Summary
本文详细介绍了在离体工作循环实验中使用来自实验室啮齿动物的“化身”肌肉模拟体内肌肉力产生的方法，以评估应变瞬态和激活对肌肉力反应的贡献。
Abstract
运动行为是动态系统的涌现特征，由肌肉力量的产生和工作输出产生。神经和机械系统之间的相互作用同时发生在生物组织的各个层面，从跑步时腿部肌肉特性的调整到四肢与地面相互作用的动力学。了解动物将其神经控制策略转向控制层次结构中的内在肌肉力学（“前反射”）的条件将使肌肉模型能够预测体内肌肉力量并更准确地工作。为了了解体内肌肉力学，需要对肌肉力量进行体外研究，并在类似于体内运动的动态变化应变和负荷条件下工作。体内应变轨迹通常表现出突然变化（即应变和速度瞬变），这些变化是由神经激活、肌肉骨骼运动学和环境施加的载荷之间的相互作用引起的。我们的“化身”技术的主要目标是研究肌肉在应变率和负荷突然变化期间的功能，当内在机械性能对肌肉力量产生的贡献可能最高时。在“阿凡达”技术中，传统的工作循环方法被修改为使用测量的体内应变轨迹和动物在动态运动期间的肌电图（EMG）信号，以驱动离体肌肉通过多个拉伸缩短周期。这种方法类似于工作环技术，不同之处在于体内应变轨迹被适当缩放并施加在连接到伺服电机的离体小鼠肌肉上。该技术允许：（1） 模拟体内应变、激活、步幅频率和工作环模式;（2）改变这些模式以最准确地匹配体内力响应;（3）在受控组合中改变应变和/或活化的特定特征，以检验机理假设。
Introduction
移动的动物在复杂的环境中实现了令人印象深刻的耐力、速度和敏捷性运动壮举。与人类工程机器相比，动物运动尤其令人印象深刻——与动物相比，电流机器人、假肢和外骨骼的稳定性和敏捷性仍然很差。自然地形中的腿运动需要精确的控制和快速调整，以改变速度和机动环境特征，这些环境特征会充当意外扰动 1,2,3,4。然而，理解非稳态运动本质上是具有挑战性的，因为动力学取决于物理环境、肌肉骨骼力学和感觉运动控制之间的复杂相互作用 1,2。腿部运动需要通过快速多模式处理感觉信息以及四肢和关节的协调驱动来应对意外的扰动 1,5。最终，肌肉通过肌肉骨骼系统的内在机械特性以及神经控制产生力，从而使运动成为可能1,5,6,7。神经力学的一个悬而未决的问题是，这些因素如何相互作用以产生协调的运动，以响应意外的扰动。以下技术利用肌肉对变形的内在机械响应，在可控的离体实验中使用体内应变轨迹与“化身”肌肉进行。
肌肉工作环技术为理解周期性运动期间的内在肌肉力学提供了一个重要的框架 8,9,10。传统的工作循环技术使用体内实验期间测量的频率和激活模式 2,8,9,11 通过预定义的、通常是正弦的应变轨迹驱动肌肉。使用正弦长度轨迹可以真实地估计飞行12 和游泳2 期间的功和功率输出，在动物不会因与环境和肌肉骨骼运动学的相互作用而发生应变轨迹快速变化的条件下。然而，腿部运动期间的体内肌肉应变轨迹动态地产生于神经激活、肌肉骨骼运动学和环境施加的负荷之间的相互作用 5,7,13,14。需要一种更逼真的工作循环技术来模拟与体内肌肉-肌腱动力学相对应的负荷、应变轨迹和力的产生，并深入了解内在肌肉力学和神经控制如何相互作用以在面对扰动时产生协调的运动。
在这里，我们提出了一种在跑步机运动期间模拟体内肌肉力量的新方法，方法是在受控的离体实验中使用来自实验室啮齿动物的“化身”肌肉，使用代表体内时变负荷的体内应变轨迹。在受控的离体实验期间，使用来自目标肌肉的测量体内应变轨迹，对实验动物的肌肉进行测量，将模拟运动过程中所经历的负荷。在本文描述的实验中，在跑步机上行走、小跑和驰骋期间，体外小鼠趾长伸肌 （EDL） 肌肉被用作体内大鼠内侧腓肠肌 （MG） 肌肉的“化身”13。这种方法类似于工作环技术，不同之处在于体内应变轨迹被适当缩放并施加在连接到伺服电机的离体小鼠肌肉上。虽然与大鼠 MG 相比，小鼠 EDL 肌肉的大小、纤维类型和结构不同，但可以控制这些差异。“化身”技术允许人们：（1）模拟体内应变、激活、步幅频率和工作循环模式;（2）改变这些模式以最准确地匹配体内力响应;（3）在受控组合中改变应变和/或活化的特定特征，以检验机理假设。
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Protocol
