Summary
Undersøgelsen beskriver en enkel, hurtig og delvist automatiseret protokol til isolering af kerner af høj kvalitet fra frosne pattedyrvæv til nedstrøms RNA-sekventering af enkeltkerner.
Abstract
Enkeltcelle- og enkeltkerne-RNA-sekventering er blevet almindelige laboratorieapplikationer på grund af det væld af transkriptomisk information, de giver. Enkeltkerne RNA-sekventering er især nyttig til undersøgelse af genekspression i vanskeligt dissocierede væv. Desuden er denne tilgang også kompatibel med frosset (arkiveret) materiale. Her beskriver vi en protokol til isolering af enkeltkerner af høj kvalitet fra frosne pattedyrvæv til nedstrøms enkeltkerne-RNA-sekventering på en delvist automatiseret måde ved hjælp af kommercielt tilgængelige instrumenter og reagenser. Specifikt bruges en robotdissociator til at automatisere og standardisere vævshomogenisering efterfulgt af en optimeret kemisk gradient til filtrering af kernerne. Endelig tæller vi kernerne nøjagtigt og automatisk ved hjælp af en automatiseret fluorescerende celletæller. Udførelsen af denne protokol er demonstreret på musehjerne, rottenyre og cynomolgus lever og miltvæv. Denne protokol er ligetil, hurtig og let at tilpasse til forskellige pattedyrvæv uden at kræve omfattende optimering og giver kerner af god kvalitet til nedstrøms RNA-sekventering med enkelte kerner.
Introduction
Enkeltcelle (sc) og enkeltkerne (sn) RNA-sekventering er blevet almindeligt anvendte protokoller inden for molekylær og cellulær biologi på grund af den øgede opløsning af genekspression sammenlignet med bulk RNA-sekventering. Imidlertid er isolering af enkeltcelle- og enkeltkernepræparater af god kvalitet fra fast væv fortsat en udfordring og er ofte det hastighedsbegrænsende trin i sc / sn-RNAseq-eksperimenter. Faktisk er der udviklet en overflod af protokoller, der bruger forskellige kemiske og mekaniske procedurer til at opnå celle / kerner suspensioner 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Desuden spænder strategier til at rense sådanne præparater fra snavs / klumper osv. Fra flowsortering til filtrering til vask. Sådanne protokoller er ofte manuelle (hvilket fører til brugerrelateret variabilitet), kan være tidskrævende (hvilket fører til reduceret celle-/kernelevedygtighed) og/eller kan kræve adgang til et flowcytometer til celle/kerne-sortering. Denne undersøgelse fokuserede på at udvikle en enkel, hurtig og delvist automatiseret enkeltkerneisoleringsprotokol fra frosne pattedyrvæv til nedstrøms RNA-sekventeringsapplikationer. Vi fokuserede specifikt på kerneisolering i modsætning til celleisolering, da det er kompatibelt med brugen af frosset væv, hvilket gør prøveindsamling/-behandling mere praktisk og muliggør upartisk batching af prøver, især i tidsforløbseksperimenter. Selvom det nukleare transkriptom ikke fuldt ud afspejler det cellulære transkriptom, har flere undersøgelser nu vist, at enkeltkerner RNA-sekventeringsdata er sammenlignelige med enkeltcelle RNA-sekventeringsdata til celletypeidentifikation, selvom proportionerne af celletyper kan variere 6,16,17,18,19.
Kerneisolering består af flere trin: 1) mekanisk eller kemisk forstyrrelse af vævet for at frigive kernerne, 2) oprydning af snavs og klumper og 3) nøjagtig tælling af kerner til forberedelse til downstream-applikationer. I en række protokoller involverer trin 1 ofte brugen af en Dounce-homogenisator for at forstyrre vævet 3,20. Alternativt kan kemiske metoder anvendes, selvom disse ofte skal optimeres til forskellige væv 2,5,6. Vi har erfaret, at en manuel vævsforstyrrelsesprocedure er tilbøjelig til operatørassocieret variabilitet, hvilket fører til variabel kvalitet og udbytte af kerner. For at minimere teknisk variabilitet og for at få en mere konsistent og reproducerbar protokol, der fungerer på tværs af væv, blev der udviklet en protokol, der bruger en kommercielt tilgængelig robotvævsdissociator21. For trin 2, selvom bufferudveksling normalt er det enkleste middel til vask af kerner, vedtog vi brugen af et relativt kort centrifugeringstrin med saccharosegradient for at få en mere grundig fjernelse af snavs. Specifikt til hjernevæv bruger vi en silicakolloidgradient i stedet for en saccharosegradient for mere effektiv myelinfjernelse. Endelig er brugen af et hæmocytometer til tælling guldstandarden til tælling og visuel inspektion af kernerne. I vores protokol kan dette trin pålideligt automatiseres ved hjælp af en kommercielt tilgængelig automatiseret fluorescerende celletæller22. Denne protokol er blevet testet og er kompatibel med flere frosne pattedyrvæv, herunder hjerne, nyre, milt og lever, fra forskellige pattedyrarter (rotte, mus og ikke-menneskelig primat) og giver kerner af god kvalitet til nedstrøms RNA-sekventering med enkelte kerner med en dråbebaseret kommerciel platform. Protokollen tager ca. 75 minutter fra vævsforberedelse til starten af RNA-sekventeringsarbejdsgangen med enkelte kerner.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført med godkendelse fra den kantonale veterinærmyndighed i Basel-Stadt i nøje overensstemmelse med de schweiziske føderale regler om dyrebeskyttelse eller med godkendelse fra Institutional Animal Care and Use Committee i overensstemmelse med den tyske dyrevelfærdslov.
