Summary
En este trabajo se describen en detalle los procedimientos de operación y las precauciones que deben tomarse durante la Du-moxibustión en el tratamiento de la espondilitis anquilosante en ratones experimentales.
Abstract
La espondilitis anquilosante (EA) es una forma de artritis que empeora progresivamente y es incapacitante y afecta principalmente al esqueleto axial. Esta enfermedad afecta principalmente a la columna vertebral y a la articulación sacroilíaca. La fusión de la columna vertebral y la articulación sacroilíaca puede ocurrir en la etapa posterior de la enfermedad, lo que resulta en rigidez y cifosis de la columna, así como dificultad para caminar, lo que afecta gravemente la calidad del trabajo y las actividades de la vida diaria e impone una pesada carga al paciente, la familia y la sociedad. Se ha prestado cada vez más atención a la no farmacoterapia como terapia alternativa para la EA. La moxibustión es una técnica terapéutica milenaria utilizada en la Medicina Tradicional China (MTC). La terapia de du-moxibustión, un tratamiento externo único e innovador desarrollado sobre la base de la moxibustión ordinaria, tiene un efecto terapéutico definitivo sobre la EA. La du-moxibustión combina hábilmente las técnicas compatibles de la medicina tradicional china para integrar los meridianos, los puntos de acupuntura, la medicina herbal china y la moxibustión. En este trabajo se describen en detalle los procedimientos de operación y las precauciones que se deben tomar durante la Du-moxibustión en ratones experimentales para proporcionar una base experimental para el estudio del mecanismo de la Du-moxibustión en el tratamiento de la EA.
Introduction
La espondilitis anquilosante (EA) es una forma de artritis que empeora progresivamente y es incapacitante y afecta principalmente al esqueleto axial. Según la última encuesta epidemiológica, ~0,01%-1,8% de las personas en el mundo padecen esta afección1, la mayoría de los cuales son hombres jóvenes (la proporción hombre-mujer es de ~2-3:1)2. La incidencia de EA en la población china es del 0,2% al 0,4%. Esta enfermedad afecta principalmente a la columna vertebral y a la articulación sacroilíaca. La fusión de la columna vertebral y la articulación sacroilíaca puede ocurrir en las últimas etapas de la enfermedad, lo que resulta en rigidez y cifosis de la columna, así como dificultad para caminar, lo que afecta seriamente la calidad del trabajo y las actividades de la vida diaria e impone una pesada carga para el paciente, la familia y la sociedad1. En la actualidad, no existe una solución definitiva para la EA, y los tratamientos proporcionados, tanto farmacológicos como no farmacológicos, se centran principalmente en aliviar el dolor, ralentizar la progresión de la enfermedad y mejorar la calidad de vida. En los últimos años, debido a que las opciones farmacoterapéuticas han sido muy limitadas3, se ha prestado cada vez más atención a la no farmacoterapia, que se ha convertido en una terapia alternativa para la EA. En China, los pacientes suelen preferir un tratamiento externo que consiste en la Medicina Tradicional China (MTC), que tiene efectos secundarios menores y una gran comodidad durante el tratamiento.
La moxibustión es una técnica terapéutica antigua utilizada en la medicina tradicional china. La du-moxibustión es una técnica de tratamiento externo que consiste en "moxibustión medicada con espuma" en el segmento de la columna vertebral del meridiano de Du. Se utiliza principalmente en el tratamiento de la EA y ha demostrado su seguridad y eficacia. En comparación con la moxibustión ordinaria, la Du-moxibustión tiene las características de una amplia área de moxibustión, un gran cono de moxa, una gran potencia de fuego y una alta temperatura4. Una revisión sistemática y un metanálisis sugieren que la moxibustión es un tratamiento complementario eficaz para la EA5. Un estudio reciente confirmó que los síntomas clínicos y algunos factores inflamatorios de los pacientes con EA mejoraron con la moxibustión6. Los estudios han revelado que la Du-moxibustión puede aumentar el contenido cerebral de β-endorfina y ejercer un efecto analgésico central7, regular a la baja la expresión del gen HLA-B27 8 y retrasar la tasa de recurrencia de la EA. La du-moxibustión también tiene un efecto mejorador en la progresión de la EA al disminuir el índice inflamatorio VSG (VSG) y los niveles de proteína C reactiva (PCR), péptido C-terminal de colágeno tipo I (CTX-I) y proteína Dickkopf1 (DKK1)9,10.