所有动物研究均由北亚利桑那大学机构动物护理和使用委员会批准。本研究采用60-280日龄雄性和雌性野生型小鼠（品系B6C3Fe a/a-Ttnmdm/J）的趾长伸肌（EDL）。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表），并在北亚利桑那大学的一个殖民地建立。
1. 选择 体内 菌株轨迹并准备在 离体 工作环实验中使用
注意：在该协议中，直接提供给作者（Nicolai Konow，UMass Lowell，个人通信）的 体内 动态运动的先前测量值用于 离体 实验。原始数据是为 Wakeling 等人收集的 15.复制协议需要时间、长度或应变、肌电图/激活和力数据。
- 使用任何编程平台（补充编码文件 1 中提供的 MATLab 代码）将整个体内试验分割成单独的步骤。
- 绘制长度变化 与整个 体内 试验的时间。这用于可视化单个步幅（站姿对站姿）并评估步幅之间的变异性（图 1）。
- 计算整个试验的应变（长度 （L） /最佳长度 L0 时的最大等距力）。
- 从整个试验中选择一个代表所有步幅的步幅，并且该步幅的开始和结束长度相似。这可以通过绘制彼此顶部的长度来比较每个步幅来直观地完成。
- 选择具有代表性的步幅后，使用任何编程平台从整个试验中分割出应变、肌电图/激活和强制数据（有关 MATLab16 中使用的代码，请参阅补充编码文件 1）。
- 如果应变、肌电图/激活或力的采样频率不同，请插值数据点，以便所有数据点都以相同的频率采样。
注意：研究人员可以根据整个试验中每个采样点之间的时间间隔来确定捕获频率。如果以相同的频率捕获变量，则采样时间将相同。
- 计算分段步幅的频率。
- 通过确定分段步幅的持续时间（以秒为单位）并将 1（秒）除以持续时间（1/持续时间 = # 步数/秒）来计算频率。
- 手动确定在 离体 实验中必须获取多少个数据点才能匹配频率。
- 计算两步所需的时间。至少重复一次步幅以估计肌肉测量误差，这将是后续统计分析所必需的。
- 使用测量的 EMG 活动确定相对于应变输入的刺激阶段，以确定 体外 工作回路刺激的开始和持续时间。可以使用任何编程平台（有关本研究中使用的代码，请参阅 补充编码文件 1 ）。
- 查看与应变变化相同的 x 轴范围（时间）的 EMG 信号（图 1）。放大肌电信号以使其可见;这可以通过将 EMG 信号乘以任意数字、重新缩放应变和 EMG 以使其处于同一比例和/或将 EMG 信号添加到应变中来完成。
注：作者使用 MATLab 中的“rescale”功能将应变和 EMG 重新缩放为同一比例（参见 补充图 1）。 - 找出肌电图活动开始和停止的位置，如两个标准差17,18 的强度变化所示。
注意：根据动物和肌肉的不同，肌电图的发作可能与足部接触相对应，也可能与足部接触不对应（Monica Daley，加州大学欧文分校，个人交流）（见讨论部分）。 - 计算发生肌电图激活开始的应变周期（例如，40%）的百分比以及刺激将发生多长时间（例如，222 毫秒）。
注意：研究人员将需要考虑激发-收缩耦合 （ECC） 延迟，该延迟在体内运动和离体工作回路之间不同，并且可能因每种动物和肌肉而异（例如，大鼠 MG 的体内 ECC 为 24.5 毫秒，小鼠 EDL 的体内 ECC 为 ~5 毫秒）。
- 查看与应变变化相同的 x 轴范围（时间）的 EMG 信号（图 1）。放大肌电信号以使其可见;这可以通过将 EMG 信号乘以任意数字、重新缩放应变和 EMG 以使其处于同一比例和/或将 EMG 信号添加到应变中来完成。
- 为工作回路控制器程序准备具有代表性的应变输入。任何可以通过应变和刺激输入捕获力输出的程序都可以用于工作回路控制器程序（参见讨论部分）。
- 采取选定的步幅并插值到适当的点数，以在 体内 频率下捕获该步进两个周期（参见步骤1.2）。
- 在通过预定的长度偏移拉伸后，重新调整步幅以在“零应变”（例如，L 0 或 95% L0）开始和停止（参见步骤 3.3）。
- 如有必要，“缩放”选择步幅作为小鼠 EDL 中应变变化的输入（参见讨论部分）。要缩放，请选择一个长度偏移，该偏移可以拉伸小鼠 EDL 而不会损坏（例如，无论体内物种如何，我们通常将小鼠 EDL 拉伸 10% L0）。这可能需要根据初步结果进行更改（参见步骤 3.3）。
图1： 体内 整个试验随时间变化的长度。 长度（mm）与大鼠MG的时间的关系图。 步幅由圆圈划定，从最短长度到最短长度，被认为是单步幅。 请点击这里查看此图的较大版本.
