Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Microfluïdisch model van necrotiserende enterocolitis met menselijke neonatale darmenteroïden en een dysbiotisch microbioom

Published: July 28, 2023 doi: 10.3791/65605
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 1, 1, 1
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2University of Nebraska College of Medicine, 3Department of Surgery, Washington University School of Medicine

Summary

Dit protocol beschrijft een in vitro model van necrotiserende enterocolitis (NEC), dat kan worden gebruikt voor mechanistisch onderzoek naar de pathogenese van ziekten. Het beschikt over een microfluïdische chip bezaaid met darmenteroïden die zijn afgeleid van de menselijke neonatale darm, endotheelcellen en het darmmicrobioom van een pasgeborene met ernstige NEC.

Abstract

Necrotiserende enterocolitis (NEC) is een ernstige en mogelijk dodelijke darmziekte die moeilijk te bestuderen is vanwege de complexe pathogenese, die nog steeds niet volledig wordt begrepen. De pathofysiologie van NEC omvat verstoring van intestinale tight junctions, verhoogde permeabiliteit van de darmbarrière, epitheelceldood, microbiële dysbiose en ontregelde ontsteking. Traditionele hulpmiddelen om NEC te bestuderen zijn onder meer diermodellen, cellijnen en darmorganoïden van mensen of muizen. Hoewel studies met behulp van deze modelsystemen het begrip van de pathofysiologie van ziekten in het veld hebben verbeterd, is hun vermogen om de complexiteit van menselijke NEC te recapituleren beperkt. Er is nu een verbeterd in vitro model van NEC ontwikkeld met behulp van microfluïdische technologie, genaamd NEC-on-a-chip. Het NEC-on-a-chip-model bestaat uit een microfluïdisch apparaat dat is bezaaid met darmenteroïden afkomstig van een te vroeg geboren pasgeborene, samen met menselijke endotheelcellen en het microbioom van een baby met ernstige NEC. Dit model is een waardevol hulpmiddel voor mechanistische studies naar de pathofysiologie van NEC en een nieuwe bron voor het testen van geneesmiddelen voor neonatale darmziekten. In dit manuscript wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van het NEC-on-a-chip-model.

Introduction

Necrotiserende enterocolitis (NEC) treft te vroeg geboren baby's, met een incidentie tot 10% bij degenen die geboren zijn < 1500 g1. De pathofysiologie van NEC is complex en omvat schade aan het darmepitheel, verstoring van intestinale tight junctions, verhoogde doorlaatbaarheid van de darmbarrière, ontregeling van het immuunsysteem en epitheelceldood2,3. Ons begrip van de mechanismen die betrokken zijn bij de pathogenese van NEC blijft onvolledig en ondanks tientallen jaren van onderzoek zijn er nog steeds geen effectieve gerichte therapieën.

Een belangrijke barrière voor het bevorderen van NEC-onderzoek is de beperkte beschikbaarheid en kleine omvang van primair darmweefsel geïsoleerd uit menselijke zuigelingen. Darmweefsel dat is verwijderd van zuigelingen met NEC is vaak necrotisch en ernstig beschadigd, wat onderzoek naar mechanismen die voorafgaan aan het begin van de ziekte bemoeilijkt. De dunne darm van zuigelingen met NEC wordt bijvoorbeeld overspoeld met immuuncellen en een verminderd aantal darmstamcellen, verminderde proliferatie van epitheelcellen en verhoogde apoptose van epitheelcellen worden ook waargenomen 4,5,6,7. Dit leidt tot problemen bij het kweken van darmepitheelcellen uit deze monsters en bij het isoleren van RNA en eiwitten, die in deze vijandige ontstekingsomgeving kunnen worden afgebroken. Bovendien, aangezien het ziekteproces al vergevorderd is bij zuigelingen met chirurgische NEC, zijn mechanistische studies naar factoren die ziekte veroorzaken onhaalbaar. Deze beperkingen hebben geleid tot een afhankelijkheid van diermodellen voor mechanistische studies van NEC.

Er zijn diermodellen van NEC opgesteld voor muizen, ratten, biggen, konijnen en bavianen 5,8,9,11. Een sterk punt van diermodellen is dat NEC-achtige darmziekte wordt veroorzaakt door factoren die verband houden met het ontstaan van NEC bij mensen, waaronder een dysbiotisch microbioom, herhaalde episodes van hypoxie en de afwezigheid van moedermelkvoeding. Bovendien lopen de ontstekingsreactie en pathologische veranderingen die zijn waargenomen tijdens experimentele NEC parallel met de ziekte bij de mens 5,9,12. Hoewel deze modellen veel van de kenmerken van menselijke NEC nabootsen, zijn er inherente verschillen tussen de pathofysiologie van NEC bij dieren en mensen. Het muizenmodel van NEC wordt bijvoorbeeld geïnduceerd bij voldragen muizen, en hoewel hun darmontwikkeling onvolledig is, is de pathofysiologie van NEC inherent anders in deze klinische context. De intestinale genexpressie van muizen bij de geboorte is vergelijkbaar met die van een pre-levensvatbare menselijke foetus en benadert die van een te vroeg geboren pasgeborene van 22-24 weken zwangerschap pas op dag 14 (P14)13. Dit verwart het NEC-model van muizen omdat darmbeschadiging over het algemeen niet kan worden geïnduceerd bij muizen na P10. Bovendien missen ingeteelde muizenstammen de immunologische14 en microbiologische diversiteit van menselijke pasgeborenen15, wat een andere verstorende factor is. Een grotere opname van primaire menselijke monsters in NEC-onderzoek verbetert dus de klinische relevantie van studies op dit gebied.

Studies naar de mechanismen van NEC in vitro hebben van oudsher gebruik gemaakt van monotypische cellijnen die zijn afgeleid van volwassen darmkankercellen, zoals colorectaal adenocarcinoom (Caco2) en humaan colonadenocarcinoom (HT-29) cellen16. Deze modellen zijn handig, maar beperkt in fysiologische relevantie vanwege hun groei uit volwassen kankercellen, niet-gepolariseerde architectuur en fenotypische veranderingen die verband houden met herhaalde passages in cultuur. Intestinale enteroïden verbeteren die modellen omdat ze kunnen worden gekweekt uit de crypten van darmweefsel, gedifferentieerd in alle subtypes van het darmepitheel en een driedimensionale (3D) villusachtige structuur vormen17,18,19,20. Onlangs zijn intestinale enteroïden gecombineerd met microfluïdische technologie om een dunne darm-op-een-chip-model te ontwikkelen en een fysiologisch relevanter in vitro modelsysteemte bieden 21.

