 40%, 20% og 10% gradientopløsninger henholdsvis 2,5 ml, 3 ml, 6 ml, 6 ml og 6 ml).
- Til fremstilling af en 50% (w / v) iodixanol arbejdsopløsning, blandes 0,02 M HEPES buffer og 60% (w / v) iodixanol stamopløsning i et volumenforhold på 1: 5 (0,5 ml: 2,5 ml).
BEMÆRK: Brug en engangssprøjte på 20 ml til at trække iodixanolstamopløsningen ud og undgå at indføre luft. - For at forberede iodixanolbuffere med forskellige koncentrationer kombineres 50% iodixanol-arbejdsløsningen fra trin 5.2.2 med HEPES-bufferen opnået i trin 5.1 ved anvendelse af en 1.000 μL pipette i henhold til proportionerne vist i tabel 1.
BEMÆRK: Udfør trin 5 på en ultraren bænk med lyset slukket. Opbevar den åbnede iodixanolstamopløsning i køleskabet ved 4 °C for at forhindre bakterievækst. Hold iodixanolopløsningen og HEPES-bufferen beskyttet mod lys.
6. Etablering af et centrifugeringssystem for densitetsgradienter
- DGC-tilstand oppefra og ned
- 500 μL PBS/BEV-opløsning isoleret fra trin 4 kombineres med 3 ml PBS. Bland forsigtigt opløsningerne med en 1.000 μL pipette for at opnå 3,5 ml PBS/BEV-opløsning.
- Placer et 31 ml ultracentrifugerør på en skumplade med huller og mærk det som "↓".
- Lodret tilsættes 3 ml af 50% iodixanolopløsningen til bunden af røret ved hjælp af en 1.000 μL pipette.
- Vip røret til en 70° vinkel, og placer en rørholder eller anden støtte lidt over skumpladens niveau under rørets åbning.
- Tilsæt 3 ml 40% iodixanolopløsning oven på 50% iodixanolopløsningen ved hjælp af en 1.000 μL pipette.
- Tilsæt 3 ml 20% iodixanolopløsning oven på 40% iodixanolopløsningen ved hjælp af en 1.000 μL pipette.
- Tilsæt 3 ml 10% iodixanolopløsning oven på 20% iodixanolopløsningen ved hjælp af en 1.000 μL pipette.
- Der tilsættes 3,5 ml PBS/BEV-opløsning fra trin 6.1.1 oven på 10 % iodixanolopløsningen ved hjælp af en 1.000 μL pipette.
- Sæt forsigtigt rørene tilbage i opretstående stilling.
BEMÆRK: Efter pipettering skal stratificeringen være synlig.
- DGC-tilstand nedefra og op
- Placer et 31 ml ultracentrifugerør på en skumplade med huller og mærk det som "↑".
- Lodret tilsættes 2,5 ml af 60% iodixanolstamopløsningen til bunden af røret. Bland det forsigtigt med 500 μL PBS/BEV-opløsning isoleret fra trin 4 ved hjælp af en 1.000 μL pipette for at opnå 3 ml 50 % iodixanol/BEV-opløsning.
- Vip røret til en 70° vinkel, og placer en rørholder eller anden støtte lidt over skumpladens niveau under rørets åbning.
- Der tilsættes 3 ml af 40 % iodixanolopløsningen oven på 50 % iodixanol/BEV-opløsningen ved hjælp af en 1.000 μL pipette.
- Tilsæt 3 ml af 20% iodixanolopløsningen oven på 40% iodixanolopløsningen ved hjælp af en 1000 μL pipette.
- Tilsæt 3 ml af 10% iodixanolopløsningen oven på 20% iodixanolopløsningen ved hjælp af en 1000 μL pipette.
- Der tilsættes 3,5 ml PBS oven på 10 % iodixanolopløsningen ved hjælp af en 1.000 μL pipette.
- Sæt forsigtigt rørene tilbage i opretstående stilling.
- På dette tidspunkt forblev 200 μL af suspensionen opnået i trin 4.17, som efterfølgende kan analyseres som en gruppe med navnet "UC".
BEMÆRK: Ved overførsel af opløsninger i trin 6 skal pipettespidsen altid holdes mod ultracentrifugerørets væg vinkelret på rørets akse.
7. Densitetsgradientcentrifugering og fraktionsopsamling
- Vægten af de to rør justeres med PBS for at opnå en samlet vægt inden for ± 0,005 g.
- Glassene anbringes i spandene i henhold til trin 4.5, og de centrifugeres ved 160.000 × g i 7 timer ved 4 °C.
- Fraktionerne opsamles ved hjælp af en pipetter (1000 μL) fra top til bund mod sidevæggen i følgende rækkefølge: 3 ml, 2 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1,5 ml og 3 ml i et 38,5 ml ultracentrifugerør.