2. 体外评估小鼠肌肉的最大等长力
- 设置设备和手术。
注意： 有关 离体 工作循环所需设备的说明，请参阅讨论部分。- 通过将氧管针阀插入水套组织浴中来制备组织器官浴（见材料表）。将氧气管连接到装有 95% 0 2-5% CO2 的气瓶。让 20 psi 充满水套组织浴。
- 通过将额外的氧气管从气体管线连接到手术区域附近装有Krebs-Henseleit溶液（步骤2.1.3）的结晶皿来准备手术区域。这将用于在手术期间和手术后保持肌肉充气和水分。
注意：如果一次从小鼠中取出多块肌肉，肌肉也可以储存在这种充气溶液中长达 4 小时。 - 制备1L含有（mmol l-1）：NaCl（118）;氯化钾（4.75）;硫酸镁4 （1.18）;KH2PO4 （1.18）;氯化钙 2 （2.54）;和葡萄糖 （10.0） 在室温和 pH 值下使用 HCl 和 NaOH 至 7.4（参见材料表）。处理 HCl 和 NaOH 时，请佩戴适当的护目镜和手套等个人防护装备。
- 在室温和pH 7.4下用Krebs-Henseleit溶液填充浴液。将肌肉和钩子完全浸入溶液中。
- 打开所有设备;双模肌肉杠杆系统、刺激器和信号接口（DAQ板）（见 材料表）。
- EDL肌肉夹层。
- 对小鼠进行深度麻醉，然后通过颈椎脱位进行安乐死。将鼠标置于右侧或左侧侧卧位，顶部后肢伸展，脚趾接触解剖板。去除从脚踝到膝关节上方的毛发。
- 用镊子包住皮肤，从踝关节切到臀部区域。一旦肌肉暴露出来，像裤子的“下摆”一样在脚踝周围剪开。将皮肤向上拉，以更清楚地暴露腿部肌肉。
- 找到分隔胫骨前肌 （TA） 和腓肠肌的筋膜线，使用解剖剪刀分开以暴露膝肌腱。将解剖剪刀放在两个裸露的膝关节肌腱之间。剪刀会“抓住”在裸露的膝盖肌腱下方的口袋上。钝性地解剖一个“口袋”，同时将剪刀从腿上拉开，直到剪刀到达脚踝以暴露 EDL。
- 使用 4-0 号真丝手术缝合线的预绑环结（见 材料表），将缝合线的一端系在最靠近膝盖的肌腱下方。在近端肌肉-肌腱交界处上方打一个双方结，不要将其放在肌肉上或包括肌腱。在结上方切开。轻轻拉动绑在肌腱上的环，EDL就会从“口袋”中出来。
- 将环粘在解剖区域以在 EDL 中产生张力。在远端肌肉-肌腱交界处使用另一个预先打好的环结打一个双方形结，不要将其放在肌肉上或包括肌腱。在靠近腿的一侧剪掉结，以从鼠标上取下整个 EDL。将多余的缝合线从肌肉近端和远端的双方形结上切开，并将肌肉置于手术区域旁的充气浴中。
注意： 如果将肌肉置于充气浴中，请确保注意哪一侧是近端和/或远端。 - 要放置在伺服电机杠杆钻机上，请将 EDL 垂直连接到悬挂的铂电极之间。将远端环结连接到固定钩上，并将近端环结连接到伺服电机臂上的钩子上。抬起组织浴，将肌肉浸没在充气的Krebs-Henseleit溶液中。
注意： 浸没时，曝气不应干扰肌肉。如果是这样，请降低气体压力。在开始刺激之前，让肌肉平衡 10 分钟。
- 测量 EDL 肌肉的最大等长力。
注意： 有关如何使用抽搐和破伤风测量最大等长力的协议，请参阅 表 1 。有关作者使用的程序的说明，请参见 补充图 1 。- 用超最大抽搐刺激肌肉，以确保肌肉在手术过程中没有受损（80 V，1 pps，1ms; 表1;见 补充图2）。如果没有发生损伤，请使用肌肉杠杆系统上的长度旋钮通过抽搐刺激找到肌肉长度，此时主动张力为 ~1V / 0.1271 N，被动张力小于 ~0.1V / 0.01271N。
- 记录肌肉从缝合结到缝合结的起始长度，单位为伏特和毫米。将测量值输入程序的校准部分，以获得起始长度（参见 补充图1）。
- 在 EDL 的最佳长度 （L0） 处找到超最大抽搐最大等长力（表 1）。从技术上讲，不需要休息时间，但在刺激之间等待 1 分钟将稳定被动紧张。记录超最大抽搐最大幅度的长度（以伏特为单位）。这是抽搐的最佳肌肉长度 （L0）。
- 用卡尺测量这个长度的肌肉。测量从缝合结到缝合结的肌肉。一旦找到 L 0，将肌肉缩短回起始长度（主动张力 ~1V / 0.1271 N）。
- 求 EDL 的超最大破伤风最大等长力 （80 V， 180 pps， 500 ms; 表1）。记录 L0 处超最大破伤风力的长度（以伏特和毫米为单位），并用卡尺再次测量从缝合结到缝合结的纤维。
注意： 以 0.5 V/0.65 mm 的步长增加肌肉长度将导致抽搐和破伤风的 L0 更准确。 - 求出 EDL 的次最大等距力 （45 V， 110 pps， 500ms; 表1）在实验前后在L0 处，以确保刺激方案不会发生疲劳。力量减少 10% 被认为是“疲劳”肌肉。
| 实验 | 模拟强度 （V） | 脉冲频率 （pps / Hz） | 刺激持续时间 （ms） | 评论 | ||||||||
| 1.“热身” | 80 | 1 | 1 | 增加或减少 0.50 V 的长度，以找到 1 V 的被动张力 | ||||||||
| 2. 最佳肌肉长度抽搐 （L0） | 80 | 1 | 1 | 将长度增加或减少 0.50 V 以找到 ~1 V 的被动张力 | ||||||||
| 3. 最佳肌肉长度破伤风 （L0） | 80 | 180 | 500 | 在将长度改变 0.50 V 之间休息 3 分钟 | ||||||||
| 4. 实验前次极值 L0 | 45 | 110 | 500 | 长度为 L0 | ||||||||
| 6. 阿凡达实验 | 45 | 110 | 周期性地使用小鼠 EDL 的代表性长度变化 | |||||||||
| 7. 实验后次极值 L0 | 45 | 110 | 500 | 实验后返回 L0 并测量 L0 | ||||||||
表1：刺激方案。 用于寻找超最大和次最大抽搐和破伤风最佳长度的刺激方案。方案因刺激强度、时间和每秒脉冲数而异。
3. 使用选定的 体内 应变轨迹完成“化身”工作循环技术
- 设置完成“化身”工作循环技术所需的软件（参见 材料表）。
注意：需要指定每个时间步长的肌肉长度的输入文件（.csv或类似文件）（参见步骤 1.4）。刺激开始的周期百分比和刺激持续时间的输入是必要的（例如，参见 补充图 3 ）。 - 完整的“头像”工作循环技术。
注意：虽然我们使用自定义LabView程序，但研究人员可以使用任何程序，允许控制伺服电机杆上小鼠EDL的长度变化，控制指定时间刺激的开始（%周期）和持续时间（ms），以及测量肌肉力量。有关程序作者使用的说明，请参阅 补充图 3 。- 从步骤 1.4 中将具有缩放长度偏移的缩放应变变化上传到程序中。有关“缩放应变变化”的更多信息，请参阅步骤 1.4、3.3 和讨论部分。
- 如果需要，调整肌肉的起始长度（见第 3.3 节）。输入以 V 和 mm 为单位的起始长度以校准结果（参见 补充图 3）。
- 使用在步骤 1.3 中计算的刺激开始和持续时间。
- 通过确定的长度偏移通过缩放的长度变化来运行肌肉两个周期。
- 保存数据。如果在同一块肌肉上收集了多个刺激方案，则在每次刺激之间等待 3 分钟。
- 使用次最大激活以最佳长度 （L0） 刺激以确定是否发生了疲劳。如果力量下降超过 10%，则认为肌肉疲劳。刺激方案见 表1 。
- 从浴缸中取出肌肉。从肌肉上剪下环状结，然后从肌肉上轻拍多余的溶液。称量肌肉。使用标准公式确定生理横截面积：肌肉质量/（L0*1.06）19。
- 调整“头像”工作循环技术的参数（参见讨论部分）。
- 通过将 离体 被动张力上升与 体内 观察到的被动张力上升相匹配来确定起始长度和长度偏移（图2）。
注：本研究使用百分比 L 0 来缩放起始长度 （mm） 和偏移 （% L0;参见步骤 1.4 和讨论部分）。为了将离体小鼠EDL的张力上升与体内大鼠MG的张力上升相匹配，作者发现L0处的起始长度产生了最佳拟合（图2）。 - 选择三种起始长度（例如，-5% L 0、L 0 和 +5% L0）。在每个起始长度处执行“头像”工作循环，并具有指定的长度偏移（例如，10% L0）。
注：在本使用小鼠EDL的“头像”实验中，使用了10%L0 的长度偏移。 - 以新的起始长度和/或偏移重复，直到 离体 被动张力上升的速率与 体内 被动张力上升的速率相似（见 图2B）。
- 根据所用肌肉的纤维类型和激活动力学，增加或减少刺激的持续时间，以优化 体外 力和 体内 力之间的匹配。因此，在“化身”实验期间，可能需要改变刺激的开始和/或持续时间，以最好地匹配 体内 力的产生。
- 为了确定这是否有必要（参见讨论部分），绘制“化身”和 体内 肌肉随时间变化的力（图3），并通过对目标和“化身”肌肉力之间的比例相关性进行平方来计算决定系数R2 （见代表性结果）。
- 通过将 离体 被动张力上升与 体内 观察到的被动张力上升相匹配来确定起始长度和长度偏移（图2）。
图 2：匹配的被动张力上升。 工作循环显示 体内 和 体外 被动张力上升（箭头）。来自大鼠MG（黑色）以2.9 Hz行走的 体内 缩放工作回路（数据来自Wakeling等人15）。小鼠 EDL（绿色）在 2.9 Hz 下的 离体 缩放工作循环。 （A） 小鼠 EDL 肌肉的起始长度为 +5% L0。（B）小鼠EDL肌肉的起始长度为L0。请注意，体外被动张力上升与A的体内张力上升相匹配，但B的 体内 张力上升不匹配。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：优化小鼠EDL的刺激持续时间以匹配大鼠MG的 体内 力（黑线）。 使用基于EMG的刺激（绿色虚线）的小鼠EDL产生的力比 体内 力更早地降低，这可能是由于与大鼠MG相比，小鼠EDL的失活速度更快。为了优化 体内 力和 离体 力之间的拟合，对小鼠EDL进行更长时间的刺激（绿色实线）。基于肌电图的刺激 R2 = 0.55，优化刺激 R2 = 0.91。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Representative Results
“化身”实验的目标是在离体工作循环实验中尽可能接近地复制体内力的产生和工作输出。本研究选择使用小鼠 EDL 作为大鼠 MG 的“化身”，因为小鼠 EDL 和大鼠 MG 都主要由快速抽搐肌肉组成20,21。两块肌肉都是踝关节的主要推动者（EDL 踝背屈肌、MG 踝跖屈肌），具有相似的分叉角度（小鼠 EDL 12.4 + 2.12°22，本研究中使用的大鼠 MG 20°15）。使用两种不同的刺激方案（一种来自测量的肌电图活性，另一种优化如步骤3.3）将大鼠MG15的比例代表性工作回路与离体“化身”实验（图4）进行比较。这里给出的 R 2 值是使用整个缩放的拉伸缩短周期（2 个周期/条件）计算的，每个周期有超过 2000 个点对应于运动速度（步行 = 5521 点，小跑 = 5002，疾驰 = 2502 点）。对工作环进行缩放，以考虑肌肉大小、P0 和 PCSA 的差异。通过线性映射力和应变到相似的尺度（0-1）上来比较大鼠MG和小鼠EDL来完成缩放。从视觉上看，很明显，与基于EMG的激活相比，优化刺激方案（图4B）以考虑小鼠EDL和大鼠MG肌肉的不同激活动力学可以改善对体内大鼠MG力的拟合（参见讨论部分）。对于小鼠EDL，较慢的应变轨迹（步行和小跑）的刺激持续时间大约增加一倍，步行时R2增加了62%，小跑时增加了109%。对于更快的应变轨迹（奔腾），将刺激时间增加观测时间的一半，R2 增加 22%。
图4：体内和体外工作循环的比较。 体内大鼠MG（黑色）和离体小鼠EDL（绿色）在行走（2.9Hz）期间使用体内菌株轨迹的工作循环。较粗的线表示体内和离体工作回路中的刺激。（A）使用基于EMG的刺激方案在行走过程中体内大鼠MG（黑色）和离体小鼠EDL（绿色虚线）的工作回路。（B） 使用优化刺激在行走 （2.9Hz） 期间体内大鼠 MG（黑色）和离体小鼠 EDL（绿色常亮）的工作回路。请点击这里查看此图的较大版本.
小鼠 EDL 体外力产生和大鼠内侧腓肠肌 （MG）15 体内力产生之间的高 R2 表明复制良好（图 5）。在基于肌电图的刺激实验中，步行、小跑和疾驰的平均 R2 值分别为 0.535、0.428 和 0.77。在优化的刺激实验中，步行、小跑和疾驰的平均R2值分别为0.872、0.895和0.936。如前所述（步骤3.3，图5），根据所用肌肉的激活动力学，可能还需要优化刺激方案。通过优化刺激、增加 R2（图 5A、B）和降低均方根误差 （RMSE），在所有运动速度下，使用离体小鼠 EDL 预测体内 MG 力。优化后，所有速度的RMSE均值均有所下降（图6）。基于肌电图的刺激的平均 RMSE 分别为 0.31、0.43 和 0.158，用于步行、小跑和疾驰。优化刺激的平均 RMSE 分别为 0.181、0.116、0.101，用于步行、小跑和疾驰。
图 5：R 2 体内和离体力产生的值：用于体内和离体力比较的 R2 值的箱形和晶须图。 绘制了个人观察结果，表示中位数、第 25个和第 75个百分位数。（A） R2 值，用于使用基于刺激方案的体内 EMG 信号在 2.9 Hz（绿色）行走、3.2 Hz（洋红色）小跑和 6.2 Hz（青色）驰骋期间测量的体内和离体力产生。（B） 使用优化刺激产生体内和离体力的 R 2 值（见图 2）。优化刺激的开始和持续时间增加了所有步态的 R2。基于肌电图的刺激：步行 R2 = 0.50-0.55，小跑 R 2 = 0.37-0.47，奔马速度 R2 = 0.62-0.90;优化刺激：步行 R2 = 0.74-0.93，小跑 R 2 = 0.85-0.92，奔马 R2 = 0.87-0.97。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6： 体内 和 体外 力产生的均方根误差 （RMSE）。 用于 体内 和 离体 力比较的 RMSE 值的箱形和晶须图。绘制了个人观察结果，表示中位数、第 25个和第 75个 百分位数。（A） 使用基于 EMG 的刺激方案进行 体内 和 体外 力产生的 RMSE 值。（B） 使用优化刺激方案的 体内 和 体外 RMSE 值。优化刺激的开始和持续时间可降低所有步态的 RMSE。以 2.9 Hz（绿色）的速度行走，以 3.2 Hz（洋红色）的速度小跑，以 6.4 Hz（青色）的速度疾驰。 请点击这里查看此图的较大版本.
为了测试传统工作环方法在预测 体内 肌肉力量方面的性能，还对小鼠 EDL 进行了正弦工作环，其频率、长度偏移、起始长度、刺激开始和持续时间与使用 体内 大鼠 MG 应变轨迹的“化身”实验相同。R2 值明显低于基于 EMG 和优化刺激方案的 体内 应变轨迹（图 7）。使用正弦长度轨迹进行基于肌电图的刺激在步行、小跑和疾驰频率下的平均 R2 值分别为 0.062、0.067 和 0.141。在步行、小跑和疾驰频率下，使用正弦长度轨迹优化刺激的平均 R2 值分别为 0.09、0.067 和 0.141。
图 7：R2 使用正弦长度变化产生的体内和离体力值。 用于体内和离体力比较的 RMSE 值的箱形和晶须图。绘制了个人观察结果，表示中位数、第 25个和第 75个百分位数。步行（绿色，2.9 Hz）、小跑（洋红色，3.2 Hz）和疾驰（青色，6.2 Hz）的 R2 值，使用基于 EMG（半透明）和优化（不透明）刺激方案的正弦长度变化。对于基于EMG和优化的刺激，正弦长度变化的R2值低于体内长度变化的R 2值。基于肌电图的刺激：步行 R2 = 0.00 - 0.30，小跑 R 2 = 0.00 - 0.02，奔马率 R2 = 0.03 - 0.07;优化刺激：步行 R2 = 0.02 - 0.21，小跑 R 2 = 0.02 - 0.12，奔马速度 R2 = 0.12 - 0.17。 请点击这里查看此图的较大版本.
与体内应变轨迹相比，使用正弦长度轨迹的离体小鼠EDL肌肉产生的工作环不能准确模拟体内大鼠MG力（图8）。正弦与体内应变轨迹产生的功变化可以通过正弦轨迹中没有应变和速度瞬变来解释（图9）。虽然在正弦轨迹和基于体内的应变轨迹中，肌肉在收缩的主动缩短阶段以相似的长度受到刺激，但刺激的开始发生在周期的不同阶段（例如，基于小跑肌电图的刺激发生在 74% 的阶段，但基于步行肌电图的刺激发生在 43% 的阶段;参见讨论部分）。
图 8：比较 体内 和 体外 正弦工作环路。 （A） 使用正弦应变轨迹和基于 EMG 的刺激来自大鼠 MG 的 体内 工作环（黑色）和来自小鼠 EDL 的 离体 工作环（虚线洋红色）。（B） 使用正弦应变轨迹和优化刺激，来自大鼠 MG 的 体内 工作环（黑色）和来自小鼠 EDL 的 离体 工作环（实心洋红色）。请注意，由于正弦轨迹中没有应变和速度瞬变，正弦功循环高估 了体内 功。基于肌电图的刺激 R2 = 0.0003，优化刺激 R2 = 0.084。 请点击这里查看此图的较大版本.
图9： 体内 菌株和 离体 正弦长度轨迹的比较。 步行（绿色）、小跑（洋红色）和疾驰（蓝色）时 体内 菌株和 体外 正弦长度轨迹的比较。实线是 体内 应变轨迹。虚线 离体 正弦长度轨迹。突出的部分是刺激。在步幅缩短阶段，刺激以相同的长度开始。指示应变和速度瞬变的箭头。与正弦波的偏差是来自肌肉外力的阻抗。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 1：用于在最佳长度处收集等距最大力的程序。 该程序用于确定超最大和次最大抽搐和强直性刺激期间的最佳长度。 请点击这里下载此文件。
补充图2：可行的抽搐反应。 鼠标 EDL 的抽搐响应。抽搐力迅速上升和下降，应达到~1 V的主动张力。 请点击这里下载此文件。
补充图3：用于收集工作循环数据的程序。 该程序用于控制 离体 工作回路中肌肉长度和刺激时间。 请点击这里下载此文件。
补充编码文件 1：用于分割和创建工作循环实验协议的 MATLab 代码。 MATLab 代码，用于将目标步数信息（长度、肌电图激活和力）分割为单独的步幅。代码包括将目标动物步骤缩放和插值为 离体 小鼠 EDL 可以拉伸的长度。此外，还包括用于平滑肌电图信号和比较激活的代码，以选择 离体 工作循环实验中刺激的开始和持续时间。 请点击这里下载此文件。
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Discussion
虽然生物体在景观中无缝移动，但肌肉所经历的潜在负荷和应变差异很大 1,6,23。在体内运动1,24 和“化身”实验中，肌肉在周期性、非稳定条件下受到次最大刺激。在这些条件下，等长力-长度和等渗力-速度关系不太适合预测肌肉力2.了解非定常应变（即瞬态）和载荷的影响对于预测体内运动过程中的力产生至关重要，因此是开发这些“化身”实验的主要理由2.“阿凡达”实验使我们能够在测量力输出的同时控制肌肉负荷和应变轨迹。“化身”技术研究了肌肉在体内条件下的力反应，没有神经控制和肌腱顺应性的混杂因素。为了进行“化身”实验，研究人员将需要一个程序，允许肌肉经历规定的长度变化，并能够以不同的起始长度和不同的持续时间进行刺激（有关作者使用的程序，请参见补充图3）。在进行实验之前，研究人员需要指定起始肌肉长度（mm），偏移长度（mm），刺激开始（周期持续时间的百分比）和刺激持续时间（ms）（参见步骤1.3-1.4以获得这些参数的值）。一般来说，通常希望选择代表试验中所有步幅的步幅（例如，以相似的长度开始和结束、达到相似的峰值力、具有平均肌电图活动等）。确定所选步幅的肌电图/激活和力数据是否代表同一试验中的其他步幅有助于以后的“调整”，这可以通过绘制整个试验的工作循环（力与长度）来完成使用目标动物的肌肉。在双足和四足运动期间，最短长度到最短长度通常划分整个步幅（脚趾到脚趾），但肌电图激活可能会有所不同。在一些动物和肌肉中，肌电图激活与足部接触密切相关，例如此处所示的大鼠MG22。在其他动物中，例如珍珠鸡外侧腓肠肌，肌电图激活通常发生在最长的长度，以便在未知地形25期间获得更多的稳定性。
为了进行“化身”实验，重要的是要将 离体 力数据中的噪声降至最低。力测量对几个问题很敏感，包括但不限于手术过程中肌肉撕裂、如果环结太长，缝合线的顺应性、长度输入和偏移的不当缩放以及肌肉疲劳。肌肉撕裂通常发生在“解剖口袋”（步骤 2.2.3）并将环结系在肌腱近端部分（步骤 2.2.4）时。在“解剖口袋”时，保持解剖剪刀平整并水平于肌肉，可以防止尖端划伤 EDL。此外，在钝性解剖时将解剖剪刀拉开并向远端拉动也会限制解剖剪刀与 EDL 肌肉之间的接触。此外，在手术准备期间和在钻机上使用时，应使用 Krebs-Henseliet 溶液保持肌肉湿润。
正确缩放长度输入更为复杂。如果起始长度和/或偏移没有正确缩放，肌肉被动和主动力量可能会受到影响。被动张力的离体上升应与被动张力的体内上升相匹配（见图1）。在以前的实验中观察到的一个缩放问题是，如果长度偏移（从长度到最长长度）太小或太大，被动和主动张力都会受到影响。从理论上讲，肌肉应该在其最佳长度 （L 0）26 附近达到峰值力，这就是为什么我们使用最佳长度 （L0） 在离体“化身”实验中缩放体内肌肉长度以准确复制体内力的产生。 肌肉之间的结构差异将在确定起始长度和长度偏移参数方面发挥作用。尽管在超最大刺激的等渗和等长条件下发现了最佳长度 （L0），但在“化身”实验中将其用作缩放度量可能会突出周期运动期间力-长度和力-速度关系的局限性，这需要更多研究。在大多数稳态条件下，肌肉的瞬时长度、速度和激活（即力-长度和力-速度属性）可用于以合理的精度预测力和功输出 12,24,27。在具有可变载荷的动态条件下，力随速度28 的函数而增加，并且与应变和活化29,30 具有复杂的关系。这与肌肉的等渗力-速度和等长力-长度特性相矛盾28.在大鼠MG中，应变和速度瞬变是载荷的证据，例如脚接触或与环境的相互作用（即崎岖的地形，风，避免捕食的方向突然改变）（图9）。与大多数现实条件一样，这些大鼠 MG 应变轨迹在施加的载荷、力产生和功输出 2,28 方面具有突然的变化。该实验方法旨在突出体内条件下应变、速度和活化动力学之间的这些复杂相互作用，而传统的力-长度和力-速度关系无法很好地解释这些相互作用。
当肌肉起始长度太短或太长时，可能会出现其他问题。太短的起始长度将导致被动和主动拉伸期间张力的上升速度降低（未显示），而太长的起始长度将导致被动张力的上升速度增加（见 图1B）。使用主动张力和被动张力的比率可能会有所帮助。例如，在大鼠MG中，被动张力（N）通常约为主动张力的一半（图2）。如果肌肉的起始长度过长和/或拉伸到长度过长，则相对于主动张力，被动张力可能过高（见 图1B），并且由于过度拉伸，力量可能会迅速下降。此外，拉伸到太长的长度可能会损害肌肉，并可能导致肌肉更快地疲劳。此外，如果起始长度太短和/或肌肉没有拉伸到足够长的长度，主动紧张可能会出现未融合。
初步实验是必要的，以确定基于L0的起始长度和偏移。如果所用肌肉的激活动力学不同，则可能需要额外的初步实验来调整刺激的持续时间。这些优化是必要的，因为体内和体外肌肉的纤维类型组成和/或激活动力学可能不同。在我们的代表性结果（图4和图5）中，我们在离体实验期间对小鼠EDL使用了两种刺激方案，以复制体内大鼠MG力的产生。为了优化小鼠EDL中的力产生以最适合体内大鼠MG，增加了刺激持续时间（图2和图3）。大鼠MG由比小鼠EDL31,32,33慢的纤维类型组成。这在“阿凡达”实验中很明显，因为离体小鼠EDL肌肉在激发后产生力的速度更快，并且在失活后力的下降速度比在大鼠MG15中观察到的更快（图2），即使在考虑了体内和体外条件之间的激发-收缩延迟差异之后34。根据离体和体内目标肌肉的不同，在其他“化身”实验中也可能需要优化刺激。小鼠 EDL 或比目鱼肌 （SOL） 可用于这种离体工作环技术。由于肌肉纤维类型和结构的相似性，EDL被选为大鼠MG的“化身”。有些肌肉可能具有复杂的结构，不能使用实验室啮齿动物的肌肉作为“化身”来模拟。
虽然“化身”实验确实需要一些手动优化才能最好地复制体内力的产生，但该技术适用于各种不同的动物和运动模式。“化身”技术对于理解肌肉太大或无法进入离体实验的动物体内力产生特别有用。虽然只对较大的动物进行了初步工作35，但这项工作已经显示出这种技术在动物，肌肉和运动步态中的应用潜力，使用实验室小鼠作为“化身”。“化身”实验的有用性取决于方便、廉价、容易获得且特征明确的实验室啮齿动物模型（即小鼠 EDL）可用于理解不同脊椎动物物种不同肌肉的体内力学的准确性。这里（大鼠MG）和其他地方（珍珠鸡LG19）的初步“化身”实验结果表明，该技术可用于准确预测体内力，并可应用于其他动物。这种方法的未来应用应该扩大在离体和体外实验中被用作靶标和“化身”的肌肉和动物的类型。“阿凡达”实验使我们能够检查当肌肉负荷和应变突然变化时，在体内运动过程中影响肌肉力量和工作输出的因素 1,2,19。具体来说，“化身”方法使我们能够检查应变和速度瞬变对肌肉力量的影响，这是传统肌肉模型或正弦工作循环实验无法捕捉到的。
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Disclosures
所有作者都承认不存在利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢 Nicolai Konow 博士提供本研究中使用的数据。由 NSF IOS-2016049 和 NSF DBI-2021832 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Braided Non-Absorbable Silk Suture 4-0 | Mersilk | 734H | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 1086436 | Krebs-Henseleit solution |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | Krebs-Henseleit solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | PHR1428 | Krebs-Henseleit solution |
| Hydorchloric Acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 1.37055 | Krebs-Henseleit solution |
| LabView Data Collection | Lab-View | ||
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | Krebs-Henseleit solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | Krebs-Henseleit solution |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 5.43841 | Krebs-Henseleit solution |
| S88 Stimulator | Grass | M643H05 | Available for purchase on Ebay |
| Series 300B Lever System | Aurora | 1200A | includes water-jacket tissue bath |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Krebs-Henseleit solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Krebs-Henseleit solution |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | Krebs-Henseleit solution |
| Wild Type Mice | Jackson Laboratory | B6C3Fe a/a Ttn mdm/J |
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