De eerste organ-on-a-chip microfluïdische apparaten werden geïntroduceerd in het begin van de jaren2000 22,23,24. Het eerste orgaan-op-een-chip-model was de menselijke ademhaling long-op-een-chip25. Dit werd gevolgd door tal van modellen met één orgaan, zoals darm21, lever26, nieren 27, beenmerg28, bloed-hersenbarrière29 en hart30. Deze organ-on-a-chip-modellen zijn gebruikt om acute, chronische en zeldzame ziekten te bestuderen, waaronder acuut stralingssyndroom,31 chronische obstructieve longziekte,32 en neurodegeneratieve ziekten 33. De gepolariseerde aard van de cellen op deze chips en de aanwezigheid van twee cellulaire compartimenten gescheiden door een poreus membraan maakt het mogelijk om complexe fysiologische processen te modelleren, zoals perfusie, chemische concentratiegradiënten en chemotaxis van immuuncellen34,35. Deze microfluïdische systemen bieden dus een nieuw hulpmiddel voor het bestuderen van de pathofysiologie en mechanismen van menselijke ziekten.

Het dunne darm-op-een-chip-model werd beschreven door Kasendra et al. in 2018, die pediatrische (leeftijd 10-14 jaar oud) dunne darmbiopsiemonsters gebruikten die waren gedifferentieerd in enteroïden en gekweekt op een microfluïdisch apparaat21. Vasculaire endotheelcellen, continue mediastroom en rek/ontspanning werden ook in dit model opgenomen. Ze observeerden differentiatie van het subtype van het darmepitheel, de vorming van 3D-villusachtige assen, de productie van slijm en genexpressiepatronen in de dunne darm21. Dit microfluïdische model werd toegepast op neonatale ziekten met de ontwikkeling van het NEC-on-a-chip-systeem, dat neonatale darmenteroïden, endotheelcellen en het microbioom van een pasgeborene met NEC36 omvat. NEC-on-a-chip recapituleert veel van de kritieke kenmerken van menselijke NEC, waaronder inflammatoire genexpressie, verlies van gespecialiseerde epitheelcellen en verminderde darmbarrièrefunctie36. Dit model heeft dus tal van toepassingen in de studie van NEC, waaronder mechanistische studies en het ontdekken van geneesmiddelen. In dit manuscript wordt een gedetailleerd protocol gegeven voor de prestaties van het NEC-on-a-chip-model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Enteroïden werden afgeleid van dunne darmmonsters van premature baby's (geboren na 22 tot 36 weken zwangerschap) verkregen op het moment van chirurgie voor NEC of andere darmaandoeningen met niet-inflammatoire etiologieën. Alle verzameling en verwerking van monsters werd uitgevoerd na geïnformeerde toestemming en goedkeuring van de Institutional Review Boards van de Washington University in St. Louis (IRB-protocolnummers 201706182 en 201804040) en de University of North Carolina in Chapel Hill (IRB-protocolnummer 21-3134).

1. Isolatie en plating van crypten uit de menselijke neonatale dunne darm om enteroïden vast te stellen

  1. Voorbereiding van de media
    1. Bereid alle benodigde media voor zoals beschreven in tabel 1. Zorg ervoor dat een aseptische techniek wordt gebruikt voor de bereiding van alle media. Filter steriliseer media met een filter van 0,2 μm en bewaar tot gebruik bij 4 °C.
  2. Darmweefsel wassen en fijnhakken
    1. Plaats de hydrogel van de celkweekmatrix op ijs om te ontdooien. Verkrijg menselijk darmweefsel uit de operatiekamer. Plaats het monster onmiddellijk in 5 ml ijskoude tissuewasmiddelen om endogene proteasen te inactiveren.
    2. Spoel de darminhoud met ijskoude Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (D-PBS) met behulp van een spuit van 10 ml met een bijgesneden P1000-pipetpunt. Breng het darmweefsel over naar een schaaltje van 35 mm met 5 ml ijskoude D-PBS.
    3. Knip het darmweefsel in de lengterichting door om het lumen bloot te leggen en knip het in kleine stukjes met een fijne schaar. Spoel het darmweefsel door zachtjes te roeren met D-PBS in het weefselkweekschaaltje.
    4. Breng weefselfragmenten over in een schone schaal van 35 mm. Hak weefsel fijn met een fijne schaar. De optimale maat is 0,5cm2 per stuk. Het darmweefsel moet door een bijgesneden pipetpunt van 1 ml gaan.
  3. Dissociërend darmweefsel
    1. Voeg 1 ml voorverwarmd collagenase I toe aan het weefsel. Meng weefsel met collagenase door 10-15 keer te pipetteren en over te brengen naar een conische buis van 15 ml.
    2. Zet de buis horizontaal vast op een shaker die is ingesteld op 50 rpm. Schud gedurende 20 minuten op kamertemperatuur.
    3. Verwijder na de incubatie de buisjes uit de shaker en suspendeer de oplossing door 10-15 keer te pipetteren. Optioneel: Verwijder een kleine aliquot om de aanwezigheid van enkele crypten te verifiëren met behulp van fasecontrastmicroscopie.
  4. Isolatie van darmcrypten
    1. Filtreer crypten door een zeef van 70 μm in een conische buis van 50 ml op ijs. Was de zeef met 9 ml ijskoud tissuewasmiddel. Breng het filtraat over in een conische buis van 15 ml.
    2. Centrifugeer op 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verwijder voorzichtig het supernatant. Er blijft ongeveer 200 μL media in de buis achter. Resuspendeer de pellet in 5 ml van het ijskoude tissuewasmiddel.
    3. Centrifugeer op 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de pellet in 1 ml tissuewasmiddel en breng over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    4. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de crypten te pelleteren. Zuig het supernatans zoveel mogelijk voorzichtig en volledig op met behulp van een pipet. Plaats de buis op ijs.
  5. Intestinale crypten plateren
    1. Resuspendeer de pellet in celkweekmatrixhydrogel (20 μL/putje van een weefselkweekplaat met 48 putjes) met behulp van een voorgekoelde pipetpunt om een homogene suspensie van crypten te maken terwijl het buisje op ijs blijft. Vermijd het maken van luchtbellen tijdens het pipetteren. Bewaar de tube op ijs tot hij klaar is voor gebruik.
      OPMERKING: De hydrogel van de celkweekmatrix polymeriseert bij temperaturen boven 8 °C. Crypten geïsoleerd uit een stuk darmweefsel van 0,5 cm-1 cm lang worden over het algemeen geplateerd in 10 putjes van een weefselkweekplaat met 48 putjes.
    2. Plaat de hydrogelsuspensie van de crypte/celkweekmatrix in een voorverwarmde weefselkweekplaat met 48 putjes. Verwarm de plaat om te helpen bij het stollen van de matrix. Plaats de ophanging in het midden van de put. Vermijd luchtbellen bij het plateren.
    3. Incubeer de platen gedurende 20 minuten bij 37 °C om de matrix te polymeriseren. Het is essentieel dat de hydrogel van de celkweekmatrix volledig polymeriseert voordat media worden toegevoegd.
    4. Nadat de matrix is gepolymeriseerd, voegt u 300 μL voorverwarmde 50% L-WRN geconditioneerde media toe aan elk putje. Incuberen bij 37 °C, 5% CO2.
    5. Wissel elke 2 tot 3 dagen van medium. Vervang door warme 50% L-WRN geconditioneerde media. Passage om de 7 tot 10 dagen. Passage enteroïden wanneer ze 50%-90% confluent zijn en knopvorming vertonen.
      OPMERKING: Het medium moet mogelijk vaker worden vervangen als het geel wordt. De frequentie van passage hangt af van de enteroïde dichtheid en de groeisnelheid van de cellen van een bepaalde patiënt. Enteroïden moeten worden gepasseerd als hun centra er donker uitzien.
  6. Passeren van de enteroïden
    1. Zuig voorzichtig media uit de putjes op. Was de putjes zorgvuldig met 500 μL warme D-PBS. Pas op dat u de matrix niet verstoort.
    2. Voeg 250 μL oplossing voor het terugwinnen van koude cellen toe aan elk putje. Kras op de bodem van elk putje met een nieuwe pipetpunt om de hydrogel van de celkweekmatrix te verstoren. Incubeer de plaat 30 minuten op ijs.
    3. Dissocieer enteroïden door krachtig pipetteren (~25-50 keer met P200-pipet) en voeg 500 μL weefselwasmiddelen toe.
    4. Breng enteroïde suspensie over in een tube van 15 ml en voeg nog eens 5 ml koud wasmedium toe. Pipetteer voorzichtig om een homogene oplossing te vormen.
    5. Centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de enteroïden te pelleteren. Plaats de buis op ijs en zuig het supernatans zo volledig mogelijk op. Er blijft ongeveer 30-60 μL in de buis achter.
      OPMERKING: Als er problemen zijn met het breken van de enteroïden met pipetteren, kan 0,25% trypsine-EDTA of enzymatisch dissociatiereagens worden gebruikt om dit proces te vergemakkelijken.
    6. Resuspendeer enteroïden in het restvolume van wasmedia met een P200-pipet. Voorkom luchtbelvorming tijdens het pipetteren.
    7. Voeg 20 μL celkweekmatrixhydrogel per nieuw putje van een plaat met 48 putjes toe aan de enteroïde suspensie. Splits de enteroïden 1:3, 1:4 of 1:5, afhankelijk van hun dichtheid.
    8. Voeg de suspensie toe aan een voorverwarmde plaat met 48 putjes. Incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij 37 °C om de matrix te laten stollen.
    9. Voeg na polymerisatie 300 μL voorverwarmde 50% L-WRN geconditioneerde media toe aan elk putje. Incuberen bij 37 °C, 5% CO2.