BEMÆRK: Hold sigtelinjen på samme niveau som væskeoverfladen. - Der udføres ultracentrifugering for hver fraktion opnået i trin 7.3 i henhold til trin 4 ved 160.000 × g i 70 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten fjernes og vender de ultracentrifuge glas på hovedet i 5 min.
- Pellets resuspenderes i 200 μL forkølet (4 °C) PBS ved hjælp af en 200 μL pipette.
- Overfør PBS/BEV-opløsningen til et rent 1,5 ml mikrorør.
- Mærk fraktionerne fra F1 til F10, og analyser dem baseret på trin 8.
PAUSEPUNKT: Hvis prøverne fra trin 7.8 ikke kan behandles med det samme, opbevares de ved -80 °C.
8. Karakterisering og kvantitativ analyse af de indsamlede fraktioner
- Absorbansværdierne (OD 340 nm) for hver fraktion bestemmes ved hjælp af en mikropladedetektor med blindprøve til beregning af deres tilsvarende massefylde.
BEMÆRK: Udskift PBS/BEV-løsningen (trin 6.1.1 og trin 6.2.2) med PBS for at etablere en tom kontrol.- Forbered 100 μL hver på 0%, 5%, 10%, 12,5% og 20% iodixanolopløsning fortyndet med 0,02 M HEPES baseret på 50% stamopløsning (trin 5.2.2) som standarder, svarende til densiteter på henholdsvis 1,0058 g / ml, 1,0318 g / ml, 1,058 g / ml, 1,0708 g / ml og 1,111 g / ml.
- Der tilsættes 50 μL af hver fraktion fra blindprøvekontrollen (fremstillet i trin 7.3) og 50 μL af hver standardopløsning (fremstillet i trin 8.1.1) for at duplikere hullerne i en plade med 96 huller.
- Indstil bølgelængden til 340 nm, mål slutpunktets optiske tæthed, og beregn densiteten af hver fraktion.
- Identificer F4-F9 som intervallet af BEV-fraktioner baseret på deres densitet.
- Bestem proteinkoncentrationen af BEV-fraktionerne ved hjælp af bicinchoninsyreanalysen (BCA).
- Stoffet fortyndes ti gange i PBS leveret af producenten for at fremstille en 0,5 μg/μL standardproteinopløsning.
- Standardproteinopløsningen (fremstillet i trin 8.2.1) tilsættes med varierende volumen i overensstemmelse med reagensinstruktionerne, og hvert hul i en 96-brøndplade suppleres med PBS til et samlet volumen på 20 μl.
- Der tilsættes 20 μL af prøverne fremstillet i trin 7.8 og prøverne efter UC som defineret i trin 6.2.9 til hvert hul.
- Reagenserne A og B blandes i forholdet 50:1, og der overføres 200 μL til hvert hul.
- Pladen inkuberes i et 37 °C vandbad i 30 min.
- Absorbansværdien måles ved hjælp af en mikropladelæser, proteinkoncentrationen (μg/μL) beregnes, og proteinindholdet (μg) i prøverne bestemmes på grundlag af standardkurven (x: optisk densitet; y: proteinkoncentration) genereret ud fra værdierne af de standardopløsninger, der er fortyndet i trin 8.2.2.
- Karakteriser BEV-fraktionerne defineret i trin 8.1.4 ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM) for at verificere tilstedeværelsen af BEV'er. Alle procedurer nedenfor skal udføres på is.
- Påfør 10 μL af hver isoleret F4-F9-fraktion fra trin 7.8 og prøverne, der er efterladt efter UC defineret i trin 6.2.9, på Formvar/Carbon-understøttede kobbergitre i 20 minutter, og blød dem med filterpapir.
- Prøverne skylles med 100 μL PBS tre gange i 1 min hver, og de tørres med filtrerpapir.
- Prøverne fastgøres med 100 μL 1% (w/v) glutaraldehyd i 5 minutter og tørres med filtrerpapir.
- Ristene vaskes med 100 μL PBS ti gange i 2 minutter hver, og tørres af med filtrerpapir.
- Plet ristene med 50 μL 1,5% (w/v) uranylacetat i 10 minutter, og blød dem med filterpapir.
FORSIGTIG: Uranylacetat er radioaktivt og ekstremt giftigt, når det kommer i kontakt med huden eller indåndes. Håndter opløsninger med uranylacetat i et stinkskab og følg passende sikkerhedsforanstaltninger. - Overfør ristene til et 1% (w/v) methylcellulosefald i 5 minutter og blød dem med filtrerpapir.
- Opbevar de lufttørrede riste i et mørkt, støvfrit miljø indtil observation.
- Tag billeder og analyser dem ved hjælp af en TEM.
- Karakteriser BEV-fraktionerne defineret i trin 8.1.4 ved hjælp af nanopartikelsporingsanalyse (NTA) for at tælle antallet af partikler.
- Kalibrer systemet ved hjælp af 110 nm polystyrenpartikler.
- Prøvebassinet vaskes med PBS.