Otro estudio clínico mostró que la Du-moxibustión puede ajustar aún más los subconjuntos de células T desordenadas, Ig y complemento C3 para equilibrar el mecanismo inmunológico11. En términos de metabolismo óseo, la moxibustión puede inhibir el aumento de la fosfatasa alcalina sérica (ALP) y el fósforo sérico (S-P), aumentar el calcio sérico (S-Ca), la densidad mineral ósea (DMO) y la fuerza ósea12. Además, la Du-moxibustión puede reparar la función de la columna vertebral en múltiples puntos para aliviar los síntomas de fatiga en pacientes con EA13. Algunos estudios en animales han revelado el mecanismo potencial de la moxibustión en el tratamiento de la EA. Un estudio indicó que la moxibustión mejoró significativamente el estado de salud general, redujo los niveles de grosor de las patas y disminuyó los niveles de IL-1β, PGE2, IL-6 y TNF-α en las muestras de tejido ligamentoso de la columna vertebral. El análisis de la vía metabólica vinculó los metabolitos identificados con el ciclo del TCA, así como con el metabolismo de lípidos, aminoácidos, flora intestinal y purinas14. Otro estudio mostró que la moxibustión suprimió la expresión de citocinas proinflamatorias, IL-1β, TNF-α, IL-17 e IL-6; redujeron los niveles de ARNm de RANKL, RANK, ALP y OCN; y mejoró las características histopatológicas en ratones AS15.
Si bien estos estudios sugieren que la moxibustión puede ser eficaz en el tratamiento de la EA, se necesita más investigación para confirmar estos hallazgos y determinar el protocolo de tratamiento óptimo para la moxibustión en pacientes con EA. Nuestro equipo creó y modificó la terapia de moxibustión basada en la teoría básica y el funcionamiento práctico de la moxibustión tradicional china, que se ha llevado a cabo y aplicado ampliamente en la práctica clínica china durante más de 35 años. Aunque hay pocos estudios de alta calidad sobre el tratamiento de la EA mediante Du-moxibustión, su indicación en el tratamiento de la EA ha sido respaldada por la evidencia. Sin embargo, el mecanismo de tratamiento de la EA con Du-moxibustión es digno de un estudio más profundo. El estudio en animales es un método importante para explorar el mecanismo de la Du-moxibustión en el tratamiento de la EA. El funcionamiento clínico de la Du-moxibustión está relativamente maduro, pero rara vez se utiliza en el estudio del mecanismo en experimentos con animales. En este trabajo se describe en detalle el funcionamiento y las precauciones que deben tomarse durante la Du-moxibustión en el tratamiento de ratones experimentales con EA.
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Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Revisión de Ética del Bienestar de los Animales Experimentales de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shandong (No. SDUTCM20230831301).
1. Preparación animal
- Determinar de antemano los grupos experimentales y el número de animales por grupo.
- Elija ratones machos BALb/c, alójelos a una temperatura constante de 22 ± 1 °C, humedad constante de 60 ± 5% y ambiente de luz de ciclo diurno de 12 h.
2. Establecimiento del modelo de ratón AS
NOTA: El modelo de EA fue inducido con proteoglicano de cartílago (PG), que es un método clásico de modelado 16,17,18,19,20,21. Los ratones de la cepa BALB/c fueron inmunizados repetidamente con PG para inducir tendinitis y espondilitis. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.
- Utilice una pipeta de 200 μl para extraer 200 μl de PG y CFA (o IFA) en un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Agitar suavemente para mezclar el líquido en el tubo de la centrífuga.
- Coloque el tubo de centrífuga en la trituradora de pañuelos para homogeneizar y luego incube en hielo durante 4 min. Repita 5 veces. Ajuste los siguientes parámetros en la amoladora de tejidos: 60 Hz, molienda 30 s, intervalo 10 s para un total de 6 ciclos.
- Extraiga 0,2 mL de proteína PG emulsionada del tubo de centrífuga con una jeringa de 1 mL.
- Agarra y fija el ratón con la mano izquierda. Coloque al ratón en posición supina, manteniendo la cabeza más baja que la cola para evitar daños en los órganos abdominales cuando se inserte la jeringa.
- Esterilizar el abdomen con hisopos con alcohol con la mano derecha.
- Con la jeringa en la mano derecha, inserte la aguja por vía subcutánea ligeramente a la izquierda o derecha de la línea alba ventralis en la mitad inferior del abdomen.
- Empuje la aguja 3-5 mm subcutáneamente paralela a la línea abdominal media y luego empuje la aguja dentro de la cavidad abdominal en un ángulo de 45° con respecto a la piel.
- Penetrar en el peritoneo, retirar el tapón de la aguja e inyectar lentamente la proteína PG emulsionada.
3. Du-moxibustión
NOTA: Prepare con anticipación las tres materias primas más importantes para la Du-moxibustión (Figura 1).
- Prepara los conos de moxa. Tome el terciopelo en la mano, con dos palmas mirando en direcciones opuestas ejerciendo una fuerza de torsión para frotar el terciopelo en forma de huso (Figura 2)
- Corta el jengibre en trozos pequeños y hazlo puré en un exprimidor (Figura 3). Filtra el puré de jengibre a través de una gasa de algodón. Separe el jugo de jengibre y el barro de jengibre del puré de jengibre para prepararse para el siguiente paso.
- Prepara 10 g de barro de jengibre y 20 ml de jugo de jengibre y colócalos en vasos de papel para su uso posterior.
- Pesar 0,1 g de polvo de MTC (una mezcla de canela en polvo, clavo en polvo, notopterigión en polvo, polvo de antharidina y almizcle artificial)22 y molerlo en un mortero.