2. Neonataal darm-op-een-chip-model

NOTITIE: Voor gedetailleerde instructies over het hanteren van de microfluïdische chips en het gebruik van deze apparatuur, zie het twaalfvingerige darm-chipkweekprotocol37 van de fabrikant.

  1. Voorbereiding van de media
    1. Bereid alle benodigde media voor zoals beschreven in Tabel 2. Zorg ervoor dat een aseptische techniek wordt gebruikt. Filter steriliseer media met een filter van 0,2 μm en bewaar tot gebruik bij 4 °C.
  2. Dag (-3): Ontdooien en uitzetten van menselijke intestinale microvasculaire endotheelcellen (HIMEC's)
    1. Ontdooi een injectieflacon met HIMEC's en plaat volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
    2. Bestrijk een kolf van 25cm2 gedurende 2 minuten met een coatingoplossing op basis van gelatine. Verwijder overtollige oplossing. Voeg HIMEC's (ongeveer 0,5-1 x 10 6 cellen) geresuspendeerd in6 ml HIMEC-media toe aan de kolf. Incuberen bij 37 °C, 5% CO2.
    3. Vervang het HIMEC-medium elke 48 uur. Voeg HIMEC's toe aan het endotheliale (onderste) kanaal van de chip binnen 48-72 uur nadat ze 100% confluent zijn geworden.
  3. Dag (-1): Activeren en coaten van de chips voorafgaand aan de toevoeging van de enteroïden
    1. Reconstitueer het chipactiveringsreagens 1 (CR-1)-poeder om CR-1-oplossing te maken. Zorg ervoor dat CR-1-poeder en spaanactiveringsreagens 2 (CR-2)-oplossing voor deze stap op kamertemperatuur zijn.
      NOTITIE: Houd het CR-1-poeder en de CR-1-oplossing die in de volgende stappen wordt bereid, te allen tijde beschermd tegen licht. Voor deze stappen moet het licht in de kap uit zijn.
      1. Plaats de chip en de chipdrager in de chiphouder en plaats ze vervolgens in een weefselkweekschaaltje in de celkweekkap. Zie het protocol van de fabrikant voor de juiste techniek voor het plaatsen van de spaan in de drager37.
      2. Voeg 1 ml CR-2-oplossing toe aan de injectieflacon met CR-1-poeder en breng de oplossing vervolgens rechtstreeks over van de injectieflacon met CR-1-poeder naar een buis van 15 ml die in aluminiumfolie is gewikkeld om deze tegen licht te beschermen. Meng de oplossing niet met de pipet. Het doel is om luchtbelvorming te voorkomen.
      3. Voeg nog eens 1 ml CR-2-oplossing toe aan de CR-1-injectieflacon en breng over naar de tube van 15 ml. Herhaal dit voor een totaal van 4 spoelingen en een totaal van 4 ml CR-2 gespoeld door de CR-1 injectieflacon. Voeg de dop toe aan de injectieflacon en keer om voor de laatste spoeling om eventueel achtergebleven poeder te verwijderen.
      4. Voeg nog eens 6 ml CR-2 toe aan de tube van 15 ml met CR-1 voor een eindvolume van 10 ml (0,5 mg/ml). Meng deze oplossing met een pipet zonder luchtbellen te introduceren. Zorg ervoor dat CR-1 volledig is opgelost voordat u doorgaat naar de volgende stap.
    2. Toevoeging van CR-1-oplossing aan chip
      OPMERKING: Het is van cruciaal belang om te voorkomen dat er bubbels in de kanalen worden geïntroduceerd tijdens het toevoegen van deze oplossingen. CR-1-oplossing moet voor deze stap beschermd blijven tegen licht.
      1. Voeg met behulp van een pipetpunt van 200 μl 20 μl CR-1-oplossing toe aan de inlaat van het onderste kanaal totdat de oplossing de uitlaat van het onderste kanaal begint te verlaten. Voeg 50 μL CR-1-oplossing toe via de inlaat van het bovenste kanaal totdat de oplossing de uitlaat van het bovenste kanaal begint te verlaten. Verwijder overtollige CR-1-oplossing van het oppervlak van de chip door voorzichtig op te zuigen.
        NOTITIE: Oplossingen moeten altijd vóór het bovenste kanaal aan het onderste kanaal worden toegevoegd. Als er luchtbellen worden waargenomen, spoel dan beide kanalen door met CR-1-oplossing en herhaal 2.3.2.1.
      2. Als het deksel van het weefselkweekschaaltje met de chips op zijn plaats zit, verwijder het dan voor deze stap. Plaats de chips gedurende 15 minuten onder UV-licht. Verwijder CR-1 van de bovenste en onderste kanalen.
      3. Herhaal de stappen 2.3.2.1 tot en met 2.3.2.2 voor in totaal twee UV-activeringsstappen. Na deze stap zijn de chips niet meer lichtgevoelig.
      4. Verwijder CR-1 van de bovenste en onderste kanalen. Was beide kanalen met 100 μL CR-2-oplossing. Verwijder de CR-2-oplossing uit de bovenste en onderste kanalen.
      5. Was beide kanalen met 100 μL steriele D-PBS. Herhaal de wasbeurten 2x. Voeg 100 μL D-PBS toe aan beide kanalen. Verwijder overtollig materiaal van het oppervlak van de chips, maar laat de kanalen vol.
    3. Smeer de kanalen in met de extracellulaire matrix.
      1. Ontdooi fibronectine, collageen IV en celkweekmatrixhydrogel onmiddellijk voorafgaand aan deze stap op ijs en bewaar deze oplossingen op ijs voor de rest van dit gedeelte.
      2. Bereid de volgende extracellulaire matrix (ECM)-oplossingen voor de boven- en onderkanalen van de chip voor:
        Bovenste kanaal: 100 μL van 200 μg/ml type IV collageen en 100 μg/ml celkweekmatrixhydrogel in D-PBS per chip.
        Onderste kanaal: 100 μL 200 μg/ml type IV collageen en 30 μg/ml fibronectine in D-PBS per chip.
      3. Verwijder D-PBS volledig van de bovenste en onderste kanalen. Voeg 50 μL ECM toe aan de inlaat van het onderste kanaal totdat er een druppel op de uitlaat verschijnt. Herhaal dit voor het bovenste kanaal. Zorg ervoor dat u voor elk kanaal de juiste ECM-oplossingen gebruikt en voeg de oplossing eerst toe aan het onderste kanaal.