- Prøverne fra forskellige fraktioner erhvervet i trin 7.8 og prøverne efter UC som defineret i trin 6.2.9 fortyndes til en koncentration i området 10 5-109 partikler/ml med en optimeret koncentration på 107 partikler/ml.
- Optag og analysér ved 11 positioner med tre replikationer, og hold temperaturen omkring 23-30 °C.
- Analyser proteinindholdet i prøverne ved coomassie brilliant blue staining (CBBS) og western blotting (WB).
- BEV-prøverne fra forskellige fraktioner opnået i trin 7.8 og prøverne efter UC som defineret i trin 6.2.9 fortyndes ved hjælp af PBS og 5 × belastningsbuffer til en slutkoncentration på 0,5 eller 1 μg/μl, hvis kvantificering er nødvendig, idet der sikres tilstrækkelig prøvebelastning på 20 μL (10 μg eller 20 μg) af hvert hul i trin 8.5.2. Kog prøverne ved 95 °C i 10 min.
- Saml den præfabrikerede polyacrylamidgel i elektroforesetanken, og overfør prøverne til brøndene.
- Udfør lodret elektroforese med følgende parametre: 160 V i 50 min.
- Plet gelen i Coomassie strålende blå opløsning i 1 time, skyl i deioniseret vand, indtil den blå baggrund lyser, og tag billeder med et kamera.
- Udfør proteinblottingprocedurer for andre geler med følgende parametre: 400 mA i 20 min.
- Bloker blottingmembranerne med en 5% (w/v) BSA-opløsning i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask membranerne i TBST-buffer tre gange i 5 minutter hver.
- Inkuber membranerne med primære antistoffer (BEV-markører: LPS, OmpA, LTA; EEV markører: CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1; Andre kontamineringsmarkører: Flagellin, Calnexin) i 8-12 timer ved 4 °C.
- Vask membranerne i TBST-buffer tre gange i 10 minutter hver.
- Inkuber membranerne med sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur.
- Udfør trin 8.5.9.
- Udvikl blotting ved hjælp af et kemiluminescensapparat.
- PBS/BEV-opløsning (trin 6.1.1 og trin 6.2.2) erstattes med BEV'er fra Escherichia coli for at etablere en positiv kontrol (se materialetabel for proceduren til isolering af rå E. coli-BEV'er), og alle ovennævnte forsøg udføres til karakterisering af BEV'er.
PAUSEPUNKT: Bestem F6-F8 som fordelingen af BEV-berigede fraktioner baseret på resultaterne af karakteriseringen beskrevet ovenfor for fækale BEV'er, og brug dette indsnævrede interval til efterfølgende analyse.
- Beregn genvindingshastighederne i form af partikler og proteiner for at vurdere effektiviteten af de to DGC-tilstande. Resultaterne nedenfor præsenteres i procent.
- Beregn genvindingshastigheden for partikler i top-down-tilstand: samlede partikler i F6-F8/partikler efter UC som defineret i trin 6.2.9.
- Beregn genvindingshastigheden for partikler i bottom-up-tilstand: samlede partikler i F6-F8/partikler efter UC som defineret i trin 6.2.9.
- Beregn genvindingshastigheden for proteiner i top-down-tilstand: samlet proteinindhold i F6-F8 (μg)/proteinindhold efter UC defineret i trin 6.2.9 (μg).
- Beregn genvindingshastigheden for proteiner i bottom-up-tilstand: samlet proteinindhold i F6-F8 (μg)/proteinindhold efter UC defineret i trin 6.2.9 (μg).
- Beregn partikel/proteinforholdet for at vurdere den renhed, der traditionelt er defineret af UC og de to DGC-tilstande, og resultaterne nedenfor blev alle præsenteret som procenter.
- Partikel/protein-forhold efter UC defineret i trin 6.2.9: partikler efter UC/proteinindhold efter UC (μg).
- Partikel/protein-forhold i Top-down-tilstand: samlede partikler i F6-F8/proteinindhold i F6-F8 (μg).
- Partikel/protein-forhold i bottom-up-tilstand: samlede partikler i F6-F8/proteinindhold i F6-F8 (μg).