- Colocar los ratones en la caja de inducción de anestesia de la máquina de anestesia animal y anestesiarlos con una mezcla de isoflurano al 2-3% y oxígeno a un caudal de 2 L/min.
- Evalúe la profundidad de la anestesia observando la ausencia de un reflejo de sobresalto inicialmente y verifique el nivel de anestesia quirúrgica verificando la ausencia de un reflejo pedal en respuesta a un pellizco suave del dedo del pie.
- Una vez que el ratón haya alcanzado la anestesia quirúrgica, sáquelo de la caja y fíjelo en la mesa de operaciones en posición prona. Alinee la boca y la nariz del ratón con la salida del anestésico.
- Administrar la anestesia a través de una máscara conectada a la máquina anestésica, a través de la cual se administra isoflurano y oxígeno a través de un circuito sin reinhalación. Mantenga la anestesia y mantenga el mouse sobre una almohadilla térmica a 37 °C durante todo el procedimiento operativo. Aplique lubricante en los ojos para evitar la desecación.
- Localice los puntos de acupuntura e identifique el área de estimulación (Figura 4).
- Afeita el pelo de la parte posterior del ratón hasta que se vea la piel de color carne en la parte posterior del ratón. Asegúrese de que el ancho de la depilación sea de ~ 1,5 cm y que la longitud sea desde la séptima vértebra cervical hasta la vértebra de la cola (Figura 5A).
- Aplique el jugo de jengibre preparado con una gasa de algodón en el área afeitada (Figura 3).
- Espolvoree el polvo de MTC uniformemente con un pincel de escritura en la línea media de la parte posterior del ratón y cúbralo con papel de morera (Figura 5B-D).
- Haz una columna trapezoidal de jengibre de 6 cm de largo, 1,5 cm de ancho y 3 mm de grosor con barro de jengibre. Fije la columna de jengibre en el papel de morera (Figura 5E).
- Haz una ranura por encima de la línea media de la columna de jengibre (Figura 3) y coloca el cono de moxa en la columna de jengibre.
- Enciende el cono de moxa, colocando un nuevo cono de moxa después de que el anterior se queme. Verifique la firmeza de la columna de jengibre para evitar quemar el ratón, quemando un total de tres conos (Figura 5F).
- Después de quemar los conos de moxa, limpie el jengibre y el polvo de MTC y limpie la parte posterior del ratón. Suspenda la anestesia en este punto.
- Permita que el ratón recupere la conciencia en una nueva jaula con acceso sin restricciones a comida y agua. Coloque la jaula sobre una almohadilla térmica para ayudar en el proceso de recuperación. Vigile al animal hasta que recupere la conciencia suficiente.
- Una vez que el ratón se haya recuperado por completo, confirme la presencia del reflejo de enderezamiento antes de devolverlo a su alojamiento habitual.
NOTA: Durante la operación, es necesario monitorear el estado mental de los ratones para evitar una respiración débil. Evite las quemaduras, pero mantenga a los ratones calientes y evite magulladuras en las garras y la cola.
4. Evaluación del índice de artritis (IA)
- Evalúe la puntuación de la IA tres veces: antes del modelado, después del modelado y después del tratamiento. Los estándares de evaluación son los siguientes: 0, sin enrojecimiento ni hinchazón; 1, ligero enrojecimiento o hinchazón en algunos dedos de los pies; 2, enrojecimiento e hinchazón en la mayoría de las articulaciones de los dedos de los pies y los dedos de los pies; 3, enrojecimiento e hinchazón graves en los pies y debajo de la articulación del tobillo; y 4, enrojecimiento e hinchazón en la articulación de los pies y el tobillo23.
- Calcula las puntuaciones de IA de las cuatro patas, con un valor máximo de 16.
5. Prueba de Rotarod
NOTA: La prueba de rotarod se utiliza para evaluar la coordinación motora y el equilibrio mediante el registro del tiempo que los ratones pasan en el tambor giratorio. Este experimento consistió en tres ensayos separados por intervalos de 20 minutos. Los datos oficiales de las pruebas se registraron en el tercer ensayo, y los dos primeros sirvieron como ejercicios de entrenamiento.
- Coloque los ratones en tambores giratorios que giran bajo aceleración continua de 4 a 40 rpm durante 300 s24.
- Mide el tiempo de latencia (el tiempo que transcurre hasta que el ratón se cae de la varilla). Proporcione almohadillas para evitar lesiones cuando se caiga.
6. Prueba de campo abierto (OFT)
NOTA: La OFT se utiliza para evaluar el estado de movimiento autónomo, con el objetivo de identificar el comportamiento patológico. Cuatro arenas cuadradas de campo abierto (50 cm x 50 cm x 40 cm) se colocaron juntas para formar el aparato. La parte inferior de la caja estaba dividida en nueve cuadrados iguales.
- Controle el ruido de fondo del laboratorio por debajo de 65 dB.
- Limpie todo el aparato con etanol al 75% antes de cada prueba.
- Coloque a todos los ratones en la sala de pruebas 1 hora antes de la prueba para que puedan adaptarse a su entorno.
- Pon a los ratones en las arenas cuadradas de campo abierto y déjalos explorar durante 10 minutos.