      4. Voeg D-PBS toe aan het reservoir van de chiphouder en plaats het deksel terug op de weefselkweekplaat. Plaats de chips een nacht in een bevochtigde incubator van 37 °C, 5% CO2 .
  4. Dag (0): Zaaien van chips met HIMEC's en enteroïden
    1. Vacuümevenwicht van media
      1. Voeg het benodigde volume HIMEC-media en chipexpansiemedia toe aan een steriele conische buis van 50 ml om het experiment te voltooien. Breng de media in evenwicht tot 37 °C in een waterbad gedurende ten minste 1 uur.
      2. Sluit het vacuümfiltratieapparaat aan op buizen van 50 ml met verwarmde media. De buizen moeten worden georiënteerd met de voorverwarmde media aan de onderkant van de conische buis van 50 ml. Vacuüm bij -70 kPa of hoger gedurende 10 s.
      3. Draai de buizen om zodat het medium door het filter beweegt. Blijf 5 minuten stofzuigen. Verwijder na voltooiing van de vacuümfiltratie het vacuümfiltratieapparaat en plaats de buizen van 50 ml met media in de incubator van 37 °C.
    2. Het wassen van de chips
      1. Was het endotheelkanaal door te spoelen met 100 μL voorverwarmd HIMEC-medium.
        Was het epitheelkanaal door te spoelen met 100 μL voorverwarmde spaanexpansiemedia. Verwijder alle media die zich op het oppervlak van de chips hebben verspreid.
      2. Herhaal de wasstap. Media moeten na deze spoelingen in de kanalen en inlaat- en uitlaatpoorten blijven. Plaats het deksel van de kweekschaal met de chips terug en doe terug in de broedmachine tot het klaar is voor gebruik.
    3. Oogsten van HIMEC's
      1. Zuig media op uit de kolf van 25 cm2 die HIMEC's bevat. Was de monolaag voorzichtig met D-PBS. Voeg 2 ml voorverwarmde 0,05% trypsine-EDTA toe aan de kolf en spoel voorzichtig over de monolaag.
      2. Incubeer de kolf bij 37 °C gedurende 2-5 min. Neutraliseer trypsine met 10 ml HIMEC-media. Resuspendeer de cellen in media en breng ze over naar een buis van 15 ml.
      3. Centrifugeer in cellen 150 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer cellen in 200 μL HIMEC-media.
      4. Verwijder 10 μL cellen en plaats de buis op ijs. Tel cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. De gewenste concentratie HIMEC's is 6 x 10 6 tot 8 x 106 cellen/ml.
    4. HIMEC's op de chip plaatsen
      1. Haal de chip uit de couveuse en breng deze in de kap. Zuig alle media op die mogelijk op het oppervlak van de chip zijn gelekt.
      2. Spoel het epitheliale (bovenste) kanaal van de chip met 100 μL voorverwarmde spaanexpansiemedia. Spoel het endotheliale (onderste) kanaal van de chip met 100 μL voorverwarmde HIMEC-media.
      3. Resuspendeer de HIMEC's voorzichtig om een homogene verdeling te verkrijgen. Verwijder de media volledig uit het endotheliale (onderste) kanaal. Voeg 10 μL HIMEC's (~36.000 cellen/chip) toe aan het endotheliale (onderste) kanaal.
        OPMERKING: Als het moeilijk is om het HIMEC-kanaal te vullen zonder bellenvorming bij gebruik van 10 μL HIMEC's, verhoog dan het volume van de toegevoegde cellen. Het moet hetzelfde aantal cellen per chip zijn.
      4. Voeg extra organoïde groeimedia toe aan het epitheliale (bovenste) kanaal als het niet vol is. Controleer de zaaidichtheid van de HIMEC's. Als ze niet gelijkmatig verdeeld zijn en niet 80%-90% van het spaanoppervlak bedekken, spoel dan het kanaal door en herhaal het zaaien.
      5. Keer de chip om in de chiphouder in de celkweekschaal. Voeg D-PBS toe aan het reservoir in de spaanhouder. Plaats het deksel terug op de celkweekschaal en plaats deze in de incubator.
      6. Laat de chip 2-3 uur omgekeerd bij 37 °C staan, zodat HIMEC's zich aan het chipmembraan kunnen hechten. Nadat de incubatie is voltooid, zet u de chip/spaanhouder weer rechtop.
      7. Was het endotheelkanaal (onderkant) voorzichtig met 100 μL warm HIMEC-medium. Laat media in het kanaal staan. Was het epitheliale (bovenste) kanaal voorzichtig met 100 μL organoïde groeimedia. Laat media in het kanaal staan.
      8. Breng de chips terug naar de incubator van 37 °C terwijl u de volgende stappen voltooit.
    5. Enteroïden oogsten en zaaien op chip
      OPMERKING: Chips zijn gezaaid met enteroïden die 10-14 dagen eerder zijn gesplitst, voor 50%-75% samenvloeien en bij passage 7 en 20. Zie figuur 2 voor het verschijnen van enteroïden op dag 0. De tijd die enteroïden nodig hebben om klaar te zijn om te zaaien, hangt af van de groeisnelheid van de cellen van een bepaalde patiënt.
      1. Zuig voorzichtig media uit de putjes op. Was de putjes die de hydrogel van de celkweekmatrix bevatten zorgvuldig met 500 μL warme D-PBS. Pas op dat u de hydrogel van de celkweekmatrix niet verstoort.
      2. Voeg 250 μL oplossing voor het terugwinnen van koude cellen toe aan elk putje. Kras op de bodem van elk putje met een verse pipetpunt om de hydrogel van de celkweekmatrix te verstoren. Voeg de inhoud van de putjes toe aan een koude buis van 15 ml op ijs.
      3. Incubeer de buis gedurende 45 minuten op ijs en keer de buis elke 3-5 minuten om. Bereid tijdens deze stap enteroïde dissociatiemedia voor. Plaats dit medium in het waterbad van 37 °C als er nog 10 minuten over zijn in de incubatiestap.
      4. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de enteroïden te pelleteren. Verwijder het supernatant.