- Vælg den mest egnede centrifugeringstilstand (Top-down-tilstand blev valgt i protokollen) til fækal BEV-rensning og fremtidig analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestem fordelingen af BEV-berigede fraktioner
For at bestemme fordelingen af bakterielle ekstracellulære vesikler (BEV'er)-berigede fraktioner blev der etableret en blindprøve til måling af absorbansværdierne ved OD 340 nm, og densiteten af hver fraktion blev beregnet ud fra målingerne og iodixanolretningslinjerne (trin 8.1). Tabel 2 viser densitetsresultaterne, der viser, at fraktionerne F4 til F9 udviste tætheder inden for det område, der typisk er forbundet med ekstracellulære vesikler. Dette fund antydede, at størstedelen af BEV'erne var isoleret i disse fraktioner, hvilket førte til definitionen af F4-F9 som det grove interval for BEV'er. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) blev anvendt til at karakterisere de morfologiske træk ved fækale BEV'er isoleret som vist i figur 1 i fraktionerne F4-F9. TEM-billederne (figur 2) afslørede tilstedeværelsen af klassiske kopformede strukturer, som er karakteristiske for BEV'er. Nanopartikelsporingsanalyse (NTA) og bicinchoninsyreanalyse (BCA) blev udført for at bestemme henholdsvis partikelantal og proteinkoncentration, hvilket muliggør yderligere evaluering af genvindingshastigheder og renhed. Figur 3 viser protein- og partikelkoncentrationerne for hver fraktion, hvilket indikerer, at F6 og F7 udviste de højeste koncentrationer efterfulgt af F5 og F8. Derefter blev Coomassie brilliant blue staining (CBBS) og western blotting (WB) udført for at give en samlet proteinanalyse. Resultaterne af CBBS var i overensstemmelse med proteinkoncentrationsresultaterne, hvor F6 og F7 viste de mest intense bånd (figur 4). For at bekræfte fordelingen af BEV'er blev ekstracellulære vesikler afledt af Escherichia coli anvendt som en positiv kontrol (defineret i trin 8.5.13). Isolations- og rensningsprocedurerne fulgte trinnene beskrevet i materialefortegnelsen og de førnævnte protokolafsnit (trin 3, 4). WB-analyse bekræftede yderligere tilstedeværelsen af ydre membranprotein A (OmpA), en hovedkomponent i bakteriens ydre membran og en specifik markør for BEV'er, i fraktionerne F6-F8. Baseret på disse resultater blev fraktionerne F6-F8 defineret som BEV-berigede fraktioner, der var egnede til efterfølgende eksperimenter og analyse.
Kontrol af interferenskomponenternes præsentationsområde
Eukaryote ekstracellulære vesikler (EEV'er), som har samme størrelse og densitet som BEV'er, blev identificeret som en væsentlig interferens i analysen af BEV'er. For at løse dette blev tre EEV-proteiner undersøgt i fraktioner 5-8 fra både Top-down- og Bottom-up-tilstande med centrifugeringstider på 7 timer og 15 timer. CD63, et EEV-associeret transmembranprotein, blev overvejende påvist i F5, mens BEV-markøren LPS blev beriget i fraktioner 6-7. Dette mønster blev observeret i begge tilstande, selvom bottom-up-tilstanden udviste let banding af CD63-EEV'er i F7. Andre EEV-markører, CD9 og TSG-101, viste imidlertid ikke synlige signaler i disse fraktioner uanset tilstande eller centrifugeringstider. I et uafhængigt eksperimentelt foretagende blev antistoffer rettet mod Syntenin og Integrin β1 anvendt til at fastslå berigelsen af distinkte proteinmarkører, der er forbundet med EEV'er på tværs af fraktionerne 5-8. Syntenin blev tydeligt påvist inden for F5, især inden for rammerne af Top-down-metoden, mens tilstedeværelsen af Integrin β1 blev observeret inden for F6 (figur 5). For yderligere at vurdere tilstedeværelsen af interfererende partikler blev Dil-mærket lipoprotein med lav densitet (Dil-LDL) introduceret i densitetsgradientsystemet, og fluorescensintensitet blev målt på tværs af alle fraktioner. I Top-down-tilstand udviste fraktionerne 1-4 relativt højere fluorescensværdier, mens det i bottom-up-tilstand var F1-F6, der viste højere intensiteter (figur 6).
Vurder genvindingsgraden og renheden af to DGC-tilstande ud fra koncentration, partikelstørrelse og markører for BEV'er
Efter identifikation af F6-F8-fraktioner som BEV-berigede fraktioner blev genvindingshastighederne og renheden af de to densitetsgradientcentrifugeringstilstande (DGC) evalueret. Partikelstørrelserne af BEV-berigede fraktioner opnået fra Top-down-tilstand, Bottom-up-tilstand og ultracentrifugering (UC) alene blev sammenlignet. De observerede partikelstørrelser i begge centrifugeringstilstande varierede fra 90 til 300 nm, hvilket var i overensstemmelse med den definerede diameter af BEV'er (figur 7). Dernæst blev partikel- og proteingenvindingshastighederne for de to tilstande beregnet ud fra partikel- og proteinkoncentrationerne før og efter DGC (tabel 3 og figur 8). Især udviste bottom-up-tilstanden højere gendannelsesrater sammenlignet med den anden tilstand. I en separat eksperimentel gruppe blev proteingenvinding i de to tilstande evalueret ved forskellige centrifugeringstider på 7 timer og 15 timer. Det er vigtigt, at der ikke var nogen statistisk signifikant forskel i proteinindhold inden for F6-F8-fraktioner efter DGC mellem de to centrifugeringstider, uanset hvilken gradienttilstand der blev anvendt (figur 9). Partikel/protein-forholdet blev beregnet for at give en grov vurdering af renheden i de to tilstande. Dataene viste ingen signifikant forskel i renhed mellem tilstandene. Derudover blev Coomassie brilliant blue staining (CBBS) og western blotting (WB) udført for yderligere at sammenligne renheden med fokus på tre BEV-markører (LPS, OmpA og LTA), en EEV-markør (CD63) og to forurenende markører (Calnexin, Flagellin). Resultaterne viste en delvis reduktion af interfererende stoffer efter DGC, hvor LPS og OmpA viste en mere fremtrædende tilstedeværelse i begge DGC-tilstande sammenlignet med UC alene (figur 10).