- Registre la distancia total y la velocidad de movimiento durante 10 minutos.
7. Eutanasia y recogida de muestras
- Colocar el ratón en la caja de inducción de anestesia y anestesiarlo con una mezcla de isoflurano al 2-3% y oxígeno a un caudal de 2 L/min. Una vez que el ratón entre en un estado de anestesia profunda confirmado por la falta de reflejo del pedal, transfiéralo a la mesa de operaciones para la anestesia de mantenimiento.
- Agarra y fija el ratón con la mano no dominante.
- Presione ligeramente el área de los ojos para que los globos oculares se congestionen y sobresalgan.
- Use tijeras para recortar los bigotes del ratón para evitar la hemólisis causada por los pelos.
- Confirme la profundidad de la anestesia verificando la ausencia de un reflejo pedal en respuesta a un pellizco en el dedo del pie. Use fórceps para agarrar el globo ocular y extraerlo rápidamente, permitiendo que la sangre fluya hacia un tubo de microcentrífuga desde la cuenca del ojo.
NOTA: También se pueden utilizar métodos alternativos de extracción de sangre, como la punción cardíaca. - Cuando la velocidad de goteo de la sangre disminuya, presione suavemente el área del corazón del ratón para acelerar el bombeo de sangre y obtener más sangre. Luego, sacrifica al ratón usando la dislocación cervical.
- Sostenga la pierna justo por encima de la articulación del tobillo con fórceps en la mano no dominante. Luego, corta la pierna justo por encima de la articulación del tobillo con unas tijeras.
8. Análisis histológico
- Sumergir las muestras de tobillo en paraformaldehído al 4% durante más de 24 h. Descalcificar en EDTA al 10% (pH = 7,4) durante 1 mes.
- Remojar las muestras en paraformaldehído al 4% durante 2 h.
- Luego, sumerja las muestras en un gradiente de concentraciones crecientes de etanol (70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%). Remojar cada concentración de etanol durante 1 h.
- Remojar las muestras en xileno durante 3 h.
- Sumergir las muestras de tobillo en parafina durante 7 h. Reservar bloques de parafina en un frigorífico a 4 °C.
- Cortar bloques de parafina a un grosor de 6 μm utilizando una máquina seccionadora de parafina semiautomática.
- Remoje las rodajas durante 4 x 5 minutos en xileno para completar la desparafinación.
- Remoje las rodajas en un gradiente de concentraciones decrecientes de etanol (100%, 100%, 95%, 75%) durante 2 minutos cada una. Remojar en agua destilada durante 2 min.
- Tiñir las rodajas con hematoxilina durante 10 min y enjuagar con agua destilada durante 5 s.
- Remojar las rodajas durante 30 s en el líquido de diferenciación y enjuagar con agua destilada durante 5 s.
- Tiñe las rodajas con eosina durante 1 minuto y enjuaga con agua destilada durante 3 minutos.
- Remoje las rodajas en un gradiente de concentraciones crecientes de etanol (80%, 95%, 100%, 100%) durante 1 minuto cada una. Remojar en xileno durante 3 x 3 min y sellar las rodajas25.
9. Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
- Mida las concentraciones de IL-17 y TNF-α en plasma utilizando los kits respectivos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
10. Análisis estadístico
- Exprese los datos como media ± error estándar de la media (SEM).
- Determinar la significancia a través del análisis de varianza de una vía (ANOVA) o ANOVA de medidas repetidas de dos vías, seguido de las pruebas post hoc de Bonferroni o Tamhane T2.
- Considere que P < 0,05 es estadísticamente significativo.
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Representative Results
Los ratones modelo inducidos por PG desarrollaron síntomas de artritis periférica, caracterizada por enrojecimiento e hinchazón de las extremidades y los dedos de los pies, y desarrollaron gradualmente artritis axial ya en la semana 14, que es muy similar a la manifestación de la EA. Por lo tanto, el modelo de ratón AS se consideró exitoso si el índice de artritis (IA) era superior a 3 puntos a las 14 semanas después de la última inyección22. Cuando las patas de los ratones parecían hinchadas, el tratamiento de Du-moxibustión se llevó a cabo una vez a la semana por un total de 3 veces. Después del tratamiento, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical bajo anestesia profunda con isoflurano, se les recolectó sangre y se extirparon los tobillos.
Efectos de la Du-moxibustión sobre la coodinación motora y el movimiento autónomo
Se adoptó como modelo la EA inducida por PG bovina para observar el efecto de la Du-moxibustión en el meridiano de Du sobre la coordinación motora. Inicialmente, se utilizó la puntuación de hinchazón articular para evaluar si el modelo era exitoso, y la coordinación motora y el movimiento autónomo se evaluaron mediante la prueba de rotarod y OFT.
La evaluación de la IA determinó la gravedad de la artritis periférica. Después del modelado, el ANOVA de medidas repetidas de dos vías reveló que las puntuaciones de hinchazón articular en los grupos modelo y de Du-moxibustión aumentaron significativamente en comparación con las del grupo control antes de la Du-moxibustión (P < 0,01; Figura 6A). El tratamiento con du-moxibustión disminuyó las puntuaciones de inflamación articular en comparación con las del grupo modelo después de la Du-moxibustión (P < 0,05; Figura 6A).