1. Fremstilling af væv og reagens/instrumenter
- Rengøring og instrumentklargøring
- Rengør bordplader og pincetter med 70% ethanol og RNase-dekontamineringsopløsning. Centrifugerne forafkøles til 4 °C.
- Kernernes isolationspatroner forkøles i køleskab ved 4 °C i mindst 30 minutter.
- Start robotdissociatoren, og tænd for kølingen ved at indstille skyderen øverst til højre på skærmen til afkøling og ved at klikke på den for at starte afkøling, så skyderen vises orange. Kontroller, at den vedhæftede flaske med kerner til opbevaring af reagens (NSR) og flasken med kerneisolationsbuffer (NIB) har tilstrækkelig væske tilbage og er korrekt afkølet.
- Forbered en polystyrenskumkasse fyldt med tøris og forafkøl petriskåle og skalpelblade på tøris.
- Forberedelse af buffer
- Forbered 1,5 M saccharosepudeopløsningen (SCS) som vist i tabel 1. SCS fordeles i 500 μL alikvoter i 2 ml DNase/RNase-rør for at opnå fire 500 μL SCS-delprøver pr. prøve. Opbevar delprøverne på is indtil yderligere brug.
- I tilfælde af behandling af hjernevæv fremstilles i stedet en 18 % silicakolloidopløsning som beskrevet i tabel 2 ved at fortynde silicakolloidstamopløsningen i NSR og tilsætte RNase-hæmmer. Forbered 3 ml 18% silicakolloidopløsning pr. prøve og opbevar den på is.
2. Vævshomogenisering og kerneisolering
- Prøven tages ud af fryseren -80 °C og anbringes straks på tøris.
- Skær prøven på en forkølet petriskål eller metalplade på tøris med en forkølet skalpel i et 15-50 mg stykke (hvis det ikke allerede har den rigtige størrelse). Sørg for at skære prøven i den rigtige retning, så prøven stadig er repræsentativ for organstrukturerne af interesse.
BEMÆRK: Med denne protokol er 15-50 mg den optimale prøvestørrelse til nuklear ekstraktion. For at opnå et godt udbytte efter oprydningen anbefales en prøvestørrelse på mindst 25 mg. Til mindre prøver er der specielle patroner til rådighed, der er optimeret til behandling af små indgange med robotdissociatoren. Små inputkerner isolationspatroner blev anvendt til at dissociere vævsprøver, der vejer så lidt som 4 mg med tilstrækkeligt udbytte til nedstrøms RNA-sekventering med enkelte kerner. Et eksempel på kerneydelse ved hjælp af lavinputpatronen fra rottelevervæv er vist i tabel 3. - Tag kerneisolationspatronen ud af køleskabet, pak den ud, fjern kværnen, og pipette 15 μL RNasehæmmer (40 E/μL) pipetter til bunden af cylinderampullen.
BEMÆRK: Under kerneekstraktionen tilføjer robotdissociatoren NIB og NSR til patronen til et samlet volumen på 3 ml (med lavvolumenkerneekstraktionsprotokollen). Ved at tilsætte 15 μL RNase-hæmmer (40 E/μL) til cylinderampullen før ekstraktionen, vil suspensionen have den ønskede RNAse-hæmmerkoncentration på 0,2 E/μL. - Anbring vævsprøven i bunden af cylinderampullen med en pincet. Placer ikke prøven nøjagtigt i midten af cylinderampullen for at opnå optimal afbrydelseseffektivitet.
- Vælg Kør en protokol på instrumentet , og klik på indstillingen Nuclei i øverste venstre hjørne.
- Vælg Low Volume Nuclei Isolation-protokollen i menuen, og kontroller, at afbrydelseshastigheden er indstillet til hurtig ved at klikke på Rediger. Læg patronen på instrumentet ved at åbne døren og glide ud af scenen ved at løfte den røde knap.
- Indsæt patronen på det angivne sted, drej patronlåsen, og skub i scenen, indtil den røde knap klikker på plads. Luk lågen, og start kerneudtrækningen på instrumentet ved at klikke på Næste. Løbet varer ca. 7 min.
- Når løbet er færdigt, skal du fjerne patronen fra instrumentet ved at løfte den røde knap og trække scenen ud. Anbring straks patronen på is.
- For alle væv undtagen hjernen fortsættes til trin 3.1. For hjerneprøver, fortsæt direkte til trin 3.2.
3. Oprydning af kerner
- Oprydning af saccharosegradient
BEMÆRK: For hjernevæv skal du springe dette trin over og gå direkte til trin 3.2. Alle oprydningstrin udføres på is for at minimere RNA-nedbrydning. Buffere og rør samt centrifugerne skal forkøles. Alle resuspensions- og blandingstrin udføres kun ved omhyggelig pipettering, da hvirvelstrøm kan kompromittere kernernes kvalitet og integritet.- Gennembor forsigtigt den runde folie på dissociatorpatronen med en pipettespids.