Figur 1: Skematisk arbejdsgang for isolering og rensning af BEV'er. Forkortelser: BEV'er = bakterielle ekstracellulære vesikler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative TEM-billeder af BEV-fraktioner. A) TEM-billeder af BEV'er, der er isoleret efter UC. B) TEM-billeder af BEV'er, der er isoleret efter DGC ved hjælp af top-down-tilstand. C) TEM-billeder af BEV'er, der er isoleret efter DGC ved hjælp af bottom-up-tilstand. Alle billeder blev præsenteret i en ensartet skala på 200 nm. Forkortelser: TEM = transmissionselektronmikroskop; BEV'er = bakterielle ekstracellulære vesikler; UC = ultracentrifugering; DGC = centrifugering af densitetsgradient. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Protein- og partikelkoncentration af BEV-fraktioner efter top-down- og bottom-up-DGC-tilstande. Proteinkoncentrationen af BEV-fraktioner blev bestemt ved hjælp af BCA og er repræsenteret af de grå bjælker. Partikelkoncentrationen blev målt ved hjælp af NTA og er repræsenteret af de blå søjler. Forkortelser: BEV = bakteriel ekstracellulær vesikel; DGC = centrifugering af densitetsgradient BCA = bicinchoninsyreanalyse; NTA = nanopartikelsporingsanalyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Bestemmelse af BEV-berigede fraktioner. (A) CBBS blev udført for at bestemme fraktionerne beriget med fækale BEV'er i både top-down- og bottom-up-tilstand. (B) EV'er afledt af Escherichia coli blev isoleret, renset og anvendt som en positiv kontrol i WB for at bekræfte tilstedeværelsen og fordelingen af BEV'er. OmpA: Ydre membranprotein A, en BEV-markør. Forkortelser: BEV = bakteriel ekstracellulær vesikel; CBBS = coomassie strålende blå farvning; EV'er = ekstracellulære vesikler; WB = western blotting. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Bekræftelse af EEV-distribution. Western blot-analyse af fraktionerne 5-8 opnået fra top-down- og bottom-up-DGC-tilstande med forskellige densitetsgradientultracentrifugeringsvarigheder, 7 timer (A) og 15 timer (B). Et uafhængigt forsøg med fokus på F5 til F8 som følge af en 7-timers centrifugeringsperiode blev udført, som påvist i (C) og (D). Udvalgte markører omfattede dem, der var forbundet med BEV'er (LPS) og EEV'er (CD63, CD9, TSG-101, Syntenin, Integrin β1). Forkortelser: DGC = densitetsgradientcentrifugering; BEV = bakteriel ekstracellulær vesikel; EEV = eukaryot ekstracellulær vesikel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Fordeling af lipoprotein med lav densitet. Dil-mærket lipoprotein med lav densitet (Dil-LDL), der betragtes som en forureningsmarkør, blev tilsat i en koncentration på 10 μg til gradientsystemet i både Top-down og Bottom-up modes. Dil-LDL erstattede PBS/BEV-opløsningen (trin 6.1.1 og trin 6.2.2) for at etablere en detektionsmodel. Fluorescensintensiteten af hver fraktion blev målt ved hjælp af en mikropladedetektor med en excitations-/emissionsbølgelængde på 549/565 nm. Forkortelse: BEV = bakteriel ekstracellulær vesikel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Partikelstørrelser af BEV-berigede fraktioner. (A) Partikelstørrelsesfordeling af rå BEV'er opnået efter UC. B) Partikelstørrelsesfordeling af BEV-berigede fraktioner (F6-F8) opnået ved top-down-densitetsgradientcentrifugering (DGC). (C) Partikelstørrelsesfordeling af BEV-berigede fraktioner (F6-F8) blev opnået ved hjælp af bottom-up DGC-tilstanden. NTA blev iværksat for at kvantificere partiklernes dimensioner. De fortyndingsfaktorer, der blev anvendt til paneler (A-C), var 10.000, 2.000 og 5.000, svarende til de efterfølgende resultater kalibreret. Forkortelser: BEV = bakteriel ekstracellulær vesikel; UC = ultracentrifugering; DGC = centrifugering af densitetsgradient NTA = nanopartikelsporingsanalyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Protein- og partikelgenvindingsrater for top-down- og bottom-up-DGC-tilstande. A) Proteingenvindingsrater for de to tilstande beregnet som forholdet mellem proteinkoncentration efter og før DGC (UC). B) Partikelgenvindingsraterne for de to tilstande beregnes ved forholdet mellem partikelkoncentrationen efter og før DGC (UC). (C) Partikel/protein-forhold mellem UC, Top-down og Bottom-up-tilstande. Data præsenteres som gennemsnit ± SEM. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en to-sidet, uparret t-test for panel A og B og envejsanalyse af varians (ANOVA) med Tukey post hoc test for panel C. Der blev ikke observeret signifikante forskelle. Forkortelser: DGC = densitetsgradientcentrifugering; UC = ultracentrifugering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Sammenligning af proteingenvinding baseret på Top-down og Bottom-up DGC-tilstande ved hjælp af forskellige densitetsassocierede ultracentrifugeringstider. Proteingenvindingshastigheder i fraktioner F6-F8 opnået ved gradient ultracentrifugering i 7 timer og 15 timer blev evalueret i uafhængige eksperimenter ved hjælp af både Top-down og Bottom-up modes. Data præsenteres som gennemsnit ± SEM. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af tovejsvariansanalyse (ANOVA) med Fishers test af mindst signifikant forskel. Der blev ikke observeret signifikante forskelle. Forkortelser: DGC = densitetsgradientcentrifugering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Vurdering af renhed af top-down- og bottom-up-DGC-tilstande. (A) CBBS blev udført for at sammenligne proteinfordelingen af UC-, Top-down- og Bottom-up-tilstande. (B) WB blev udført for at vurdere renheden af UC-, Top-down- og Bottom-up-tilstande. Calnexin: endoplasmatisk retikulumassocieret proteinmarkør; Flagellin, forurenende proteinmarkør fra bakterier. CD63: transmembranproteinmarkør for eukaryote ekstracellulære vesikler; LTA: BEVs markør fra gram-positive bakterier; LPS, OmpA: BEVs markører fra gram-negative bakterier. Forkortelser: DGC = densitetsgradientcentrifugering; UC = ultracentrifugering; CBBS = Coomassie Brilliant Blue farvning; WB = western blotting. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Koncentration af iodixanolopløsning (%) | 0,02 M HEPES buffer | 50% Iodixanol arbejdsløsning |
| 40 | 1 | 4 |
| 20 | 3 | 2 |
| 10 | 4 | 1 |
Tabel 1: Forhold til fremstilling af iodixanoldensitetsgradientbuffere. Tabellen gav forholdet mellem 0,02 M HEPES buffer og 50% iodixanol arbejdsopløsning for at opnå en vis koncentration af iodixanolopløsning.
| F1 | F2 | F3 | F4 | F5 | F6 | F7 | F8 | F9 | F10 | |
| Massefylde (g/ml) | 1.023 | 1.038 | 1.049 | 1.062 | 1.074 | 1.098 | 1.144 | 1.185 | 1.239 | 1.293 |
Tabel 2: Densiteten af det iodixanolbaserede densitetsgradientcentrifugeringssystem. Tabellen viste densiteten af hver fraktion i et iodixanolbaseret densitetsgradientcentrifugeringssystem. Tom kontrol: PBS-baseret gradientsystem.
| Top-down-tilstand | Bottom-up-tilstand | |
| Partikelgenvindingsgrad (%) | 24.08 | 35.69 |
| Genvindingsgrad for protein (%) | 24.5 | 32.45 |
Tabel 3: Partikel- og proteingenvindingshastighederne for to tilstande. Tabellen viste partikel- og proteingenvindingshastighederne for Top-down- og Bottom-up-tilstandene (figur 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bakterielle ekstracellulære vesikler (BEV'er) er lipid-dobbeltlags nanopartikler udskilt af bakterier, der bærer et væld af proteiner, lipider, nukleinsyrer og andre bioaktive molekyler, der bidrager til at formidle bakteriernes funktionelle virkninger20. BEV'er afledt af tarmen er blevet verificeret at være involveret i udviklingen af sygdomme, såsom inflammatorisk tarmsygdom, Crohns sygdom og kolorektal cancer, og påvirker også generel metabolisme og medierer nedsat kognitiv funktion 4,16,17,20,21,22,23,24,25,26 . I øjeblikket er opnåelse af fuldstændige og objektive biologiske oplysninger om BEV'er af tarmbakteriers oprindelse fra humane prøver-afføring stadig begrænset af en række faktorer, blandt hvilke det første og vigtigste spørgsmål er, hvordan man isolerer BEV'er fra det komplekse værtsmiljø.