      5. Voeg 2 ml enteroïde dissociatiemedia per geoogste plaat toe aan de pellet en plaats deze gedurende 60 s tot 120 s in een waterbad van 37 °C. Draai de buis voorzichtig rond tijdens de incubatie. Incubeer lang genoeg om gefragmenteerde enteroïden te verkrijgen, maar zonder dissociatie in een enkele celsuspensie.
      6. Voeg na incubatie 10 ml koud tissuewasmiddel toe aan elke tube van 15 ml. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de enteroïden te pelleteren. Zuig het supernatans volledig op.
      7. Resuspendeer de pellet in 200 μL spaanexpansiemiddel. Dissocieer enteroïden door krachtig pipetteren (~25-50 keer met P200-pipet).
      8. Combineer cellen in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml. Pipetteer voorzichtig om een homogene oplossing te vormen. Het doel is om de chip te bezaaien met gefragmenteerde enteroïden in kleine clusters van 10-30 cellen.
      9. Verwijder 10 μL celsuspensie om te tellen. Plaats de resterende celsuspensie op ijs. Pas het volume van de spaanexpansiemedia aan om een concentratie van 6 x 106 cellen/ml te bereiken.
        OPMERKING: Het kan nodig zijn om de enteroïden te centrifugeren en opnieuw te suspenderen in een kleiner volume media om de vereiste dichtheid te bereiken.
      10. Breng de microfluïdische chips in de kap en zuig de media op uit het epitheliale (bovenste) kanaal van de chip. Laad het bovenste kanaal van de chip met 30 μL geresuspendeerde cellen (~180.000 cellen/chip). Zorg voor een volledige en uniforme dekking van het epitheelkanaal van de chip voor de vorming van een monolaag. Als dit niet lukt, spoel dan de enteroïden door de chip en zaai ze opnieuw in.
        OPMERKING: Als er problemen zijn met het bereiken van een uniforme suspensie tijdens het laden van meerdere chips, kunnen de enteroïden worden gescheiden in aliquots van 40 μl in afzonderlijke microcentrifugebuisjes van 1,5 ml. Dit minimaliseert de variabiliteit in het aantal enteroïden en de fragmentgrootte naarmate het laden vordert.
      11. Doe de chips terug in de chiphouder in de celkweekschaal (als ze zijn verwijderd). Voeg D-PBS toe aan het reservoir in de spaanhouder. Plaats het deksel terug op de celkweekschaal en plaats de chips een nacht bij 37 °C, 5% CO2 .
  5. Dag (1): Bereiding van de peulen en vloei in de chips
    1. Breng de chips in de weefselkweekkap. Spoel het epitheelkanaal twee keer voorzichtig met 100 μL spaanexpansiemiddel. Spoel het endotheelkanaal twee keer voorzichtig met 100 μL HIMEC-media. Verwijder overtollige media van het spaanoppervlak.
    2. Primer pods en regel volgens het protocol van de fabrikant37. Voeg 2 ml geschikt medium toe aan de inlaatreservoirs. Voeg 300 μL van de juiste media toe aan de uitlaatreservoirs. Het debiet zal 30 μL/h zijn. Stretchen wordt nog niet gestart.
  6. Dag (2): Monitoren van monolayer ontwikkeling en wisselen van media
    1. Pauzeer de kweekmodule en breng de peulen in de kap.
    2. Inspecteer chips en peulen op luchtbellen. Onderzoek de epitheliale monolaag met behulp van een fasecontrastmicroscoop. Leg beelden vast op consistente locaties op de chip om de voortgang te volgen. Stel je de chips voor terwijl ze in de pods blijven.
    3. Verwijder het medium uit de inlaatreservoirs van het bovenste kanaal en vervang het door 2 ml spaandifferentiatiemedia. Voeg 1 ml HIMEC-media toe aan het inlaatreservoir van het onderste kanaal. Laat voldoende media in de inlaatreservoirs om ervoor te zorgen dat de bodem van het reservoir bedekt blijft met een dunne laag media.
    4. Plaats de peulen terug in de kweekmodule en start de stroom opnieuw met 30 μL/h.
  7. Dag (3): Bewaken van de ontwikkeling van monolagen, initiëren van stretch en toevoegen van media
    1. Herhaal stap 2.6.1.1. en 2.6.1.2. Voeg 1 ml chipdifferentiatiemedia toe aan het inlaatreservoir van het bovenste kanaal en voeg 1 ml HIMEC-media toe aan het inlaatreservoir van het onderste kanaal.
      NOTITIE: Verwijder media uit de uitlaatreservoirs van beide kanalen zodra ze een capaciteit van 50-75% beginnen te bereiken.
    2. Breng de peulen terug naar de kweekmodule. Start de stroom opnieuw bij 30 μL/h en start de rek bij 2% rek en een frequentie van 0,2 Hz.
  8. Dag (4): Bewaken van de ontwikkeling van monolagen, meer rek en toevoegen van media
    1. Herhaal stap 2.6.1.1. en 2.6.1.2. Voeg 1 ml chipdifferentiatiemedia toe aan het inlaatreservoir van het bovenste kanaal en voeg 1 ml HIMEC-media toe aan het inlaatreservoir van het onderste kanaal.
      NOTITIE: Verwijder media uit de uitlaatreservoirs van beide kanalen zodra ze een capaciteit van 50-75% beginnen te bereiken.
    2. Breng de peulen terug naar de kweekmodule. Start de stroom opnieuw bij 30 μL/h en verhoog de rek tot 10% rek en een frequentie van 0,2 Hz.
  9. Dag (5) tot en met dag (7): Bewaken van de ontwikkeling van monolagen en toevoegen van media
    1. Herhaal stap 2.6.1.1. en 2.6.1.2. Voeg 1 ml chipdifferentiatiemedia toe aan het inlaatreservoir van het bovenste kanaal en voeg 1 ml HIMEC-media toe aan het inlaatreservoir van het onderste kanaal.
    2. Plaats de peulen terug in de kweekmodule en start de stroom en rek opnieuw. Zodra villusachtige assen zijn gevisualiseerd, gaat u verder met het NEC-on-a-chip-model.