Se empleó la prueba de rotarod para evaluar la coordinación motora y el equilibrio. El ANOVA de medidas repetidas de dos vías reveló diferencias significativas a lo largo del tiempo (F = 13,928, P = 0,000 < 0,05) y de los efectos de interacción del tiempo y el grupo (F = 12,583, P = 0,000 < 0,05). Después del modelado, el tiempo de latencia del grupo de control no fue diferente del que había antes del modelado. Sin embargo, después de la modelación, los tiempos de latencia de los grupos modelo y Du-moxibustión disminuyeron significativamente en comparación con los del grupo control (P < 0,01; Figura 6B), y no hubo diferencias significativas entre el grupo modelo y el grupo de Du-moxibustión (P > 0,05; Figura 6B). Después del tratamiento, el tiempo de latencia del grupo de Du-moxibustión aumentó significativamente en comparación con el del grupo modelo (P < 0,05; Figura 6B). Estos resultados indicaron que la Du-moxibustión fue efectiva para mejorar la coordinación motora en ratones con EA.
Se realizó OFT para detectar el movimiento autónomo. Los parámetros fueron recolectados y analizados automáticamente utilizando el software (Figura 6C-E); La distancia total y la velocidad media se observaron principalmente en este estudio. No hubo diferencia significativa en la distancia total y la velocidad promedio entre los grupos antes del modelado (P > 0.05; Figura 6C,D). Después de la modelación, la distancia total y la velocidad promedio se redujeron significativamente en comparación con el grupo control (P < 0,05; Figura 6C,D). Después del tratamiento, la distancia total y la velocidad media del grupo de Du-moxibustión aumentaron significativamente en comparación con las del grupo modelo (P < 0,05; Figura 6C,D). Estos resultados indicaron que la Du-moxibustión fue efectiva para mejorar el movimiento autónomo en ratones con EA.
Efectos de la Du-moxibustión en la patología de la articulación del tobillo
Se utilizó la tinción HE para observar los cambios patológicos en la articulación del tobillo. En el grupo de control, no hubo daño a la estructura de la membrana sinovial, ni congestión en la membrana sinovial, ni infiltración ni necrosis obvia de células inflamatorias. Sin embargo, en el grupo modelo, se observó hiperplasia e infiltración sinovial en la cavidad articular, además de infiltración celular inflamatoria y edema tisular. En combinación con la evaluación de la IA, se demostró que el modelo de AS se estableció con éxito. En comparación con el grupo modelo, la membrana sinovial de los ratones en el grupo de Du-moxibustión estaba más intacta, el edema intersticial estaba reducido y el cartílago articular estaba relativamente intacto (Figura 7).
Efectos de la Du-moxibustión sobre los niveles plasmáticos de IL-17 y TNF-α
Se realizó ELISA para medir IL-17 y TNF-α en el plasma. Los niveles plasmáticos de IL-17 y TNF-α del grupo modelo aumentaron significativamente en comparación con los del grupo control (P < 0,01; Figura 6F,G). La du-moxibustión disminuyó los niveles plasmáticos de IL-17 y TNF-α (P < 0,05; Figura 6F,G).
Figura 1: Las materias primas necesarias para la Du-moxibustión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Haciendo un cono de moxa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Prepare agua de jengibre y haga una columna trapezoidal de jengibre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Localización de GV14 y GV2 en ratón. (A) GV14 localizado en la apófisis subespinosa de la séptima vértebra cervical; GV2 localizado en el canal del hiato sacro. (B) Diagrama esquemático de Du moxibustión en el ratón. (C) Área estimulada de Du moxibustión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Procedimiento de operación de Du-moxibustión en ratón. (A) Afeitar el cabello y untar el jugo de jengibre en el ratón en posición prona. (B,C) Espolvoree el polvo de MTC de manera uniforme. (D) Cubra el polvo con papel de morera. (E) Fije firmemente la columna de jengibre sobre el papel de morera. (F) Coloque un cono de moxa en la columna de jengibre; Luego, enciéndelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Efectos de la Du-moxibustión sobre la coordinación motora, el movimiento autónomo y los niveles de IL-17 y TNF-α. (A) Las puntuaciones de hinchazón articular en ratones. (B) El tiempo de latencia en la prueba de rotarod. (C-E) Distancia total, velocidad media y diagrama de seguimiento de OFT. (F) Niveles de IL-17 en plasma. (G) Niveles de TNF-α en plasma. Los valores se expresan como la media ± SEM (n = 6). ##P < 0,01, #P < 0,05 frente al grupo control; $$P < 0,01, $P < 0,05 frente al grupo modelo. Abreviaturas: IL = interleucina; TNF = factor de necrosis tumoral; OFT = prueba de campo abierto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Tinción HE de la articulación del tobillo. (A) La cavidad articular era lisa sin infiltración inflamatoria en el grupo control. (B) En el grupo modelo, se observó hiperplasia e infiltración de membrana sinovial en la cavidad articular. (C) En el grupo de Du-moxibustión, la cavidad articular de los ratones fue lisa y el edema se alivió. Barras de escala = 200 μm. Abreviatura: HE = hematoxilina-eosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La