De vigtigste metoder til isolering af BEV'er, såsom ultracentrifugering (UC), densitetsgradientcentrifugering (DGC) og størrelseseksklusionskromatografi (SEC) 13,14,15,16,17, har både opadrettede og nedadrettede sider. Vanskeligheder med at fjerne visse interfererende stoffer og manglen på konsekvente driftsprocedurer, som i alvorlig grad påvirker en mere realistisk og omfattende analyse af BEV'er, er fortsat udfordringer for separationsprocessen. For at lette de uønskede virkninger af interferens har mange undersøgelser 15,27,28 kombineret to eller flere af ovennævnte metoder for at opnå adskillelse af BEV'er, især fra kropsvæsker, men komplekse procedurer har tendens til at påvirke resultaternes stabilitet. For BEV'er kan forskellen i densitet med andre forurenende stoffer (f.eks. proteinaggregater, lipidkomponenter, eukaryote ekstracellulære vesikler (EEV'er)15) blive et specifikt isolationsmiddel i dag.
I øjeblikket har iodixanol vist sig som det foretrukne medium til densitetsgradientseparation af EV'er, der erstatter saccharose på grund af dets isotoniske egenskaber. Disse egenskaber bidrager til at bevare EV-morfologi og lette densitetsestimering for hver fraktion29. I overensstemmelse med Tulkens et al 15 vedtog vores undersøgelse en identisk koncentration for DGC-systemet ved hjælp af iodixanol ved 50% (w / v), 40% (w / v), 20% (w / v),10% (w / v) og 0% koncentrationsgradientlag. Det første trin involverede brugen af HEPES-buffer til fremstilling af forskellige koncentrationer af iodixanolopløsninger. Sammenlignet med Tris (-EDTA)-saccharosebuffer sikrer en passende koncentration af HEPES-buffer langsigtet pH-stabilitet i centrifugeringssystemet takket være dets iboende egenskaber. Samtidig blev steril PBS-buffer anvendt i det øverste lag af centrifugeringssystemet, ikke kun for at beskytte mod potentiel kontaminering af bakterier og deres metabolitter under fremstilling af opløsning, men også for at opretholde prøvebufferkonsistens før og efter DGC. Dette indebar resuspension af pellet med PBS-buffer efter UC og erstatning af iodixanol med PBS efter DGC, hvilket letter en sammenlignende analyse af resultaterne. Desuden blev volumenet af hvert gradientlag i DGC-systemet kalibreret til 3 ml, 3 ml, 3 ml, 3 ml og 3,5 ml for henholdsvis 50%, 40%, 20%, 10% og 0% (PBS-lag) iodixanolopløsninger. Denne strategi hjælper med at etablere et relativt bredere densitetsområde (1,02-1,30 g / ml), hvilket potentielt forbedrer adskillelsen af BEV'er fra andre interfererende elementer, hvorved gradienterne kan anvendes på andre kropsvæsker med kompleks forurening.
Det er vigtigt at understrege, at nogle faser af protokollen er afgørende. Især er fortyndingsfaktoren skitseret i trin 2.2, hvor 1 g fækale prøver blandes med mindst 10 ml PBS, afgørende for at forhindre overmætning og bevare eksperimentelle ressourcer. Under disse betingelser øges partikel- og proteinkoncentrationen generelt proportionalt med fækalmassen i en prøve, forudsat at andre fækale egenskaber er konstante. Hvis det er nødvendigt, kan yderligere analyse i betragtning af faktorer som konsistens, lipoprotein eller blodindhold foretages. Under trin 3.4 skal der udvises forsigtighed for at undgå direkte hældning af opløsningen, da dette kan forstyrre pelleten, hvilket potentielt kan få større granulater til at blokere membranen i 0,22 μm filteret. Hvis filteret hurtigt bliver mættet (f.eks. hvis mindre end 10 ml passerer gennem et filter), anbefales et yderligere centrifugeringstrin på 12.000 × g . I forbindelse med densitetsgradientcentrifugering er præcis forberedelse af gradientopløsninger en forudsætning for pålidelige resultater. Derudover er omhyggelig manipulation af røret ved lagdeling af de øvre opløsninger med lav densitet afgørende for at forhindre forstyrrelse af stratificering, og eventuelle bobler skal elimineres ved opmærksom pipettering. Endelig er det vigtigt at trække dem omhyggeligt langs rørvæggen ved opsugning af fraktionerne og undgå over- eller underaspiration, der kan føre til unøjagtig BEV-fordeling. Regelmæssig observation af væskeniveauet og konsekvent praksis kan hjælpe med at afbøde dette problem.