3. NEC-op-een-chip-model

  1. Intestinale bacteriecultuur
    OPMERKING: Deze stap vereist een vooraf getitreerde ingevroren voorraad darmbacteriën van een patiënt met NEC die is voorbereid voordat dit protocol wordt gestart. Voor deze experimenten werd een eerder beschreven polymicrobiële darm van darmbacteriën van één patiënt met ernstige chirurgische NEC gebruikt38.
    1. Maak een 50% glycerolvoorraad van darmbacteriën en bewaar in een vriezer van -80 °C tot verder gebruik.
    2. Ontdooi een aliquot van de darmbacteriën en inoculeer 10 μL in 3 ml Luria-Bertani (LB) media. Incubeer bij 37 °C en schud gedurende een nacht bij 150 rpm.
    3. Was de kanalen op dezelfde dag voorzichtig met 100 μL voorverwarmde antibioticavrije chipdifferentiatiemedia (bovenste kanaal) of 100 μl voorverwarmde antibioticavrije HIMEC-media (onderste kanaal). Zuig het medium volledig op en herhaal het spoelen voor in totaal 3 wasbeurten.
    4. Na het aanzuigen van de derde wasbeurt, plaatst u de media in de kanalen terug en laat u deze op hun plaats.
    5. Spoel de inlaatreservoirs van het bovenste en onderste kanaal af met steriele D-PBS en vul ze vervolgens met 3 ml van de juiste antibioticavrije media. Primer pods en regel zoals in 2.5.2.
    6. Plaats de chip terug in de kweekmodule en start de rek en stroming opnieuw.
    7. Neem de volgende ochtend 1 ml van de nachtelijke bacteriecultuur en inoculeer deze in 25 ml verse LB-media.
    8. Breng deze nieuwe cultuur terug naar de schudder van 37 °C totdat de OD600 0,6 ± 0,02 bereikt, gemeten met een cuvet van 1 cm. Verdun de bacteriecultuur tot 7 x 108 kolonievormende eenheden/ml in antibioticavrije spaanexpansiemedia.
    9. Bewaar een aliquot van deze cultuur om de concentratie van het entmateriaal te bevestigen39. Het kan nodig zijn om de concentratie van de bacteriën aan te passen, afhankelijk van de reactie van het epitheel.
    10. Verwijder de media uit het epitheliale (bovenste) kanaal. Voeg 30 μL van de bacteriecultuur verdund in antibioticavrije chipexpansiemedia toe aan het bovenste kanaal van de chip. Wees zeer voorzichtig om kruisbesmetting van het HIMEC (endotheel) kanaal met bacteriën te voorkomen. Verwijder eventuele extra media van het oppervlak van de chip.
    11. Laat de chips 30 minuten onder statische omstandigheden staan om de bacteriële hechting aan de apicale zijde van het neonatale epitheel te vergemakkelijken. Spoel na de incubatie het bovenste kanaal met 100 μL antibioticavrij expansiemedium om niet-aangehechte bacteriën te verwijderen. Plaats de chips terug in de kweekmodule en start de rek en stroming opnieuw.
    12. Verwijder elke 24 uur de peulen uit de kweekmodule en spoel langzaam 100 μL antibioticavrije chipexpansiemedia door het epitheelkanaal. Dit helpt bij het voorkomen van bacteriële overgroei.

4. Intestinale permeabiliteitstest

OPMERKING: Dit kan bij elke stap tijdens het protocol worden uitgevoerd. Indien geïnitieerd wanneer chips worden gezaaid, kan de intestinale permeabiliteitstest worden gebruikt om de samenvloeiing van monolagen serieel te beoordelen. Indien geïnitieerd door de toevoeging van darmbacteriën, kan deze test worden gebruikt om de invloed van darmbacteriën op de integriteit van de darmepitheliale monolaag te bepalen.

  1. Verwijder media uit het inlaatreservoir voor het epitheliale (bovenste) kanaal. Voeg geschikte media met permeabiliteitskleurstof (50 μg/ml) toe aan het inlaatreservoir. Gebruik antibioticavrije chipdifferentiatiemedia voor het NEC-on-a-chip-model.
  2. Verzamel elke 24 uur het effluent uit de epitheel- en endotheelkanalen. Kwantificeer de concentratie van permeabiliteitskleurstof met behulp van een microplaatlezer volgens Lanik et al.36.

5. Immunohistochemie

  1. Was het onderste kanaal en het bovenste kanaal van de chip voorzichtig met 200 μL D-PBS. Zuig D-PBS volledig op uit de kanalen.
  2. Fixeer de cellen door beide kanalen te spoelen met 4% paraformaldehyde, zodat de oplossing in de kanalen achterblijft. Zuig overtollig materiaal van het spaanoppervlak op. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
  3. Was beide kanalen met 200 μL D-PBS. Laat D-PBS in het onderste kanaal zitten en verwijder het volledig uit het bovenste kanaal.
  4. Permeabiliseer de epitheellaag door het bovenste kanaal te spoelen met 100 μL 0,1% wasmiddeloplossing, zodat de oplossing in de kanalen blijft. Zuig overtollig materiaal van het spaanoppervlak op en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Was beide kanalen met 200 μL D-PBS. Laat D-PBS in het onderste kanaal zitten en verwijder het volledig uit het bovenste kanaal.
  6. Voeg 10% ezelinnenserum (of een geschikt blokkersmiddel) toe aan het bovenste kanaal gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was beide kanalen met 200 μL D-PBS. Laat D-PBS in het onderste kanaal zitten en verwijder het volledig uit het bovenste kanaal.
  7. Verdun primaire antilichamen in 5% ezelserum en voeg toe aan het bovenste kanaal van de chip (eerder geteste antilichamen en concentraties zijn beschikbaar in Lanik et al.36). Incubeer gedurende een nacht bij 4 °C.
  8. Was beide kanalen 3x met 200 μL D-PBS. Laat D-PBS in het onderste kanaal zitten en verwijder het volledig uit het bovenste kanaal.
  9. Verdunde fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen verdund 1:200 in 5% ezelserum in D-PBS en Hoechst 33342 of DAPI (nucleaire kleuringen). Voeg secundaire antilichamen toe aan het bovenste kanaal van de chip. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
  10. Was beide kanalen 3x met 200 μL D-PBS. Laat de kanalen na de laatste wasbeurt gevuld met D-PBS. Plaats de chip in een beeldvormende schaal met D-PBS voor beeldacquisitie met behulp van confocale microscopie.
    OPMERKING: Vaste spanen, al dan niet gekleurd, kunnen maximaal 1 week bij 4 °C in PBS worden bewaard. Zorg ervoor dat kanalen tijdens deze periode niet opdrogen.