EA se manifiesta clínicamente como dolor de espalda, lumbar e hinchazón articular, y en casos graves puede producirse deformidad de la columna vertebral y rigidez articular26. El diagnóstico y el tratamiento tempranos pueden mejorar la calidad de vida, reducir las tasas de discapacidad y mejorar el pronóstico de los pacientes con EA. Según la medicina tradicional china (MTC), se cree que el síndrome de Asperger es causado por una deficiencia de Yang en el riñón y el meridiano Du, así como por una acumulación de mal frío en el interior. La MTC sostiene la opinión de que la moxibustión, basada en el concepto de meridianos, puede generar Qi que calienta la superficie del cuerpo. Este Qi luego viaja hacia abajo a lo largo de los meridianos y puntos de acupuntura. En El Canon Interior de Huangdi (una obra maestra muy clásica e importante de la MTC), se registra que "el meridiano Du enfermo es tratado". Como el AS se encuentra en el meridiano Du, la estimulación del meridiano Du se utiliza como punto terapéutico. El meridiano Du se considera el océano de los canales Yang donde Yang Qi alcanza su punto máximo. La moxibustión en el meridiano Du puede complementar el qi Yang, activar el efecto del meridiano Du y ajustar el efecto de calentamiento del Yang del riñón, es decir, mejorar la función de regulación inmune de la medicina occidental.
Desde la perspectiva de la medicina occidental, la médula espinal juega un papel importante en la transmisión de información neuronal. La du moxibustión, que actúa sobre la entrada y salida de las raíces nerviosas espinales, puede afectar la función y el mecanismo regulador del sistema nervioso a través de la regulación de los neurotransmisores. En la década de 1990, se demostró que la Du-moxibustión aumentaba el contenido de β-endorfinas en el hipotálamo de ratas, teniendo así un efecto analgésico central7. Además, la entesitis es una complicación común de la EA, caracterizada por dolor persistente y rigidez muscular, que puede afectar el movimiento de las articulaciones y el cuerpo cuando es grave. Como método de tratamiento de la MTC que ha sido clínicamente validado, la Du-moxibustión puede aliviar eficazmente la inflamación, promover la reparación de los tejidos y mejorar la entesitis en el tratamiento de la EA.
En concreto, los efectos de la acupuntura y la moxibustión se reflejan principalmente en los siguientes aspectos. En primer lugar, favorecen la circulación sanguínea y la absorción de la inflamación. La du-moxibustión estimula la circulación sanguínea y el metabolismo en los tejidos que rodean la columna vertebral a través del efecto de calentamiento y promueve la absorción de la inflamación y la reparación de los tejidos, reduciendo así el grado de inflamación y el dolor de la inflamación de la inserción del tendón. En segundo lugar, mejoran la tensión muscular y de ligamentos. El efecto de estimulación de la Du-moxibustión puede mejorar la tensión muscular alrededor de la columna vertebral, relajar los tejidos blandos endurecidos, promover la actividad de las articulaciones de la columna vertebral y reducir el dolor y la rigidez causados por la tensión muscular y el estiramiento de ligamentos. En resumen, la Du-moxibustión, como terapia complementaria, puede regular de manera integral las actividades de los sistemas nervioso, inmunológico y circulatorio del cuerpo al actuar sobre la región espinal, haciendo que el cuerpo esté más equilibrado en su conjunto.
La inflamación es la principal manifestación de la EA27. El TNF-α es una citoquina multiefectora y un factor inflamatorio producido bajo la estimulación de macrófagos mononucleares28. La actividad de la fosfatasa alcalina y la síntesis de colágeno pueden ser inhibidas por el TNF-α, lo que resulta en pérdida ósea y destrucción del cartílago29. En los últimos años, los estudios han encontrado que la IL-17 juega un papel importante en la patogénesis de la EA, lo que ha sido plenamente demostrado en una revisión30. La IL-17 puede actuar directamente sobre los osteoblastos, promover la expresión del ligando activador del receptor del factor de transcripción nuclear κB (NF-κB) (RANKL) y promover la generación robusta de osteoclastos. Al mismo tiempo, la IL-17 también afecta a las células madre mesenquimales (MSC), induciendo su proliferación y promoviendo su diferenciación en osteoblastos31. Kenna32 et al. encontraron que el nivel de IL-17 en la sangre periférica de los pacientes con EA aumentó casi el doble en comparación con los controles sanos. El estudio sugiere que los antagonistas de la IL-17 pueden ser una nueva opción para los pacientes con EA que no responden bien a los antagonistas del TNF-α33. Un estudio clínico mostró que un régimen de dosificación de antagonistas de IL-17 fue superior a un placebo para mejorar los signos y síntomas de la espondiloartritis axial radiográfica en pacientes34. Los resultados de este estudio mostraron que los niveles plasmáticos de TNF-α e IL-17 en el grupo modelo fueron significativamente más altos que los del grupo control, y los niveles plasmáticos de TNF-α e IL-17 disminuyeron significativamente después del tratamiento con Du-moxibustion.
La terapia de du-moxibustión utiliza hábilmente las técnicas compatibles de la medicina tradicional china para integrar los meridianos, los puntos de acupuntura, la medicina herbal china y la moxibustión. Las materias primas de la terapia de Du-moxibustión incluían principalmente terciopelo de moxa, jengibre y polvo de MTC. Desde la perspectiva de la medicina tradicional china, el terciopelo de moxa, un producto procesado de la artemisa, tiene la función de activar colaterales, disipar el frío y aliviar el dolor. El jengibre desempeña un papel en el alivio de los síntomas externos y la disipación del resfriado. La investigación moderna también muestra que el jengibre tiene propiedades antiinflamatorias y analgésicas35. Limpiar la piel con jugo de jengibre antes del tratamiento ayuda a abrir los poros y promover la permeabilidad transdérmica36, además de ayudar a que el polvo de MTC se adhiera a la piel. La columna trapezoidal de jengibre está firmemente fijada en la parte posterior para proporcionar una base sólida para el cono de moxa. Después de la quema del cono de moxa, los efectos de la potencia de fuego, el jengibre y el polvo de MTC trabajan juntos en el meridiano Du. En vista de la patogénesis de la deficiencia de Yang en esta enfermedad, la Du-moxibustión actúa directamente en el sitio de la enfermedad, calentando los meridianos, dispersando el frío, complementando el Yang Qi y la esencia, promoviendo la circulación sanguínea y equilibrando el Yin y el Yang para tratar la raíz de la enfermedad.
Al realizar la Du-moxibustión, se deben considerar varios detalles. En primer lugar, se fija el sitio de operación de la Du-moxibustión, desde el punto Dazhui (GV14) hasta el punto Yaoshu (GV2) (anatómicamente desde la7ª apófisis espinosa de la columna cervical hasta la vértebra de la cola, incluyendo toda la columna vertebral), lo que es consistente con el sitio de incidencia de la EA (Figura 4). En segundo lugar, la humedad y el grosor del jengibre son importantes. El exceso de jugo de jengibre debe exprimirse después de que el jengibre se procese en lodo de jengibre para que el lodo de jengibre no tenga una sensación granular y su grosor sea apropiado para convertirlo en la columna trapezoidal de jengibre. La alta humedad y la humedad en el lodo de jengibre pueden dificultar fácilmente la penetración del fuego de moxibustión y reducir la cantidad de estimulación de moxibustión. Si la materia prima de jengibre está demasiado seca y las partículas son demasiado grandes, es difícil hacer la columna trapezoidal de jengibre, lo que provoca una rápida penetración del calor y quemaduras en la piel. En tercer lugar, se debe considerar el tamaño y la firmeza del cono de moxa. Los conos de moxa utilizados para la moxibustión en ratones miden ~4 cm de largo y 0,5 cm de diámetro y deben estar apretados en el momento de la preparación. Una prueba de estanqueidad es cuando el cono no se desenreda incluso después de dejarlo caer sobre una superficie. Si el cono de moxa no es lo suficientemente compacto, conducirá a una reducción en la cantidad de terciopelo de moxa, un tiempo de combustión más corto y una reducción en la potencia de fuego. En cuarto lugar, al encender el cono de moxa, la cabeza, el medio y la cola del cono de moxa deben encenderse con incienso fino para que el cono de moxa se queme lentamente para lograr el efecto nutritivo de flujo y reflujo. En quinto lugar, el almizcle es un ingrediente importante en el polvo medicinal de la moxibustión. El segundo día después de la moxibustión, debe haber ampollas cristalinas como pequeñas perlas en el meridiano Du.
Un gran número de estudios clínicos han confirmado la eficacia definitiva de la Du-moxibustión en el tratamiento de la EA 4,5,6. Sin embargo, la investigación sobre su mecanismo de acción en experimentos con animales avanza lentamente. A través de la investigación y la innovación, años de experiencia en el funcionamiento de Du-moxibustión nos han llevado a investigar su uso en experimentos con ratones. En este trabajo se describen en detalle los procedimientos de operación y las precauciones de la Du-moxibustión en el tratamiento de la EA en ratones experimentales. Además, se observó el efecto de la moxibustión sobre la coordinación motora y los niveles plasmáticos de TNF-α e IL-17 en ratones con EA. Este estudio proporcionó la base experimental más básica para el estudio del mecanismo de la Du-moxibustión en el tratamiento de la EA. Todavía hay algunas limitaciones en este estudio. Por ejemplo, en futuros estudios, prestaremos atención a la evaluación de diferentes parámetros como la moxibustión placebo, la dosis, el rango y el tiempo de tratamiento para obtener los esquemas de combinación más efectivos. En estudios posteriores, se pueden utilizar métodos de imagen para evaluar los resultados del tratamiento de una manera más intuitiva.
La perspectiva de aplicación de la terapia de Du-moxibustión es prometedora. El meridiano Du, conocido como el Vaso Gobernador, juega un papel crucial en la regulación del flujo de Qi y sangre en todo el cuerpo. La moxibustión, una terapia tradicional china, consiste en quemar artemisa en puntos de acupuntura específicos para estimular los meridianos y promover el mecanismo de autocuración del cuerpo. En comparación con la acupuntura, la Du-moxibustión es una combinación de varias técnicas que actúan sobre la superficie corporal, que tiene las características de comodidad y un rango de acción fuerte y amplio. Además, la terapia de Du-moxibustión se centra en la zona de la espalda y la columna vertebral, centrándose en la vía del meridiano Du. Puede mejorar el sistema inmunológico del cuerpo, mejorar la circulación sanguínea y aliviar diversas afecciones físicas y mentales. La terapia ha demostrado su eficacia en el tratamiento de enfermedades como trastornos musculoesqueléticos, afecciones neurológicas, trastornos ginecológicos y problemas de salud mental. Con los avances en la investigación y la tecnología, se espera que la aplicación de la terapia de Du-moxibustión se amplíe aún más. Los estudios futuros pueden explorar su potencial en áreas como el manejo del dolor, la reducción del estrés, los trastornos digestivos y las afecciones respiratorias. La combinación de los conocimientos tradicionales y la comprensión científica moderna podría conducir a una mejor integración de la terapia de Du-moxibustión en las prácticas sanitarias convencionales. En conclusión, la terapia de Du-moxibustión es muy prometedora en su aplicación e integración en diversos campos de la salud. La investigación adicional, los ensayos clínicos y la colaboración entre los profesionales de la medicina tradicional china y los profesionales de la salud modernos son esenciales para liberar todo su potencial.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa General de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.82174491) y el Proyecto de Herencia de la Escuela Académica de Medicina Tradicional China Qilu (No. Lu Weihan [2020]132). Gracias al Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shandong por proporcionarnos condiciones experimentales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% EDTA | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.,Shanghai, China | ||
| alcohol pads | HYNAUT, Qingdao Hainuo Biological Engineering Co., LTD, Qingdao, China | ||
| anesthesia machine | Medical Supplies & Services INT. LTD, Keighley, UK | ||
| centrifuge tubes | Axygen, Corning, NewYork, UAS | ||
| complete Frech's adjuvant (CFA) | aladdin,Shanghai, China | F393378 | |
| cotton ball | Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China | ||
| cotton gauze | Henan RUIKE MEDICAL Equipment Co., Ltd.,Xinxiang, China | ||
| cutting board | self-preparation | ||
| decorin from bovine articular cartilage | Sigma-Aldrich, MO, USA | D8428 | |
| depilatory cream | Veet, Reckitt Benckiser (China) Investment Co. LTD, Shanghai, China | ||
| electronic scale | Shanghai Yajin Electronic Technology Co., Ltd.,Shanghai, China | ||
| Eppendorf tube | Axygen, Corning, NewYork, UAS | ||
| eye lubricant | Beijing Shuangji Pharmaceutical Co., LTD., Beijing, China | ||
| ginger | self-preparation | ||
| GraphPad Prism 7 software | GraphPad Software,Boston, USA | ||
| hair clipper | Super human Group CO LTD, Jinhua, China | ||
| heating pads | Shenzhen Leshuo Tech Co., Ltd.,Shenzhen, China | ||
| incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | aladdin,Shanghai, China | F393371 | |
| injection syringe | Shandong Xinhua Ande Medical Supplies Co., LTD, Zibo, China | ||
| isoflurane | Shenzhen Rayward Life Technology Co., LTD, Shenzhen, China | R510-22-10 | |
| joss stick | Shijiazhuang Lidu Fragrant Industry Co., LTD.,Shijiazhuang, China | ||
| juicer | Braun (Shanghai) Co., Ltd.,Shanghai, China | ||
| knife | self-preparation | ||
| lighter | Zhejiang tiger-lighter Co. LTD | ||
| mortar | Luoyang Yinai Ceramic Technology Co., LTD.,Luoyang, China | ||
| Mouse IL-17 ELISA Kit | absin, Shanghai, China | abs520009-96T | |
| Mouse TNF-α ELISA Kit | Wuhan Sanying, Wuhan, China | KE10002 | |
| mulberry paper | Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China | ||
| OFT | Xinruan,Shanghai, China | XR-XZ301 | |
| paper cup | self-preparation | ||
| pipettes | OXFORD BIO INSTRUMENTS INC.,Oxford, UK | ||
| refined moxa velvet | self-preparation | ||
| rotarod | Xinruan,Shanghai, China | XR-6C | |
| scientz-48L cryogenic high throughput tissue grinder | Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., LTD | ||
| scissors | Shandong Jiaren Medical Supplies Co., Ltd., Zibo, China | ||
| semi-automatic paraffin sectioning machine | Leica Camera AG, Watznach, Germany | ||
| SPSS 25.0 software | International Business Machines Corporation, NewYork, UAS | ||
| TCM powder | self-preparation | ||
| tips | Biosharp, Labgic, Beijing, China | ||
| writing brush | Yishui County Mulinsang paper Co., LTD, Linyi, China |
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