Denne undersøgelse bestemte de BEVs-berigede fraktioner (F6-F8) ved hjælp af flere karakteriseringsmetoder og udforskede to forskellige gradient ultracentrifugeringstilstande: Top-down og Bottom-up. Gennem måling af protein- og partikelkoncentration i F4-F8 (figur 3) og sammenligning af genvindingshastigheder og renhed (figur 8 og figur 10) blev det observeret, at bottom-up-centrifugeringstilstanden gav højere detekterede værdier på både protein- og partikelniveau end den alternative metode til isolering og rensning af BEV'er fra fækale prøver. Denne observation indebærer forskellige dynamiske processer. Der blev foreslået en hypotese om, at ikke-vesikulære ekstracellulære nanopartikler (NVEP'er)29, såsom lipoproteiner, med lavere densitet end BEV'er, muligvis ikke når deres flydende tætheder, hvis prøverne bundbelastes (figur 6), hvilket potentielt kan forårsage en oppustet genvindingshastighed, selv efter 15 timers DGC (figur 9). Denne observation nødvendiggør overvejelser om, hvorvidt den traditionelle renhedsdefinition, der er baseret på forholdet mellem partikler og proteiner, er anvendelig. Det er desuden værd at bemærke, at EEV'er udviste overvægt inden for F5, mens BEV'er blev tydeligt påvist i F6-F7 (figur 4 og figur 5). Især syntes denne differentiering at blive fremhævet, når Top-down-tilstanden blev vedtaget. Derfor kan denne tilstand være mere egnet til denne protokol. Det er imidlertid vigtigt at fremhæve tilstedeværelsen af integrin β1 inden for F6, hvilket potentielt betyder den iboende heterogenitet blandt EEV'er. Når man anvender denne metode på andre kropsvæsker som blod og urin, bør forskere overveje prøvernes unikke egenskaber. Centrifugeringstiden defineret i denne protokol er 7 timer, signifikant mindre end den varighed, der er citeret i andre undersøgelser, som kan være så lang som 18 timer. Sammenlignet med proteingenvinding med en varighed på 15 timer udført i samme mønster i denne undersøgelse (figur 9) synes denne tid tilstrækkelig til at opnå den krævede separationsrenhed. Under disse driftsforhold nåede partikelgenvindingen i Top-down-tilstand op til 10 8 (4,5 × 10 7-1,5 × 108) pr. milligram afføring, hvilket var i overensstemmelse med tidligere rapporter (1011 BEV'er pr. gram våd afføring)15,29,30. Endelig bekræftede densitetsmålinger af hver fraktion fra blindprøvekontrollen, at densiteten af BEV'er varierede fra 1,09-1,19 g / ml, hvilket er i overensstemmelse med tidligere forskning.
Denne metode, selvom den er effektiv, præsenterer en begrænsning på grund af virkningen af kostvaner, tarmfunktion og andre faktorer på fækal sammensætning. Disse variabler kan ændre fækal konsistens, hvilket potentielt påvirker bakteriel overflod og BEV-genopretning. Derfor er det afgørende at standardisere isolering og oprensning af BEV'er31,32 med justeringer foretaget baseret på vurdering af fækale egenskaber. Fremtidig forskning bør fokusere på at identificere en standard for normalisering af BEV-udbyttet, beslægtet med urinkreatinin eller urinstrømningshastighed. Et sådant benchmark kunne forbedre metodologisk vurdering og belyse forbindelsen mellem fækale BEV'er og kroppens fysiologiske og patologiske tilstand. Desuden understreger den stærke sammenhæng mellem fækale BEV'er og forskellige sygdomme deres betydelige kliniske potentiale. Den centrifugeringstid, der er fastsat i denne protokol, opfylder imidlertid ikke efterspørgslen efter mere bekvem og hurtigere testning, som klinikere kræver. Der er derfor behov for yderligere undersøgelser for at afgøre, om kortere centrifugeringstider, måske mindre end 3 timer, kan give tilsvarende resultater. Yderligere udforskning er også nødvendig for at forstå de begivenheder, der forekommer i begge centrifugeringstilstande. Selv om det postuleres, at ikke-vesikulære komponenter er mere beriget i F6-F8 i bottom-up-tilstand, kan raffinering af gradientkoncentrationer vise sig gavnlig til at identificere yderligere undertyper med specifikke funktioner.
Denne undersøgelse demonstrerede med succes isolering og oprensning af BEV'er fra menneskelig afføring ved hjælp af DGC. Strategien lover godt for anvendelse på andre biologiske prøver, såsom blod, urin og spyt, hvilket giver forskere en effektiv tilgang til at afdække BEV'ers skjulte oplysninger, hvilket potentielt kan fremme kliniske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen modstridende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); nøgleprojektet fra National Natural Science Foundation of China (82230080); Kinas nationale centrale F&U-program (2021YFA1300604); National Natural Science Foundation of China (81871735, 82272438 og 82002245); Guangdong Natural Science Fund for fremtrædende unge lærde (2023B1515020058); Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen (2021A1515011639); Major State Basic Research Development Program of Natural Science Foundation of Shandong Province i Kina (ZR2020ZD11); Postdoktoral Science Foundation (2022M720059); den fremragende ungdomsudviklingsordning på Nanfang Hospital, Southern Medical University (2022J001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
References
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
- de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
- Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359 (2022).
- Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
- Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277 (2019).
- Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
- Morais, L. H., Schreiber, H. L. t, Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
- Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
- Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
- Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
- Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208 (2022).
- Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359 (2022).
- Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
- Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
- Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520 (2013).
- Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
- Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184 (2022).
- Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689 (2022).
- Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
- Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
- Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442 (2022).
- Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107 (2020).
- Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
- Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
- Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
- Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
- Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
- Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829 (2016).
- Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
- Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046 (2023).