6. Isolatie van RNA, bereiding van cDNA en kwantitatieve real-time PCR

  1. Was het onderste kanaal en het bovenste kanaal van de chip voorzichtig met 200 μL D-PBS. Zuig D-PBS volledig op uit de kanalen.
  2. Haal totaal RNA uit de cellen met behulp van een RNA-extractiereagens volgens de instructies van de fabrikant. Om RNA alleen uit het epitheel te isoleren, alleen via het bovenste kanaal te infuseren.
  3. Kwantificeer de RNA-concentratie met behulp van een nanovolumespectrofotometer. Omgekeerd transcriberen van 1 μg totaal RNA. Voer kwantitatieve real-time PCR uit. Primers die eerder in dit model werden gebruikt, zijn beschikbaar in Lanik et al. 36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Enteroïden werden op het microfluïdische apparaat gezaaid (Figuur 1) en gekweekt zoals hierboven beschreven. De groei van de enteroïden in de hydrogel van de celkweekmatrix voorafgaand aan het zaaien en vervolgens de daaropvolgende expansie van de monolaag van de darmepitheelcellen na het zaaien, werd het apparaat gevolgd via helderveldmicroscopie (Figuur 2). Een confluente monolaag van darmepitheelcellen vormde zich en ontwikkelde zich vervolgens tot een volwassen 3D-villusachtige structuur (Figuur 2). Dit microfluïdische apparaat bezaaid met een enteroïde-afgeleid neonataal darmepitheel en HIMEC's staat bekend als het neonatale darm-op-een-chip-model36.

Het NEC-on-a-chip-model is ontwikkeld om de microbiële dysbiose te recapituleren die aanwezig is tijdens neonatale NEC. Dit model omvat de toevoeging van een dysbiotisch microbioom van een pasgeborene met ernstige NEC aan het neonatale darm-op-een-chip-model. Met de toevoeging van dit dysbiotische microbioom werd de expressie van een reeks pro-inflammatoire cytokines aanzienlijk verhoogd, waaronder tumornecrosefactor-alfa (TNFα; Figuur 3), interleukine (IL)-1 bèta (IL-1β)36 en IL-8 werden gedetecteerd 36. Deze toename van pro-inflammatoire cytokines weerspiegelt wat wordt waargenomen voor menselijke NEC36.

Figure 1
Figuur 1: Schematische weergave van enteroïdecultuur en het microfluïdica-platform. Crypten worden geïsoleerd uit een chirurgisch verwijderd stuk neonatale darm en ze worden gezaaid in hydrogel van de celkweekmatrix en gekweekt tot darmenteroïden. Enteroïden worden gedissocieerd en gezaaid in het bovenste kanaal van het microfluïdica-apparaat dat is gecoat met extracellulaire matrix (ECM). Endotheelcellen (HIMEC's) worden vervolgens toegevoegd aan het onderste kanaal. Figuur gemaakt met Biorender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Progressie van darmepitheelcellen gekweekt met behulp van het neonatale darm-op-een-chip-model. Beelden verkregen met behulp van helderveldmicroscopie tonen neonatale enteroïden op dag 0, een epitheelcelmonolaag in de chip op dag 3 en zichtbare villusachtige structuren op dag 7. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3. NEC-on-a-chip intestinale epitheelcel TNFα mRNA-expressie . Vergelijking van TNFα-mRNA-niveaus bij incubatie met alleen media (controle) of een dysbiotisch microbioom van een baby met NEC (NEC-on-a-chip) gedurende 24 uur of 72 uur. **** p < 0,0001 vs. controle 24 uur; ** p < 0,005 vs. controle 72 uur door Mann-Whitney U-test. n=9 voor controle 24 uur; n=10 voor NEC-op-een-chip 24 uur; n=6 voor controle 72 uur; n=5 voor NEC-op-een-chip 72 uur. De gegevens zijn gemiddeld ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1. Mediasamenstelling voor crypte-isolatie en enteroïdegroei. Zie Van Dussen et al.40 en Miyoshi et al.41 voor gedetailleerde methoden die de bereiding van L-WRN geconditioneerde media beschrijven. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2. Mediacompositie voor het NEC-on-a-chip-model. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit NEC-on-a-chip-systeem is een krachtig nieuw hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de pathofysiologie van NEC te modelleren. Dit platform biedt een complexe micro-omgeving die meer lijkt op het in vivo darmmilieu dan eerdere modellen door een co-cultuursysteem op te nemen met continue luminale stroom en rek. Deze omstandigheden bevorderen de ontwikkeling van een 3D-villusachtige architectuur bekleed met een sterk gepolariseerd epitheel dat bestaat uit volwassen epitheliale subtypes en tight junctions (Figuur 2)36. Bovendien is het apicale epitheeloppervlak gemakkelijk toegankelijk voor blootstelling aan experimentele stimuli, zoals van patiënten afgeleide microbiota of nieuwe therapieën. Ten slotte kan dit model ook worden gebruikt om een verscheidenheid aan inflammatoire en niet-inflammatoire darmziekten te bestuderen, evenals mechanismen van normale darmepitheelontwikkeling, door gebruik te maken van enteroïden die zijn afgeleid van de relevante patiëntenpopulaties. Dit model maakt het mogelijk om de gegevensverzameling van een enkele patiëntsteekproef te maximaliseren, wat essentieel is gezien de beperkte beschikbaarheid en omvang van neonatale darmmonsters.

Met behulp van dit model werden veel van de fysiologische veranderingen in het darmepitheel waargenomen die optreden tijdens NEC bij zuigelingen. De toevoeging van het dysbiotische microbioom van een patiënt met ernstige NEC leidde tot de opregulatie van inflammatoire cytokines (Figuur 3), verhoogde darm-op-een-chip barrièrepermeabiliteit, verbeterde celdood, verminderde proliferatie en het verlies van volwassen epitheliale subtypes36. Toekomstige studies die dit model gebruiken, kunnen zich dus richten op het bepalen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van NEC en mogelijke therapeutische interventies.

Er zijn inherente beperkingen bij het implementeren van een complex model zoals NEC-on-a-chip. Dit systeem vereist gespecialiseerde apparatuur, reagentia en training om het microfluïdica-platform te gebruiken. Bovendien vereist het model veel aandacht voor detail, waarbij een nauwkeurige voorbereiding van de verschillende media, een goede seeding van de chip en het onderhoud van de steriele techniek van cruciaal belang zijn voor succes. Onderzoekers moeten ook toegang hebben tot darmmonsters of enteroïden van neonatale patiënten, die over het algemeen alleen beschikbaar zijn in quartaire zorgcentra met kinderchirurgen, tenzij verkregen via medewerkers. Ten slotte verhoogt de opname van aanvullende belangrijke componenten in de pathofysiologie van NEC, zoals immuuncellen of hypoxie, de moeilijkheidsgraad van dit model verder, hoewel het de fysiologische relevantie verhoogt.

Samenvattend is NEC-on-a-chip een belangrijke stap voorwaarts op het gebied van NEC-onderzoek dat de kwaliteit van mechanistische studies zal verbeteren en het testen van nieuwe therapieën voor NEC zal vergemakkelijken. Het uiteindelijke doel van dit onderzoek is het ontwerpen en testen van gerichte therapieën die de uitkomsten voor zuigelingen met darmontsteking en NEC verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben met betrekking tot dit manuscript.