BEMÆRK: Efter dissociation har den resulterende kernesuspension et omtrentligt volumen på 2 ml. For at lette rensningen af saccharosegradienten deles kernesuspensionen i to 900 μL alikvoter, hvilket resulterer i, at der anvendes et samlet volumen på 1,8 ml kernesuspension under rensningen. - Den første 900 μL delprøve af kernesuspensionen fjernes fra cylinderampullen, og den tilsættes til en 500 μL SCS-delprøve, der tidligere er fremstillet i et 2 ml glas. Bland godt ved pipettering, indtil blandingen er homogen.
- Fjern 1400 μL kernesuspension - SCS-blandingen, og læg den forsigtigt på en ny 500 μL SCS-prøve ved at holde røret i en vinkel og tilsætte blandingen dråbevis, hvilket skaber en klart synlig faseadskillelse (se figur 1A).
- Luk forsigtigt røret og læg det tilbage på is uden at forstyrre faseadskillelsen.
- Trin 3.1.2-3.1.4 gentages med den anden 900 μL delprøve suspension og en ny SCS-prøve for at få to 2 ml glas pr. prøve med en klart synlig faseadskillelse til gradientcentrifugering.
- Glassene tilsættes forsigtigt til en forkølet centrifuge og centrifugeres ved 13.000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
- I mellemtiden fremstilles den NSR, der er beskrevet i tabel 4, ved at tilsætte RNase-hæmmeren til en prøve NSR. Der fremstilles 1 ml NSR pr. prøve.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan enkeltcellegenekspressionsreagensgelperlerne fjernes fra -80 °C fryseren, så de kan ekvilibrere til stuetemperatur (RT), og skabelonafbryderen oligo kan resuspenderes i lav TE-buffer. - Efter centrifugering fjernes supernatanten fra begge glas uden at forstyrre pelleten, og pelletsen resuspenderes forsigtigt i 50 μL iskold NSR i henhold til producentens anbefaling. Saml de to pellets af den samme prøve i et nyt 1,5 ml rør og tilsæt 900 μL iskold NSR til et samlet volumen på 1 ml. Bland godt ved pipettering.
- Prøven centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C med en rotorcentrifuge med svingskovl.
BEMÆRK: Det anbefales stærkt at bruge en svingende skovlrotor for at minimere kernetab, især når kerneudbyttet forventes at være lavt, eller når man starter med små mængder væv. - I mellemtiden fremstilles 500 μL pr. prøve af 1x PBS (uden Ca2+ og Mg2+) med 0,04 % bovint serumalbumin (BSA) og 0,2 E/μL RNase-hæmmer som beskrevet i tabel 5.
- Supernatanten fjernes forsigtigt uden at kassere pelletsen, og pelletpen resuspenderes i 100 μl PBS-opløsning som beskrevet ovenfor (1x PBS + 0,04% BSA + RNase-hæmmer ved 0,2 E/μL).
BEMÆRK: For små vævsprøver kan kernekoncentrationen være lav, og det anbefales derfor at resuspendere pellet i kun 50 μL PBS-opløsning for at sikre tilstrækkeligt høje koncentrationer til RNA-sekventering med enkelte kerner. - Fortsæt direkte til trin 4.
- Gennembor forsigtigt den runde folie på dissociatorpatronen med en pipettespids.
- Oprydning af kolloidgradient i silica
BEMÆRK: For hjernevæv er en silicakolloidgradient mere egnet end en saccharosegradient til at fjerne myelin og snavs fra kernesuspensionen. Alle oprydningstrin udføres på is for at minimere RNA-nedbrydning. Buffere og rør samt centrifugerne skal forkøles. Alle resuspensions- og blandingstrin udføres kun ved omhyggelig pipettering, da hvirvelstrøm kan kompromittere kernernes kvalitet og integritet.- Gennembor forsigtigt den runde folie på dissociatorpatronen med en pipettespids.
- Fjern kernesuspensionen fra cylinderampullen, og tilsæt den til et 5 ml rør.
- Der centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C i en forkølet centrifuge.
- Supernatanten fjernes forsigtigt uden at forstyrre pelleten, og pelletsen resuspenderes i 1 ml iskold 18% silicakolloidopløsning.
- Tilsæt yderligere 2 ml 18% silicakolloidopløsning for at få et samlet volumen på 3 ml og bland godt ved pipettering.
- Prøven centrifugeres ved 700 x g i 5 minutter ved 4 °C i en rotor med svingskovlen slået fra.
- I mellemtiden fremstilles den NSR, der er beskrevet i tabel 4 , ved at tilsætte RNase-hæmmeren til en prøve NSR. Der fremstilles 1 ml NSR pr. prøve.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan enkeltcellegenekspressionsreagensgelperlerne fjernes fra -80 °C fryseren, så den kan ekvilibrere til RT, og skabelonafbryderoligo kan resuspenderes i lav TE-buffer. - Fjern forsigtigt prøven fra centrifugen uden at forstyrre myelinlaget, der flyder ovenpå.
- Fjern først myelinlaget fra toppen og kassér det; Derefter fjernes hele supernatanten forsigtigt uden at forstyrre pelletten.
BEMÆRK: Myelinlaget kan let fjernes ved at vikle en steril fnugfri serviet rundt om en 1 ml pipettespids for at aspirere myelinlaget sammen med 1-2 ml supernatant. - Resuspender pellet i 1 ml iskold NSR i henhold til producentens anbefaling.
- Prøven centrifugeres ved 500 x g i 5 minutter ved 4 °C i en centrifuge med en rotor med svingskovl.
BEMÆRK: Det anbefales stærkt at bruge en svingende skovlrotor for at minimere kernetab, især når kerneudbyttet forventes at være lavt, eller når man starter med små mængder væv. - I mellemtiden fremstilles 500 μL pr. prøve af 1x PBS (uden Ca2+ og Mg2+) med 0,04 % bovint serumalbumin (BSA) og 0,2 E/μL RNase-hæmmer som beskrevet i tabel 5.
- Supernatanten fjernes forsigtigt uden at forstyrre pellet, og prøven resuspenderes i 100 μl PBS-opløsning som beskrevet ovenfor (1x PBS + 0,04% BSA + RNase-hæmmer ved 0,2 E/μL).
BEMÆRK: For små vævsprøver kan kernekoncentrationen være lav, og det anbefales derfor at resuspendere pellet i kun 50 μL PBS-opløsning for at sikre tilstrækkeligt høje koncentrationer til RNA-sekventering med enkelte kerner.
4. Optælling
- For hver prøve, der skal tælles, fortyndes 10 μL nuclei suspension i 20 μL PBS-opløsning for at opnå en 1:3 fortynding.
- Til tælling tilsættes 25 μL propidiumiodid (PI) farvningsopløsning til et blandingshul på den fluorescerende tællertælleplade. Der tilsættes 25 μL af suspensionen af fortyndede kerner og blandes godt ved pipettering. Den farvede prøve på 50 μL overføres fra blandebrønden til påfyldningsbrønden.
- Læg tællepladen på celletælleren, og start optællingen.
BEMÆRK: Kimtallet tages fra den røde fluorescerende kanal med en eksponeringstid på 700 ms. Denne kanal blev optimeret til at få et nøjagtigt kimtal ved krydssammenligning med manuel tælling med et Neubauer-kammer og Trypan Blue-farvning under mikroskopet. Ved høje koncentrationer er kernerne meget tæt på hinanden, hvilket gør det vanskeligt for softwaren at adskille dem. I dette tilfælde anbefales det at genfortælle prøven i en passende fortynding. Kernernes integritet såvel som renligheden kan vurderes ud fra det lyse feltbillede eller under et mikroskop. - Prøverne fortyndes med PBS (1x PBS + 0,04% BSA + RNase-hæmmer ved 0,2 E / μL) til den ønskede koncentration til RNA-sekventering med enkelte kerner.
BEMÆRK: Koncentrationer mellem 700-1.200 kerner / μL betragtes som optimale til RNA-sekventering med enkelte kerner. Lavere cellekoncentrationer, såsom 700 kerner / μL, kan resultere i reduceret baggrundsforurening fra omgivende RNA.
5. Forberedelse af biblioteket
- Udfør RNA-sekventering med enkeltcellegenekspressionsreagenser ved hjælp af producentens protokol rettet mod en kernegenvinding på 8000-10.000 kerner pr. Prøve.
6. Sekvens af handlinger
- Sekvensér bibliotekerne med den ønskede sekventeringsdybde med parret ende, dobbelt indeksering, og følgende sekventering lyder: Læs 1: 28 cyklusser, i7 Indeks: 10 cyklusser, i5 Indeks: 10 cyklusser og Læs 2: 90 cyklusser.
Representative Results
Udførelsen og alsidigheden af denne protokol demonstreres ved at udføre RNA-sekventering med enkelte kerner på friskfrosset hjerneoccipitalt cortexvæv fra tre B6-mus, friskfrosset tværgående skåret nyrevæv fra tre Wistar-rotter, arkiv (11-årig) lever og miltvæv fra tre mauritiske Cynomolgus-makakaber. Alle dyr var ikke-perfuserede.
Som vist i figur 1B,C blev der opnået kerner af god kvalitet, der var fri for tegn på blomme, snavs og klumpning. Den saccharosegradientbaserede filtrering blev optimeret til at fjerne størstedelen af affald ved at teste forskellige tætheder, omdrejningshastigheder og tider og vurdere den nukleare renhed / integritet under et mikroskop samt vurdere kernestørrelsesfordeling og udbytte (figur 1D). Dette gjorde det muligt for os at vælge en saccharosegradienttæthed på 1,5 M og bruge en kort centrifugeringstid på 15 min. For yderligere at vurdere kernenes kvalitet blev dataene forbehandlet ved hjælp af 10X Cell Ranger, og yderligere downstream-dataanalyse blev udført ved hjælp af Besca23. Kerner med >5% procent mitokondrieindhold (da disse har tendens til at være beskadigede / stressede kerner) blev filtreret ud, og kerner med 500-7.000 gener (for at minimere tomme dråber og multipleter) blev bevaret. Vi inkluderede kun gener, der var til stede i mindst 30 kerner. Vi målrettede 8.000 kerner pr. hjernebarkprøve og 10.000 kerner pr. nyre-, lever- og miltprøve. Efter filtrering blev der opnået 10.644 kerner af høj kvalitet fra de tre hjerneprøver, 14.960 kerner af høj kvalitet fra de tre nyreprøver, 18.795 kerner af høj kvalitet fra de tre leverprøver og 13.882 kerner af høj kvalitet fra de tre miltprøver. Figur 2A, D, G, J viser violinplot, der repræsenterer fordelingen af UMI-tal, gentællinger og mitokondrieindhold i hver prøve. Det mediane antal tællinger på tværs af alle hjerneprøver var 7.563 UMI/kerne og 3.208 gener/kerne. Det mediane antal tællinger på tværs af alle nyreprøver var 3.841 UMI/kerne og 1.915 gener/kerne. Det mediane antal tællinger på tværs af alle leverprøver var 2.649 UMI/kerner og 1.676 gener/kerner. Det mediane antal tællinger på tværs af alle miltprøver var 1.609 UMI/kerner og 1.138 gener/kerner. Vi genererede derefter klynger ved hjælp af meget variable gener og kommenterede dem ved hjælp af kendte markørgener 17,24,25,26. Som det ses i figur 2B, E, H, K, var vi i stand til at identificere de forventede celletyper fra hvert væv. Som det fremgår af figur 2B, E, H og K, bidrog alle dyr desuden til alle klynger, hvilket indikerer en samlet lav teknisk variabilitet, der indføres ved protokollen. Desuden var de cellulære proportioner sammenlignelige i alle tre prøver pr. vævstype, ligesom UMI- og gentællingerne (figur 2A, C, D, F, G, I, J, L). En bemærkelsesværdig undtagelse er leveren, hvor hepatocytpopulationerne blandt de tre leverprøver var forskellige i proportioner og profil. Dette skyldes sandsynligvis biologiske forskelle mellem dyrene (køn, alder, metabolisk status).
Figur 1: Vurdering af kernekvalitet og optimering af saccharosegradient. (A) Den forventede faseadskillelse under saccharosegradientcentrifugering vises med en pil. (B) Repræsentative fluorescerende billeder af propidiumiodidfarvede rottenyrekerner (øverst) og cynomolgusmilt (nederst) opnået med protokollen. (C) Repræsentative lysfeltmikroskopibilleder af kerner isoleret fra muselever (øverst) og musehjerne (nederst), skalabjælke 500 μm. Bemærk den regelmæssige glatte overflade af kerner, der indikerer god nuklear kvalitet. (D) Optimering af saccharosegradient. Flere saccharosetætheder, spinhastigheder og spintider blev testet. Bright-field mikroskopi billeder af kerner, kerner størrelsesfordeling, og kerner udbytte er vist for hver betingelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative data fra snRNAseq om musehjernebarken, rottenyren (cortex og medulla) og cynomolgus makaklever og milt. (A) Violinplots, der viser fordelingen af gener/kerne, UMI'er/kerne og procent mitokondrieindhold pr. hjerneprøve. (B) Venstre panel: UMAP-plot, der viser hver prøves bidrag til de klynger, der er identificeret i hjernen. Højre panel: UMAP, der viser identiteten af klyngerne kommenteret baseret på markørgener i hjernevæv. (C) Cellulære proportioner observeret i de 3 hjerneprøver. (D) Violinplots, der viser fordelingen af gener/kerne, UMI'er/kerne og procent mitokondrieindhold pr. nyreprøve. E) Venstre panel: UMAP-plot, der viser hver prøves bidrag til de klynger, der er identificeret i nyrerne. Højre panel: UMAP, der viser identiteten af klyngerne kommenteret baseret på markørgener i nyrevæv. (F) Cellulære proportioner observeret i de 3 nyreprøver. (G) Violinplots, der viser fordelingen af gener/kerne, UMI'er/kerne og procent mitokondrieindhold pr. leverprøve. H) Venstre panel: UMAP-plot, der viser hver prøves bidrag til de klynger, der er identificeret i leveren. Højre panel: UMAP, der viser identiteten af klyngerne kommenteret baseret på markørgener i levervæv. (I) Cellulære proportioner observeret i de 3 leverprøver. (J) Violinplots, der viser fordelingen af gener/kerne, UMI'er/kerne og procent mitokondrieindhold pr. miltprøve. K) Venstre panel: UMAP-plot, der viser hver prøves bidrag til de klynger, der er identificeret i milten. Højre panel: UMAP, der viser identiteten af klyngerne kommenteret baseret på markørgener i miltvæv. (L) Cellulære proportioner observeret i de 3 miltprøver. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Komponenter | Lagerkoncentration | Volumen pr. prøve | Endelig koncentration |
| Saccharose pude løsning | 2 m | 1500 μL | 1,5 m |
| Saccharose pude buffer | - | 500 μL | - |
| Dithiothreitol (DTT) | 1 m | 2 μL | 1 mM |
| RNAse-hæmmer | 40 U/μL | 10 μL | 0,2 U/μL |
Tabel 1: Fremstilling af 1,5 M saccharosepudeopløsning (SCS). Denne opløsning anvendes til centrifugering af saccharosegradienten under oprydningen i trin 3.1 og skal tilberedes frisk, hver gang protokollen påbegyndes. Hold altid SCS på is under protokollen. De løsninger, der er nævnt i denne tabel, er refereret til i materialetabellen.
| Komponenter | Lagerkoncentration | Volumen pr. prøve | Endelig koncentration |
| Silikakolloid stamopløsning | 90% | 600 μL | 18% |
| Kerner opbevaring reagens (S2 genomforskning) | - | 2400 μL | - |
| RNAse-hæmmer | 40 U/μL | 15 μL | 0,2 U/μL |
Tabel 2: Fremstilling af 18% silicakolloidopløsning. Denne opløsning anvendes til silicakolloidgradientcentrifugering under oprydning i trin 3.2 og skal tilberedes frisklavet hver gang, før protokollen påbegyndes. Opbevar altid 18% silicakolloidopløsningen på is under protokollen.
| Væv | Prøvens vægt | Patron | Give efter |
| Rottelever | 25 mg | Nuclei isolation patron | 65.000 kerner pr. mg væv |
| Rottelever | 4 mg | Små indgangskerner isolationspatron | 32.000 kerner pr. mg væv |
Tabel 3: Udbytte af kerner fra isolationspatronen med lavt input til kernerne i forhold til kerneisolationspatronen efter rensning af saccharosegradient.
| Komponenter | Lagerkoncentration | Volumen pr. prøve | Endelig koncentration |
| Reagens til opbevaring af kerner | - | 1000 μL | - |
| RNAse-hæmmer | 40 U/μL | 5 μL | 0,2 U/μL |
Tabel 4: Fremstilling af kernelagringsreagens (NSR). Denne opløsning anvendes under kerneisolering i trin 3-5 samt under oprydning i trin 3.1.8. Det kan opbevares ved 4 °C i op til 4 måneder. Forbered en frisk prøve med RNase-hæmmer under centrifugeringstrinnet i oprydningstrin 6. De løsninger, der er nævnt i denne tabel, er refereret til i materialetabellen.
| 1x PBS + 0,04% BSA stamopløsning | |||
| Komponenter | Lagerkoncentration | Mængde til lager | Endelig koncentration |
| PBS (ingen Ca 2+, ingen Mg2+) | 1x | 30 ml | - |
| Bovin serumalbumin (BSA) | 30% | 40 μL | 0.04% |
| 1x PBS + 0,04% BSA + 0,2 U/μL RNAsehæmmer | |||
| Komponenter | Lagerkoncentration | Volumen pr. prøve | Endelig koncentration |
| 1x PBS + 0,04% BSA-lageropløsning | - | 500 μL | - |
| RNAse-hæmmer | 40 U/μL | 2,5 μL | 0,2 U/μL |
Tabel 5: Forberedelse af PBS + 0,04% BSA. Denne opløsning anvendes ved afslutningen af oprydningen i trin 3.1.10 og efter tælling til at fortynde kernesuspensionen til den ønskede koncentration til 10X RNA-sekventering med enkeltkerner (tællingstrin 4.4). Stamopløsningen kan opbevares ved 4 °C i op til 1 måned. Forbered en frisk prøve med RNase-hæmmer under centrifugeringstrinnet i oprydningstrin 6.
Discussion
Vi har udviklet en alsidig og delvist automatiseret protokol til opnåelse af enkeltkerner af høj kvalitet fra frosne pattedyrvæv og demonstreret protokollen på musehjerne, rottenyre og cynomolguslever og miltvæv.
Når vi sammenligner udførelsen af denne protokol med andre offentliggjorte protokoller for enkeltkerne RNA-sekventering i hjerne, nyre, milt og levervæv 6,7,20,24,25,26, observerer vi, at vi er i stand til at detektere et tilsvarende antal gener og UMI-tal pr. kerne og er i stand til at gendanne de forventede celletyper. Sammenlignet med eksisterende metoder er der flere fordele ved denne protokol. For det første automatiserer protokollen i denne undersøgelse vævshomogenisering og isolering af enkeltkerner. Dette opnås ved hjælp af en robotvævsforstyrrende faktor21. I de fleste protokoller homogeniseres væv med en Dounce-homogenisator for at frigøre enkeltkerner 3,20. Vi har imidlertid bemærket, at dette manuelle trin kan føre til eksperimentel variabilitet i kerneudbytte og integritet afhængigt af mængden af kraft, der udøves under homogenisering, hvilket kompromitterer eksperimenternes reproducerbarhed. Her blev der ved hjælp af en automatiseret vævssliber med faste indstillinger opnået god kernekvalitet og udbytte med større konsistens på tværs af forsøg. Desuden reducerer automatisering af dette trin også protokollens praktiske tid (vævsforstyrrelsestrinnet tager ca. 7 minutter), så brugeren kan forberede sig på de efterfølgende trin. For det andet er protokollen beskrevet i denne undersøgelse alsidig, dvs. den er kompatibel med forskellige væv fra forskellige arter. Dette gør det muligt for os at undgå langvarig protokoloptimering, f.eks. til at identificere homogeniseringsbuffere/vaskemidler til forskellige væv 2,5,6. For det tredje afhænger denne protokol ikke af adgang til en flowsorterer for at opnå rene kerner, hvilket gør den mere tilgængelig for laboratorier, der ikke har det nødvendige udstyr/ekspertise til flowsortering. I stedet optimerede vi den saccharosegradientbaserede filtrering for at fjerne det meste af affaldet. Men især for hjernevæv anbefales det at bruge en silicakolloidgradient i stedet for en saccharosegradient til mere effektiv myelinfjernelse. Vi har også fundet ud af, at brugen af en svingende skovlrotor i slutningen af centrifugeringstrinnet med saccharose/silicakolloidgradient minimerer kernetabet. Derfor anbefales brugen af en sådan rotor stærkt. For det fjerde, efter at have testet flere metoder til at tælle kerner (manuel tælling under mikroskopet, brug af flere automatiserede tællere), anbefales brugen af en automatiseret fluorescerende celletæller22. Anvendelsen af et DNA-interkalerende farvestof, såsom propidiumiodid, øger nøjagtigheden af kernetælling. For det femte tager denne protokol cirka 75 minutter fra start til indlæsning af den mikrofluidiske chip. Dette hjælper med at sikre, at kerneintegriteten forbliver høj, når der behandles flere prøver. Endelig har vi fundet, at protokollen også er kompatibel med optimalt skæretemperatursammensat (OCT)-indlejret væv. Hvis der anvendes sådant materiale, kan vævet fjernes fra OCT-blokken ved hjælp af en skalpel før homogenisering.
En hyppig udfordring i enkeltkerner RNA-sekventeringsdatasæt er tilstedeværelsen af omgivende RNA, som kan være ikke-nuklear (f.eks. Mitokondrie) såvel som nuklear afledt27,28. I vores protokol er mitokondrie-RNA (en proxy for ikke-nukleært omgivende RNA) lavt, selv før filtrering (0,1-1,6% for det viste væv). I lighed med andre protokoller og datasæt er omgivende RNA-forurening fra stærkt udtrykte gener i kernerne i rigelige celletyper (såsom hepatocytter i leveren, neuroner i hjerner osv.) stadig til stede27. Der findes flere bioinformatikværktøjer, såsom CellBender, SoupX osv., Der kan fjerne sådan omgivende RNA-forurening før kerneannotation 29,30,31. En anden begrænsning af denne protokol er, at selvom vævsforstyrrelses- og kerneisoleringstrinnene er automatiserede, er gennemstrømningen af dette trin stadig begrænsende, da kun en prøve kan behandles ad gangen. Men da dette trin kun tager ca. 7 minutter pr. stykke væv, kan flere prøver stadig behandles i en batch. Vi behandler typisk fire prøver pr. batch, men har lavet op til seks prøver pr. batch med gode resultater. Nylige forbedringer i robotdissociatoren for at muliggøre parallel behandling af to prøver samtidigt vil muliggøre behandling af 8-12 prøver pr. Batch, hvilket er kompatibelt med gennemstrømningen af den mikrofluidiske chip, der bruges til indkapsling af enkeltkerner.
Selvom vi ikke har brugt kernerne isoleret af denne protokol til andre downstream-applikationer såsom ATAC-seq eller snRNAseq ved hjælp af andre platforme, baseret på kvaliteten af data opnået med de genekspressionsreagenser, der anvendes her, mener vi, at vores protokol skal være kompatibel med yderligere downstream-applikationer. Det fremtidige arbejde vil dog indebære afprøvning af denne protokol med andre downstream-applikationer, såsom ATAC-seq.
Afslutningsvis har vi udviklet en hurtig, enkel og delvist automatiseret kerneisoleringsprotokol til nedstrøms RNA-sekventering med en enkelt kerne, der har vist sig at være kompatibel med forskellige typer frosset pattedyrvæv.
Disclosures
Alle forfattere er/var ansat hos F. Hoffmann-La Roche under gennemførelsen af undersøgelsen.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Filip Bochner, Marion Richardson, Petra Staeuble og Matthias Selhausen for at levere det dyrevæv, der blev analyseret i dette manuskript. Vi vil også gerne takke Petra Schwalie, Klas Hatje, Roland Schmucki og Martin Ebeling for deres bioinformatikstøtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M DTT | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| 10x Magnetic Separator | 10x genomics | PN-120250 | |
| 10x Vortex Adapter | 10x genomics | PN-120251 | |
| 1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | stored at 4°C |
| 30% Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9576_50ML | |
| 400 mM Tris-HCl, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| 40U/μl RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | Stored at -20 °C |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter | Nexcelom Bioscience | CELMXSYSF2 | Automated fluorescent cell counter |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10x genomics | PN-1000127 | Single cell gene expression reagent, stored at room temperature |
| Chromium Next GEM Secondary Holder | 10x genomics | PN-1000195 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000129 | Single cell gene expression reagent, stored at -80 °C |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns | 10x genomics | PN-1000128 | Single cell gene expression reagent |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000158 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
| Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns | 10x genomics | PN-1000130 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
| Divided Polystyrene Reservoirs | VWR | 41428-958 | |
| DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108051 | |
| DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf | Sigma-Aldrich | EP0030108078 | |
| Dry ice | - | - | |
| Dynabeads MyOne SILANE | 10x genomics | PN-2000048 | Single cell gene expression reagent, stored at 4 °C |
| Ethanol Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Glycerin (Glycerol), 50% (v/v) | Ricca Chemical Company | 3290-16 | |
| Heatblock | |||
| High-Throughput Nexcelom Counting Plates | Nexcelom Bioscience | CHM24-A100-001 | Cell counter counting plate |
| Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Mini Centrifuge | - | - | |
| NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles) | Illumina | 2002840 | |
| Nuclei Isolation Buffer | S2 Genomics | 100-063-396 | Stored at 4 °C |
| Nuclei Isolation Cartridge | S2 Genomics | 100-063-287 | Precooled at 4 °C before use |
| Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | Sucrose cushion solution |
| Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer | Sigma-Aldrich | NUC201-1KT | |
| Nuclei Storage Reagent | S2 Genomics | 100-063-405 | Stored at 4 °C |
| PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips | Eppendorf | 30124359 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | Silica colloid solution |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| Qiagen Buffer EB | Qiagen | 19086 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32854 | |
| Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R) | Eppendorf | 5805000010 | |
| Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R) | Eppendorf | 5811000015 | |
| RNAseZap | Ambion | AM9780 | RNAse decontamination solution |
| Round cell culture petri dish | SPL | 330005 | |
| Scalpel disposable | Aesculap AG | BA210 | pre-cooled on dry ice before use |
| Single Index Kit T Set A, 96 rxns | 10x genomics | PN-1000213 | Single cell gene expression reagent, stored at -20 °C |
| Singulator 100 System | S2 Genomics | - | Commercially available robotic tissue dissociator |
| Sodium Hydroxide 1M | Sigma-Aldrich | 72068 | |
| SPRIselect Reagent Kit | Beckman Coulter | b23318 | |
| Sterile tweezers | - | - | |
| UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977049 | |
| ViaStain PI Staining Solution | Nexcelom Bioscience | CS1-0109-5mL | Propidium iodide staining solution |
| Vortex Mixer+A2:D44 | VWR | - |
References
- Burja, B., et al. An Optimized Tissue Dissociation Protocol for Single-Cell RNA Sequencing Analysis of Fresh and Cultured Human Skin Biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688 (2022).
- Kimbley, L. M., et al. Comparison of optimized methodologies for isolating nuclei from esophageal tissue. Biotechniques. 72 (3), 104-109 (2022).
- Maitra, M., et al. Extraction of nuclei from archived postmortem tissues for single-nucleus sequencing applications. Nature Protocols. 16 (6), 2788-2801 (2021).
- Nadelmann, E. R., et al. Isolation of nuclei from mammalian cells and tissues for single-nucleus molecular profiling. Current Protocols. 1 (5), e132 (2021).
- Rousselle, T. V., et al. An optimized protocol for single nuclei isolation from clinical biopsies for RNA-seq. Scientific Reports. 12, 9851 (2022).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
- Leiz, J., et al. Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), 62901 (2021).
- Alvarez, M., et al. Isolation of nuclei from human snap-frozen liver tissue for single-nucleus RNA sequencing. Bio-Protocol. 13 (3), e4601 (2023).
- Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus. STAR Protocols. 2 (4), 100844 (2021).
- Joshi, N., Misharin, A. Single-nucleus isolation from frozen human lung tissue for single-nucleus RNA-seq. Protocols.io. , https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.zu8f6zw (2019).
- Martelotto, L. G., Luciano Martelotto, L. 'Frankenstein' protocol for nuclei isolation from fresh and frozen tissue for snRNAseq. Protocols.io. , https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.3fkgjkw (2020).
- Masilionis, I., Chaudhary, O., Chaligne, R., Mazutis, L. Nuclei extraction for single-cell RNAseq from frozen tissue using Singulator™ 100. Protocols.io. , https://www.protocols.io/view/nuclei-extraction-for-single-cell-rnaseq-from-froz-q26g74xzqgwz/v1 (2022).
- Matson, K. J. E., et al. Isolation of adult spinal cord nuclei for massively parallel single-nucleus RNA sequencing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), 58413 (2018).
- Mendelev, N., et al. Multi-omics profiling of single nuclei from frozen archived postmortem human pituitary tissue. STAR Protocols. 3 (2), 101446 (2022).
- Soule, T. G., et al. A protocol for single nucleus RNA-seq from frozen skeletal muscle. Life Science Alliance. 6 (5), e202201806 (2023).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Ding, J., et al. Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nature Biotechnology. 38, 737-746 (2020).
- Hu, P., et al. Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes & Development. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7, 6031 (2017).
- Narayanan, A., et al. Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), 61542 (2020).
- Jovanovich, S., et al. Automated processing of solid tissues into single cells or nuclei for genomics and cell biology applications with the Singulator™ 100 and 200 systems. , S2 Genomics, Livermore, CA. https://s2genomics.com/poster-download-automated-processing-of-solid-tissues-into-single-cells-or-nuclei-with-the-singulator-100-system-scrna-seq-and-atac-seq-data-on-human-and-mouse-tissues-agbt-2022 (2022).
- Bell, J., et al. Characterization of a novel high-throughput, high-speed and high-precision plate-based image cytometric cell counting method. Cell & Gene Therapy Insights. 7 (4), 427-447 (2021).
- Madler, S. C., et al. Besca, a single-cell transcriptomics analysis toolkit to accelerate translational research. NAR Genomics and Bioinformatics. 3 (4), lqab102 (2021).
- Wu, H., et al. Mapping the single-cell transcriptomic response of murine diabetic kidney disease to therapies. Cell Metabolism. 34 (7), 1064-1078 (2022).
- Han, L., et al. Cell transcriptomic atlas of the non-human primate Macaca fascicularis. Nature. 604 (7907), 723-731 (2022).
- Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), 1 (2019).
- Caglayan, E., Liu, Y., Konopka, G. Neuronal ambient RNA contamination causes misinterpreted and masked cell types in brain single-nuclei datasets. Neuron. 110 (24), 4043-4056 (2022).
- Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Molecular Systems Biology. 15 (6), e8746 (2019).
- Fleming, S. J., et al. Unsupervised removal of systematic background noise from droplet-based single-cell experiments using CellBender. bioRxiv. , (2022).
- Yang, S., et al. Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX. Genome Biology. 21 (1), 57 (2020).
- Young, M. D., Behjati, S. SoupX removes ambient RNA contamination from droplet-based single-cell RNA sequencing data. Gigascience. 9 (12), giaa151 (2020).