Acknowledgments

Dit manuscript werd ondersteund door R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) en R01HD105301 (MG) van de National Institutes of Health, de Chan Zuckerberg Initiative Grant 2022-316749 (MG), een Thrasher Research Fund Early Career Award (LCF), een UNC Children's Development Early Career Investigator Grant (LCF) door de genereuze steun van donateurs aan de University of North Carolina in Chapel Hill, en de afdeling Kindergeneeskunde van de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
[Leu15]-Gastrin I human Sigma-Aldrich G9145
A 83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Gibco 12634010
B-27 Supplement, serum free (50x) Gibco 17504044
Basic Bio-kit Emulate N/A
BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader Agilent  7131000
BRAND Methacrylate (PMMA) Cuvettes, Semi-Micro BrandTech 759085D
Cell Recovery Solution Corning 354270
CFX Opus Real-Time PCR Systems Bio-Rad 12011319
Chip Cradle Emulate N/A
Chip-S1 Stretchable Chip Emulate N/A
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046
Clear TC-treated Multiple Well Plates,  48 well  Corning 3548
Collagen from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagenase, Type I, powder Gibco 17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit  Cell Biologics H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL Fisher Scientific 05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen  C10283
Countess II automated cell counter Invitrogen  AMQAX1000
DAPT Sigma-Aldrich D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionic, Lysine Fixable Invitrogen  D7132 Permeability dye 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Disposable PES Filter Units, 0.2um aPES membrane Fisher Scientific FB12566504
DMEM/F-12 Gibco 11320033
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium - high glucose Sigma-Aldrich D5796
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-136
EDTA, 0.5 M,  pH 8.0 Corning 46-034-CI
ER-1 surface activation reagent Emulate ER-1 Chip Activation Reagent 1
ER-2 surface activation reagent  Emulate ER-2 Chip Activation Reagent 2
Fibronectin Human Protein, Plasma Gibco 33016015
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid, 100mm Fisher Scientific FB0875713
Gelatin-Based Coating Solution  Cell Biologics 6950
Genie Temp-Shaker 300 Scientific Industries, Inc. SI-G300
Gentamicin  Gibco 15750060
HEPES, Liquid 1M Solution (238.3 mg/ mL) Corning 25-060-CI
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate  Invitrogen H3570
Human Collagen Type I Sigma-Aldrich CC050
Human Primary Small Intestinal Microvascular Endothelial Cells Cell Biologics H-6054
Inverted Microscope Fisher Scientific 03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths Fisher Scientific FSGPD10
L-Glutamine  Gibco 25030-081
Luria Broth (LB) agar, Miller Supelco L3027
L-WRN Cells  American Type Culture Collection CRL-3276
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, LDEV-free  Corning 356231 Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502048
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich 1009005
NAILSTAR UV LAMP NailStar NS-01-US
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific 840-274200
Nicotinamide Sigma-Aldrich 72340
Orb-HM1 Hub Module Emulate N/A
Paraformaldehyde ThermoFisher 047392.9L
Penicillin-Streptomycin  Gibco 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+ Rainin 17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8 Rainin 17014966
Pod Portable Module Emulate N/A
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS)(Heat Inactivated)  Avantor Seradigm 1500-500
QuantiTect Reverse Transcription Kit  QIAGEN 205313
Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) PeproTech 315-09
SB 431542 Tocris 1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated  Corning 431111
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725271
Steriflip-GV Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore SE1M179M6
Sterile Cell Strainers, 70um Fisher Scientific 22-363-548
Sterile Syringes, 10mL Fisher Scientific 14-955-453
Straight, fine, sharp point scissors Miltex Instruments MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD Centrifuge Thermo Scientific 75016052
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787 Detergent
TRIzol Reagent  Invitrogen 15596026 RNA extraction reagent
Trypan Blue Solution, 0.4% (w/v) in PBS, pH 7.5 ± 0.5 Corning 25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red  Gibco 12604013 Enzymatic Dissociation Reagent
Trypsin-EDTA solution Sigma-Aldrich T4174
VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L Thermo Scientific 13-998-252
Y-27632 Tocris 1254
Zoë-CM1 Culture Module Emulate N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344 (2020).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).
  3. Frazer, L. C., Good, M. Intestinal epithelium in early life. Mucosal Immunology. 15 (6), 1181-1187 (2022).
  4. Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. The British Journal of Nutrition. 116 (7), 1175-1187 (2016).
  5. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).
  6. Afrazi, A., et al. Toll-like receptor 4-mediated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces necrotizing enterocolitis. The Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9584-9599 (2014).
  7. Neal, M. D., et al. Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).
  8. Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).
  9. Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis. Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).
  10. Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protocol. 2 (4), 100951 (2021).
  12. Egan, C. E., et al. Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).
  13. Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).
  14. Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions. Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).
  15. Ericsson, A. C., Franklin, C. L. The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research. Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).
  16. De Fazio, L., et al. Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
  17. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  18. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
  19. Sato, T., Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).
  20. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  21. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 2871 (2018).
  22. Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
  23. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  24. Sung, J. H., Shuler, M. L. A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs. Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).
  25. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  26. Jang, K. J., et al. Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip. Science translational medicine. 11 (517), eaax5516 (2019).
  27. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature biomedical engineering. 1, 0069 (2017).
  28. Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
  29. Park, T. E., et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nature Communications. 10 (1), 2621 (2019).
  30. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).
  31. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip. Cell Death & Disease. 9 (2), 223 (2018).
  32. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  33. Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease. Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).
  34. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
  35. Xiang, Y., et al. Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro. Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318 (2020).
  36. Lanik, W. E., et al. Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip. JCI Insight. 8 (8), e146496 (2023).
  37. Emulate. Duodenum Intestine-Chip Protocol. , https://emulatebio.wpenginepowered.com/wp-content/uploads/2022/10/EP203-Rev-A-Duodenum-Intestine-Chip-Protocol.pdf (2022).
  38. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 . American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  39. JoVE Science Education Database. Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration. JoVE. , (2023).
  40. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
  41. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).

Tags

Microfluïdisch model Necrotiserende enterocolitis Menselijke neonatale darmenteroïden Dysbiotisch microbioom Complexe pathogenese Intestinale tight junctions Permeabiliteit van de darmbarrière Epitheelceldood Microbiële dysbiose Ontregelde ontsteking Diermodellen Cellijnen Intestinale organoïden In vitro model Microfluïdische technologie NEC-op-een-chip Premature pasgeborene Menselijke endotheelcellen Testen op ontdekking van geneesmiddelen
Microfluïdisch model van necrotiserende enterocolitis met menselijke neonatale darmenteroïden en een dysbiotisch microbioom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, … More

Frazer, L. C., Yamaguchi, Y., Jania, C. M., Lanik, W. E., Gong, Q., Singh, D. K., Mackay, S., Akopyants, N. S., Good, M. Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome. J. Vis. Exp. (197), e65605, doi:10.3791/65605 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter