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ऑर्थोडॉन्टिक टूथ मूवमेंट के दौरान वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग का अध्ययन करने के लिए इंड्यूसेबल ओस्टियोब्लास्टिक वंश-विशिष्ट स्टेट 3 नॉकआउट चूहों का उपयोग करना

Published: July 21, 2023 doi: 10.3791/65613
Automatic Translation
*1,2,3,4,5, *1,2,3,4,5, *6, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 2,3,4,5,7, 1,2,3,4,5
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University, 3National Center for Stomatology, 4National Clinical Research Center for Oral Diseases, 5Shanghai Key Laboratory of Stomatology, 6Shanghai Starriver Bilingual School, 7The 2nd Dental Center, Ninth People’s Hospital, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यह अध्ययन ऑर्थोडोंटिक बल के तहत हड्डी रीमॉडेलिंग का अध्ययन करने के लिए इंड्यूसेबल ओस्टियोब्लास्ट वंश-विशिष्ट स्टेट 3 नॉकआउट चूहों का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है और ऑर्थोडोंटिक दांत आंदोलन के दौरान वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग का विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करता है, इस प्रकार कंकाल यांत्रिक जीव विज्ञान पर प्रकाश डालता है।

Abstract

उच्च टर्नओवर दर के साथ वायुकोशीय हड्डी, शरीर में सबसे सक्रिय रूप से रीमॉडेलिंग हड्डी है। ऑर्थोडॉन्टिक टूथ मूवमेंट (ओटीएम) यांत्रिक बल के जवाब में वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग की एक सामान्य कृत्रिम प्रक्रिया है, लेकिन अंतर्निहित तंत्र मायावी रहता है। पिछले अध्ययन पशु मॉडल से संबंधित प्रतिबंधों के कारण किसी भी समय और स्थान में हड्डी रीमॉडेलिंग के सटीक तंत्र को प्रकट करने में असमर्थ रहे हैं। सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन 3 (एसटीएटी 3) के उत्प्रेरक हड्डी के चयापचय में महत्वपूर्ण है, लेकिन ओटीएम के दौरान ओस्टियोब्लास्ट में इसकी भूमिका स्पष्ट नहीं है। विवो साक्ष्य प्रदान करने के लिए कि एसटीएटी 3 विशिष्ट समय बिंदुओं पर ओटीएम में भाग लेता है और ओटीएम के दौरान विशेष कोशिकाओं में, हमने एक टैमोक्सीफेन-इंड्यूसेबल ओस्टियोब्लास्ट वंश-विशिष्ट स्टेट 3 नॉकआउट माउस मॉडल उत्पन्न किया, ऑर्थोडॉन्टिक बल लागू किया, और वायुकोशीय हड्डी फेनोटाइप का विश्लेषण किया।

ओटीएम दूरी तक पहुंचने के लिए माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रो-सीटी) और स्टीरियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया था। हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण ने ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट की चयापचय गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए मैक्सिलरी हड्डी के क्रॉस-सेक्शन में पहले दाढ़ (एम 1) की तीन जड़ों के भीतर स्थित क्षेत्र को रुचि के क्षेत्र (आरओआई) के रूप में चुना, जो वायुकोशीय हड्डी पर ऑर्थोडोंटिक बल के प्रभाव को दर्शाता है। संक्षेप में, हम ऑर्थोडोंटिक बल के तहत हड्डी रीमॉडेलिंग का अध्ययन करने और ओटीएम के दौरान वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग का विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करने के लिए इंड्यूसेबल ओस्टियोब्लास्ट वंश-विशिष्ट स्टेट 3 नॉकआउट चूहों का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, इस प्रकार कंकाल यांत्रिक जीव विज्ञान पर नया प्रकाश डालते हैं।

Introduction

यह आमतौर पर ज्ञात है कि वोल्फ के नियम 1,2 के अनुसार यांत्रिक बलों के जवाब में हड्डी पूरे जीवन में निरंतर पुनर्निर्माण के अधीन है। उचित यांत्रिक उत्तेजना, जैसे गुरुत्वाकर्षण और दैनिक व्यायाम, हड्डी के द्रव्यमान और ताकत को बनाए रखता है और ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट दोनों को उत्तेजित करके हड्डी के नुकसान को रोकता है। ओस्टियोक्लास्ट्स, हड्डी के पुनरुत्थान 3,4,5,6,7 के लिए जिम्मेदार हैं, और ओस्टियोब्लास्ट, हड्डी के गठन के लिए जिम्मेदार 8,9,10, हड्डी होमियोस्टैसिस को बनाए रखते हैं और हड्डी रीमॉडेलिंग की जैविक प्रक्रिया में संयुक्त रूप से कार्य करते हैं। इसके विपरीत, लोडिंग उत्तेजनाओं की अनुपस्थिति में, जैसा कि दीर्घकालिक माइक्रोग्रैविटी के तहत अंतरिक्ष यात्रियों में, हड्डियों को 10% अस्थि खनिज घनत्व हानि का सामना करना पड़ता है, इस प्रकार ऑस्टियोपोरोसिस 11,12 का खतरा बढ़ जाता है। इसके अलावा, ऑर्थोडोंटिक्स और व्याकुलता ऑस्टियोजेनेसिस सहित गैर-आक्रामक और सुविधाजनक यांत्रिक उपचार, हड्डी रोगों13,14 के उपचार के रूप में उभरे हैं। इन सभी से पता चला है कि यांत्रिक बल हड्डी की गुणवत्ता और मात्रा को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हाल के अध्ययनों ने आम तौर पर रनिंग व्हील और टेल सस्पेंशन टेस्ट जैसे समय लेने वाले मॉडल का उपयोग करके यांत्रिक लोडिंग के जवाब में हड्डी रीमॉडेलिंग का विश्लेषण किया, जिसमें आमतौर पर15,16 बल लोडिंग या अनलोडिंग का अनुकरण करने में 4 सप्ताह या उससे अधिक समय लगता था। इसलिए, बल लोडिंग द्वारा संचालित हड्डी रीमॉडेलिंग का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक और कुशल पशु मॉडल की मांग है।

अस्थि रीमॉडेलिंग के मामले में वायुकोशीय हड्डी सबसे सक्रिय है, जिसमें उच्च टर्नओवर दर17 है। ऑर्थोडॉन्टिक टूथ मूवमेंट (ओटीएम), मालोक्यूलेशन के लिए एक सामान्य उपचार, यांत्रिक बल के जवाब में वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग की एक कृत्रिम प्रक्रिया है। हालांकि, ओटीएम, जो तेजी से हड्डी रीमॉडेलिंग18 को प्रेरित करता है, एक लंबी प्रयोगात्मक अवधि वाले अन्य मॉडलों की तुलना में हड्डी रीमॉडेलिंग पर यांत्रिक बल के प्रभावों का अध्ययन करने का एक समय-बचत तरीका भी है। इसलिए, ओटीएम यांत्रिक उत्तेजनाओं के तहत हड्डी रीमॉडेलिंग का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल है। यह उल्लेखनीय है कि वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग का तंत्र अक्सर समय-संवेदनशील होता है, और मॉडलिंग के बाद कुछ समय बिंदुओं पर वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग में परिवर्तन का निरीक्षण करना आवश्यक है। डीएनए पुनर्संयोजन और ऊतक विशिष्टता के लौकिक और स्थानिक नियंत्रण के दोहरे फायदे के साथ, एक इंड्यूसेबल सशर्त जीन नॉकआउट माउस मॉडल ओटीएम अध्ययन के लिए एक उपयुक्त विकल्प है।

परंपरागत रूप से, ओटीएम-मध्यस्थता वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग को तनाव क्षेत्रों में विभाजित किया गया है जिसमें हड्डी का गठन और दबाव क्षेत्र शामिल हैं जिसमें हड्डी का पुनर्जीवन 19,20,21 शामिल है, जो अधिक विस्तृत है लेकिन विनियमित करना मुश्किल है। इसके अलावा, यूरी एट अल ने बताया कि ओटीएम में हड्डी के गठन का समय तनाव और संपीड़न पक्ष22 पर भिन्न था। इसके अलावा, एक पिछले अध्ययन से पता चला था कि पहला दाढ़ ऑर्थोडोंटिक बल के तहत मैक्सिलरी वायुकोशीय हड्डी के व्यापक रीमॉडेलिंग शुरू कर सकता है, जो तनाव और दबाव क्षेत्र23 तक सीमित नहीं था। इसलिए, हमने मैक्सिलरी हड्डी के क्रॉस-सेक्शन में एम 1 की तीन जड़ों के भीतर स्थित क्षेत्र को रुचि के क्षेत्र (आरओआई) के रूप में चुना और ओटीएम के तहत वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग का मूल्यांकन करने के लिए उसी क्षेत्र में ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट की गतिविधि का आकलन करने के तरीकों का वर्णन किया।

एक परमाणु प्रतिलेखन कारक के रूप में, सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन 3 (एसटीएटी 3) के उत्प्रेरक को हड्डी होमियोस्टैसिस24,25 में महत्वपूर्ण साबित किया गया है। पिछले अध्ययनों ने स्टेट 3-उत्परिवर्ती चूहों26,27 में कम अस्थि खनिज घनत्व और आवर्तक पैथोलॉजिकल फ्रैक्चर की सूचना दी है। हमारे पिछले अध्ययन से पता चला है कि ओएसएक्स + ओस्टियोब्लास्ट में स्टेट 3 के विलोपन से क्रैनियोफेशियल विकृति और ऑस्टियोपोरोसिस, साथ ही सहज हड्डीफ्रैक्चर 28 हुआ। हाल ही में, हमने एक इंड्यूसेबल ओस्टियोब्लास्ट-विशिष्ट स्टेट 3 विलोपन माउस मॉडल (Col1a2 CreERT2; Col12CreERT2) के साथ विवो साक्ष्य प्रदान किया। स्टेट 3 एफएल/ एफएल, जिसे बाद में स्टेट 3 कोल 1 2ईआरटी 2 कहा जाता है) कि एसटीएटी 3 वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग29 को चलाने वाले ऑर्थोडोंटिक बल के प्रभावों की मध्यस्थता में महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन में, हम ऑर्थोडोंटिक बल के तहत हड्डी रीमॉडेलिंग का अध्ययन करने के लिए इंड्यूसेबल ओस्टियोब्लास्ट वंश-विशिष्ट स्टेट 3 नॉकआउट चूहों का उपयोग करने के लिए तरीके और प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और ओटीएम के दौरान वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग का विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करते हैं, इस प्रकार कंकाल यांत्रिक जीव विज्ञान पर प्रकाश डालते हैं।

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Protocol

यहां वर्णित जानवरों से जुड़े सभी तरीकों को शंघाई नौवीं पीपुल्स अस्पताल, शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (नंबर 82101048) की नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. इंड्यूसेबल ओस्टियोब्लास्ट वंश-विशिष्ट स्टेट 3 नॉकआउट चूहों की स्थापना।

नोट: स्टेट 3 एफएल/ एफएल चूहों को व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया था; Col1a2CreERT2तनाव एक उपहार था (सभी विवरणों के लिए सामग्री की तालिका देखें)। सभी जानवरों के लिए मानकीकृत प्रयोगशाला पेलेट भोजन और पानी और मानक प्रयोगशाला पर्यावरणीय स्थितियां (कमरे का तापमान 22 डिग्री सेल्सियस से 26 डिग्री सेल्सियस और आर्द्रता 50% -55%) प्रदान की गई थी।

  1. एक ही पिंजरे में दो मादा चूहों के साथ एक यौन परिपक्व नर माउस रखो। 18 दिनों के बाद, हर दिन नवजात शिशुओं की जांच करें। किसी भी गर्भवती मादा चूहों को एक खाली पिंजरे में हटा दें और यदि आवश्यक हो तो उन्हें अकेले रखें। नर चूहों को अन्य अलग-अलग प्रजनन पिंजरों में रखें यदि मादा चूहे 30 दिनों के भीतर गर्भवती नहीं हैं।
  2. स्टेट 3एफएल / + उत्पन्न करें; Col12CreERT2 चूहों को Stat3 fl/fl चूहों को Col1a2CreERT2 चूहों के साथ संकरण करके; इन सभी चूहों को C57BL/6 पृष्ठभूमि पर बनाए रखें। जीनोटाइपिंग के लिए 2-5 मिमी पूंछ युक्तियां एकत्र करें और पुरुष स्टेट 3एफएल / + रखें; Col12CreERT2 चूहों जब तक वे यौन रूप से परिपक्व नहीं होते (F1)।
  3. 6 सप्ताह के पुरुष स्टेट 3एफएल / + को हाइब्रिड करें; Col12CreERT2 चूहों को मादा स्टेट 3 fl/ fl चूहों के साथ। जीनोटाइपिंग के लिए चूहों के 2 सप्ताह के होने पर 2-5 मिमी पूंछ युक्तियां एकत्र करें, और पुरुष स्टेट 3एफएल / एफएल रखें; Col12 CreERT2 (Stat3Col1a2ERT2) चूहे जब तक वे यौन रूप से परिपक्व नहीं होते (F2)।
  4. 6 सप्ताह के पुरुष स्टेट 3एफएल / एफएल को हाइब्रिड करें; मादा स्टेट 3 एफएल / एफएल चूहों (एफ 3) के साथ कोल 12 सीआरईआरटी 2 चूहे। जीनोटाइपिंग के लिए चूहों के 2 सप्ताह के होने पर 2-5 मिमी पूंछ युक्तियां एकत्र करें, और उपयुक्त (एफ 3 + एन) होने पर पुराने प्रजनन चूहों को बदलने के लिए उसी जीनोटाइप के छोटे चूहों का उपयोग करें।
    नोट: 8 महीने की उम्र के बाद चूहों की प्रजनन क्षमता कम हो जाती है, इसलिए प्रजनन पिंजरों में चूहों की सावधानीपूर्वक निगरानी की जानी चाहिए और आवश्यकतानुसार प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार, लक्षित जीन चूहों के विलुप्त होने से बचने के लिए प्रजनन पिंजरों की संख्या को उचित रूप से बढ़ाया जाना चाहिए।

2. टैमोक्सीफेन द्वारा ओस्टियोब्लास्ट को व्यक्त करने वाले कोल 1 ए 2 में स्टेट 3 का इंड्यूसेबल विलोपन

  1. एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 20 मिलीग्राम / एमएल तक मकई के तेल में टैमोक्सीफेन घोलें, और पन्नी में लपेटकर प्रकाश से बचाएं। पन्नी से ढके सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को रोटरी मिक्सर पर रखें और पूरी तरह से घुलने तक कमरे के तापमान पर मिलाएं।
    नोट: टैमोक्सीफेन व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया था और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहीत किया गया था।
  2. दस 6 सप्ताह के नर चूहों का चयन करें और उन्हें प्रत्येक समूह में पांच चूहों के साथ स्टेट 3 एफएल / एफएल और स्टेट 3 कोल 1 2 ईआरटी 2 समूहों में विभाजित करें। इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा 1 सप्ताह के लिए हर 2 दिनों में टैमॉक्सिफेन (100 मिलीग्राम -1.बीडब्ल्यू) का प्रबंधन करें।

3. ऑर्थोडॉन्टिक टूथ मूवमेंट (ओटीएम) मॉडल

  1. चूहों को गतिहीन करने के लिए एक ऑपरेटिंग टेबल के रूप में एक निष्फल प्लास्टिक माउस विच्छेदन मंच तैयार करें।
    नोट: माउस विच्छेदन तालिका व्यावसायिक रूप से प्राप्त की गई थी और इसमें चूहों को स्थिर करने के लिए चार समायोज्य रबर पोस्ट और एक धातु रॉड शामिल थी। पूरी प्रक्रिया के दौरान बाँझ उपकरणों और उपकरणों का उपयोग करें।
  2. अंग निर्धारण के लिए प्रत्येक रबर पोस्ट में एक लोचदार बैंड संलग्न करें।
  3. दो ऊपरी रबर पदों के बीच एक लोचदार बैंड बांधें; निचले छेदक को पकड़ने के लिए लोचदार बैंड में एक धागा बांधें; और ऊपरी छेदक को पकड़ने के लिए धातु की छड़ पर एक और धागा बांधें।
  4. सर्जरी से पहले इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा खारा में घुलने वाले डेक्समेडेटोमिडीन हाइड्रोक्लोराइड (0.1 मिलीग्राम-1.बीडब्ल्यू) और ज़ोलेटिल (20 मिलीग्राम -1.बीडब्ल्यू के लिए टिलेटामाइन हाइड्रोक्लोराइड और 20 मिलीग्राम -1.बीडब्ल्यू के लिए ज़ोलाज़ेपम हाइड्रोक्लोराइड) के 0.1 एमएल समाधान के साथ 7 सप्ताह के नर चूहों को एनेस्थेटाइज करें। सुनिश्चित करें कि चूहे पूरे ऑपरेशन के दौरान उचित संज्ञाहरण के तहत हैं।
    नोट: दवाओं के प्रभावी उपयोग की तारीख पर ध्यान दें, और समाप्त दवाओं का उपयोग न करें।
  5. उंगलियों से पिछले अंगों के पैर की उंगलियों को निचोड़कर पुष्टि करें कि चूहे उचित संज्ञाहरण के अधीन हैं।
    नोट: यदि चूहे परीक्षण का जवाब नहीं देते हैं, तो इसका मतलब है कि वे बेहोश हैं और संज्ञाहरण वांछित गहराई तक पहुंच गया है। उस समय, चूहे चिकनी श्वास और हृदय गति के साथ अंग की मांसपेशियों में छूट की स्थिति में होते हैं, और ऑपरेशन शुरू किया जा सकता है।
  6. सूखापन को रोकने के लिए चूहों की आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का उपयोग करें और ऑपरेटिंग टेबल पर लापरवाह स्थिति में एनेस्थेटाइज्ड माउस रखें। अंगों को ठीक करने के लिए रबर पोस्ट पर चार लोचदार बैंड का उपयोग करें, ऊपरी छेदक को पकड़ने के लिए धातु की छड़ से जुड़ा एक धागा और दूसरा ऊपरी रबर पोस्ट के बीच एक लोचदार बैंड से जुड़ा हुआ है ताकि निचले जबड़े को खोलने के लिए निचले छेदक पर हुक लगाया जा सके।
  7. ऑर्थोडोंटिक बल उपकरण के लिए बंद-कॉइल स्प्रिंग्स (0.25 मिमी तार का आकार, 0.76 मिमी व्यास, 1 मिमी लंबाई) तैयार करें।
    नोट: प्रत्येक माउस के लिए वसंत के आठ धागे काटें। बल उपकरण के लिए बीच में 1 मिमी लंबाई के चार धागे और स्टील लिगेचर तार का उपयोग करके लिगेचर िंग के लिए प्रत्येक छोर पर दो धागे।
  8. वसंत के एक छोर को मैक्सिलरी बाएं पहले दाढ़ के लिए तैयार करें। केंद्रीय छेदक के दूसरे छोर को 0.1 मिमी स्टील लिगेचर तार से लैस करें, जिसे क्यू-टिप के साथ छेदक पर चिपकने वाला लगाने के बाद क्यू-टिप के साथ छेदक लगाने के बाद प्रबलित किया जाता है ताकि डायनेमोमीटर का उपयोग करके मापा गया 10 ग्राम के परिमाण का स्थिर बल उत्पन्न किया जा सके।
  9. ऑपरेशन पूरा करने के बाद, चूहों को वसूली में उसी तनाव के अन्य लोगों के साथ एक पिंजरे में रखें, या प्रत्येक माउस को अकेले एक खाली पिंजरे में डाल दें। सुनिश्चित करें कि चूहों को तब तक लावारिस नहीं छोड़ा जाता है जब तक कि वे ऑपरेशन के 2-4 घंटे बाद पर्याप्त चेतना प्राप्त नहीं कर लेते हैं ताकि उरोस्थि की पुनरावृत्ति को बनाए रखा जा सके। अगले कुछ दिनों के लिए, चूहों को एक नरम आहार खिलाएं और यह सुनिश्चित करने के लिए नियमित रूप से उनका निरीक्षण करें कि कोई जटिलता नहीं होती है और पोस्टसर्जिकल दर्द की डिग्री का पता लगाने के लिए; आवश्यकतानुसार एनाल्जेसिक दवाओं का प्रशासन करें।
    नोट: सर्जरी से गुजरने वाले चूहों को पूरी तरह से ठीक होने तक अन्य चूहों की कंपनी में वापस नहीं किया जाना चाहिए। पोस्टसर्जिकल चूहों को चूहों के साथ वसूली में न रखें जिन्हें एनेस्थेटाइज्ड नहीं किया जाता है। वसूली के दौरान चूहों को गर्म रखा जाना चाहिए।
  10. हर दिन ऑर्थोडोंटिक उपकरण की जांच करें और किसी भी प्रयोगात्मक चूहों को हटाने के साथ बाहर करें।

4. नमूना संग्रह

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से तीन अलग-अलग समय बिंदुओं पर चूहों को इच्छामृत्यु करें: ओटीएम की शुरुआत के 4 दिन (डी 4), 7 दिन (डी 7), और 10 दिन (डी 10)।
  2. गर्भाशय ग्रीवा क्षेत्र से त्वचा को लंबवत रूप से काटने के लिए नेत्र कैंची का उपयोग करें और फिर सिर की पूरी त्वचा को विच्छेदित करके सिर को शरीर से अलग करें।
  3. जबड़े के पीछे के क्षेत्र में द्विपक्षीय एंगुलस ओरिस से त्वचा और बुकिनेटर की मांसपेशियों को काट दें। जबड़ा हटाने और अतिरिक्त हड्डियों को ट्रिम करने के लिए कोरैकोइड्स से जुड़ी कमर की मांसपेशियों और टेंडन को पूरी तरह से डिस्कनेक्ट कर दें और पूर्ण मैक्सिला प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त हड्डियों को ट्रिम करें। फिर, द्विपक्षीय तीसरे दाढ़ के पीछे की हड्डी को हटा दें और पालटल म्यूकोसा को फाड़ दें। अंत में, ऑर्थोडोंटिक उपकरण को डिस्कनेक्ट करें और दाएं और बाएं पक्षों की वायुकोशीय हड्डी प्राप्त करने के लिए औसत पैलेटिन सीवन के साथ छेदक के बीच की हड्डी को काट दें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि छेदक से तीसरे दाढ़ तक का क्षेत्र दोनों तरफ बरकरार रखा गया है।

5. पैराफिन अनुभाग के लिए तैयारी

  1. निर्धारण: कटी हुई वायुकोशीय हड्डी को 48 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में डुबोएं और सेक्शन 6 और 7 के लिए फ्यूम हुड में नेत्र कैंची के साथ ट्रिम करें।
  2. डिकैल्सीफिकेशन: 3 x 10 मिनट के लिए 1x PBS के साथ नमूनों को धीरे से धोएं। नमूनों को सार्वभौमिक ऊतक फिक्सेटिव (पीएच 8.0) में डिकैल्सिफाई करें, हर 2 दिनों में ताजा समाधान के साथ प्रतिस्थापित करें, 5 सप्ताह के लिए जब तक हड्डियों को सुई की नोक से आसानी से प्रवेश नहीं किया जा सके।
  3. निर्जलीकरण: 3 x 10 मिनट के लिए 1x PBS में नमूने धोएं, और फिर क्रमिक रूप से उन्हें 95% इथेनॉल, 100% इथेनॉल और जाइलीन में डुबोएं, प्रत्येक घोल के लिए 2 x 1 घंटे के लिए।
  4. 30 मिनट के लिए जाइलीन और पैराफिन के 1: 1 मिश्रण में नमूने डुबोएं और फिर रात भर 65 डिग्री सेल्सियस पर पैराफिन में डुबोएं।
  5. एम्बेडिंग: उपयुक्त एम्बेडिंग टैंक का चयन करें। वायुकोशीय हड्डी को समान स्तर पर दांतों के साथ समान रूप से रखें। एम्बेडिंग टैंक से नमूने निकालें और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें, फिर पैराफिन पूरी तरह से ठंडा और ठोस होने पर उन्हें नंबर दें।
  6. एक माइक्रोटोम का उपयोग करके, अनुप्रस्थ विमान में लगातार बीस से चालीस 4 μm-मोटे खंड काटें और 37 °C पानी पर तैरें। माइक्रोस्कोप स्लाइड के अनुभागों का पालन करें और रात भर 42 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।

6. ओटीएम दूरी माप

  1. स्टीरियो माइक्रोस्कोपी द्वारा ऑक्लुसल प्लेन से लंबवत रूप से तीन समय बिंदुओं से नमूने की तस्वीरें।
  2. माइक्रो-सीटी स्कैनर के साथ वायुकोशीय हड्डी को स्कैन करें। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए स्कैनर के सहायक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मैक्सिलरी वायुकोशीय हड्डी के अधिकतम विमान की 3 डी छवियों का पुनर्निर्माण करें, जिसमें तीन दाढ़ पूरी तरह से दिखाई देते हैं।
  3. ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके OTM दूरी को मापें:
    1. ImageJ सॉफ़्टवेयर खोलें और ज्ञात दूरी का एक रेखा खंड बनाने के लिए सीधी रेखा उपकरण का उपयोग करें।
    2. ज्ञात दूरी में खींची गई रेखा दूरी का मान दर्ज करने के लिए विश्लेषण करें और स्केल सेट करें पर क्लिक करें और लंबाई की इकाई में इकाइयाँ दर्ज करें.
    3. M2 के मेसिअल सीमांत रिज के मध्य बिंदु और M1 के डिस्टल सीमांत रिज के बीच एक रेखा खींचें और माप पर क्लिक करें। लंबाई स्तंभ में दिखाए गए परिणाम OTM दूरी का प्रतिनिधित्व करते हैं।

7. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण

  1. रुचि का क्षेत्र (आरओआई) चयन: पहले दाढ़ (एम 1) की वायुकोशीय हड्डी को आरओआई के रूप में परिभाषित करें, जो मैक्सिलरी हड्डी में अनुप्रस्थ खंड में एम 1 की तीन जड़ों के भीतर स्थित है। यह क्षेत्र न केवल पहले दाढ़ की कॉर्टिकल हड्डी तक पहुंचता है, बल्कि मेसिओबुकल जड़ की लंबी धुरी के बीच तक भी फैला हुआ है, जिसमें डिस्टोब्यूकल रूट और पलाटल रूट के बीच का आधा क्षेत्र भी शामिल है।
  2. ओस्टियोजेनेसिस का विश्लेषण
    1. कैल्सीन और अलिज़रीन लाल डबल लेबलिंग और विश्लेषण
      1. कैल्सीन और एलिज़रीन लाल तैयारी: 2% NaHCO3 घोल में कैल्केन को 1 मिलीग्राम / एमएल में घोलें और एच 2 ओ से2मिलीग्राम / एमएल में एलिज़रीन लाल एस घोलें।
        नोट: इस अध्ययन में, कैल्सीन और एलिज़रीन लाल व्यावसायिक रूप से प्राप्त किए गए थे।
      2. ओटीएम शुरू होने के बाद इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा पहले दिन कैल्सीन (20 मिलीग्राम -1.बीडब्ल्यू) और 8 वें दिन एलिजारिन रेड एस (40 मिलीग्राम -1.बीडब्ल्यू) का उपयोग करें। 10 वें दिन चूहों को इच्छामृत्यु दें और वायुकोशीय हड्डी की कटाई करें।
      3. नमूने तैयार करें और चरण 5.1 और 5.3-5.5 का पालन करते हुए उन्हें एम्बेड करें। अधिक जानकारी के लिए, यांग एट अल .30 देखें।
      4. एक रोटरी माइक्रोटोम का उपयोग करके, अनुप्रस्थ विमान में लगातार 5 μm-मोटे खंड काटें। माइक्रोस्कोप स्लाइड के अनुभागों का पालन करें और तटस्थ बालसम का उपयोग करके कवरलिप के साथ माउंट करें।
        नोट: बाकी नमूने कमरे के तापमान पर डेसिकेंट के साथ संग्रहीत किया जाना चाहिए।
      5. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत अनुभागों की जांच और फोटोग्राफ करें औरपहले वर्णित विधि के अनुसार खनिज अपस्थिति दर (एमएआर) और हड्डी गठन दर (बीएफआर / बीएस) की गणना करें।
    2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस।
      1. उपयुक्त पैराफिन अनुभागों का चयन करें और 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
      2. डीवैक्सिंग: 5 मिनट के लिए जाइलीन में अनुभागों को डुबोएं और हर बार ताजा जाइलीन के साथ दो बार दोहराएं।
      3. पुनर्जलीकरण: अनुभागों को 95% इथेनॉल, 75% इथेनॉल, 50% इथेनॉल, और डीडीएच2ओ में क्रमिक रूप से डुबोएं, प्रत्येक 5 मिनट के लिए।
      4. धीरे से 2 x 5 मिनट के लिए 1 x पीबीएस के साथ अनुभागों को धो लें।
      5. एंटीजन पुनर्प्राप्ति: डीडीएच2ओ में ट्रिस-एचसीएल (0.05 एम, पीएच 8.0), ईडीटीए (0.01 एम, पीएच 8.0), और प्रोटीज के (10 μg / mL) के मिश्रण में वर्गों को डुबोएं और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      6. धीरे से 3 x 5 मिनट के लिए 1 x पीबीएस के साथ अनुभागों को धो लें।
      7. ब्लॉक: अनुभागों से अतिरिक्त तरल पदार्थ निकालें और हाइड्रोफोबिक मार्कर का उपयोग करके लक्ष्य क्षेत्र के चारों ओर एक सर्कल खींचें। निरर्थक बंधन को अवरुद्ध करने के लिए, 10% गोजातीय सीरम एल्बुमिन युक्त एक अवरोधक बफर के साथ कवर करें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
        नोट: सावधान रहें कि अनुभागों को बहुत लंबे समय तक न सूखें, ताकि परिणामों को प्रभावित न किया जा सके।
      8. प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन: अनुशंसित एकाग्रता के लिए एंटीबॉडी डिल्यूनेट के साथ एंटी-ऑस्टियोपोंटिन (ओपीएन) एंटीबॉडी को पतला करें, और प्रत्येक नमूने में 30-50 μL जोड़ें; एक ह्यूमिडिफायर कक्ष में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
        नोट: एंटीबॉडी द्रव को वाष्पित होने से रोकने के लिए कक्ष में कुछ पानी छोड़ना और इसे कवर करना सुनिश्चित करें।
      9. धीरे से 3 x 10 मिनट के लिए 1 x पीबीएस के साथ अनुभागों को धो लें।
        नोट: चरण 7.2.2.10-7.2.2.12 अंधेरे में किया जाना चाहिए।
      10. फ्लोरोसेंट सेकेंडरी एंटीबॉडी इनक्यूबेशन: प्राथमिक एंटीबॉडी के अनुरूप एक उपयुक्त फ्लोरोसेंट सेकेंडरी एंटीबॉडी का चयन करें और इसे अनुशंसित एकाग्रता तक पतला करें। प्रत्येक नमूने में 30-50 μL जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
      11. धीरे से 2 x 10 मिनट के लिए 1 x पीबीएस के साथ अनुभागों को धो लें।
      12. नमूनों को माउंट करने के लिए 4'6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (डीएपीआई) के साथ एक एंटीफैड माउंटिंग माध्यम का उपयोग करें। अनुभागों को अंधेरे में स्टोर करें और जितनी जल्दी हो सके उनकी तस्वीर लें।
      13. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी करें जिसमें वर्गों की जांच और फोटोग्राफ करने और रुचि के क्षेत्रों (आरओआई) में सकारात्मक कोशिकाओं की गणना करने के लिए एक डिजिटल कैमरा शामिल है।
  3. ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस का विश्लेषण
    1. टार्टरेट-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (ट्रैप) धुंधला हो रहा है
      1. उपयुक्त पैराफिन अनुभागों का चयन करें। 7.2.2.1-7.2.2.3 चरणों का पालन करते हुए डीवैक्स और रिहाइड्रेट करें।
      2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार ट्रैप स्टेनिंग किट का उपयोग करके ताजा धुंधला समाधान तैयार करें और 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें।
      3. प्रत्येक नमूने में 30-50 μL धुंधला घोल जोड़ें और 20-30 मिनट के लिए एक ह्यूमिडिफायर कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। हर 5 मिनट की जांच करें जब तक कि लाल बहुउद्देशीय ओस्टियोक्लास्ट को प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे नहीं देखा जाता है। ddH2O के साथ प्रतिक्रिया बंद करो।
      4. 30 सेकंड के लिए हेमटोक्सीलिन घोल में काउंटरस्टेन करें और स्थिर नीले रंग के लिए 1 मिनट के लिए 1% अमोनिया घोल में डुबोएं। धीमी गति से चलने वाले नल के पानी के नीचे कुल्ला करें।
      5. न्यूट्रल बालसम का उपयोग करके कवरलिप्स के साथ अनुभागों को माउंट करें और रात भर सूखें।
      6. एक माइक्रोस्कोप के तहत तस्वीरें कैप्चर करें और हमारे पिछले प्रोटोकॉल30 का पालन करते हुए तीन से अधिक नाभिक के साथ ट्रैप-पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
    2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस: इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए अनुशंसित एकाग्रता पर कैथेप्सिन के (सीटीएसके) एंटीबॉडी का उपयोग करें और ऊपर अनुभाग 7 में वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने ऑर्थोडोंटिक बल-संचालित वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग (चित्रा 1 ए, बी) पर एसटीएटी 3 विलोपन के प्रभावों की जांच करने के लिए एक इंड्यूसेबल ओस्टियोब्लास्ट वंश-विशिष्ट स्टेट 3 नॉकआउट माउस (स्टेट 3कोल 1 ए 2 ईआरटी 2) मॉडल स्थापित किया। ओस्टियोब्लास्ट में एसटीएटी 3 विलोपन की पुष्टि वायुकोशीय हड्डी (चित्रा 1 सी) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने से हुई थी।

स्टीरियो माइक्रोस्कोपी ने संकेत दिया कि डब्ल्यूटी चूहों की ओटीएम दूरी डी 4, डी 7 और डी 10 पर बढ़ गई। हालांकि, स्टेट 3Col12ERT2 चूहों में, OTM दूरी कम हो गई थी (चित्रा 2B)। इस घटना की पुष्टि डी 10 पर माइक्रो-सीटी विश्लेषण द्वारा भी की गई थी, यह दर्शाता है कि ओस्टियोब्लास्टिक स्टेट 3 विलोपन ने ओटीएम (चित्रा 2 सी) को कम कर दिया है।

हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए, मैक्सिलरी हड्डी में अनुप्रस्थ खंड में एम 1 की तीन जड़ों के भीतर स्थित क्षेत्र को आरओआई के रूप में परिभाषित किया गया था, जो वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग (चित्रा 3 ए) की समग्र स्थिति को दर्शाता है। हेमटोक्सीलिन-ईओसिन धुंधला और ओपीएन इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला पन आरओआई की पूरी वायुकोशीय हड्डी को दर्शाता है (चित्रा 3 बी, सी)।

ओस्टोजेनिक विश्लेषण के लिए, एलिजारिन लाल और कैल्सीन लेबलिंग ने संकेत दिया कि ऑर्थोडोंटिक बल ने डब्ल्यूटी चूहों में वायुकोशीय हड्डी की खनिज अपपोजिशन दर (एमएआर) में वृद्धि की, लेकिन स्टेट 3कोल 1 2 ईआरटी 2 चूहों के ओटीएम समूह में एमएआर डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में कम हो गया (चित्रा 4 ए)। इसके अलावा, इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग ने प्रदर्शित किया कि ऑर्थोडॉन्टिक बल के तहत ओपीएन + ओस्टियोब्लास्ट की संख्या में वृद्धि हुई है, लेकिन डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में स्टेट 3कोल 1 2 ईआरटी 2 चूहों के ओटीएम समूह में कम ओपीएन + ओस्टियोब्लास्ट थे (चित्रा 4 बी)। ओस्टियोक्लास्टोजेनिक विश्लेषण के लिए, ट्रैप स्टेनिंग ने संकेत दिया कि, ऑर्थोडॉन्टिक बल के तहत, डब्ल्यूटी चूहों में ओस्टियोक्लास्ट की संख्या में वृद्धि हुई, लेकिन डब्ल्यूटी चूहों की तुलना में स्टेट 3कोल 1 2ईआरटी 2 चूहों के ओटीएम समूह में कम ओस्टियोक्लास्ट थे (चित्रा 4 सी)। इस घटना की पुष्टि सीटीएसके (चित्रा 4 डी) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा भी की गई थी। इन परिणामों से पता चला कि ओस्टियोब्लास्टिक स्टेट 3 की कमी ने दांतों के आंदोलन के दौरान ऑर्थोडॉन्टिक बल और बिगड़ा हड्डी रीमॉडेलिंग के जवाब में ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट दोनों की गतिविधि को कम कर दिया।

Figure 1
चित्रा 1: इंड्यूसेबल ओस्टियोब्लास्ट वंश-विशिष्ट स्टेट 3 नॉकआउट माउस मॉडल पीढ़ी का चित्रण। (ए) कोल 1 ए 2 में स्टेट 3 नॉकआउट का योजनाबद्ध आरेख- टैमोक्सीफेन (बाएं) द्वारा प्रेरित ओस्टियोब्लास्ट को व्यक्त करता है। प्रयोग की योजना: 6 सप्ताह के नर जंगली-प्रकार और स्टेट 3कोल 1ईआरटी 2 चूहों को ओटीएम मॉडल निर्माण से पहले एक सप्ताह से हर 2 दिन में टीए (100 मिलीग्राम -1.बीडब्ल्यू) दिया गया और ओटीएम (दाएं) के बाद डी 4, डी 7 और डी 10 पर विश्लेषण के लिए बलिदान दिया गया। (बी) इंड्यूसेबल ओस्टियोब्लास्ट वंश-विशिष्ट स्टेट 3 नॉकआउट चूहों की संकरण प्रगति। (ग) ओटीएम के बाद डी 10 पर डब्ल्यूटी और स्टेट 3कोल 1ईआरटी 2 चूहों की वायुकोशीय हड्डी में एसटीएटी 3 और ओपीएन का डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना और गैर-ओटीएम पक्षों और ओटीएम पक्षों पर डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं की मात्रा का परिमाणीकरण। एन = 5; स्केल सलाखों = 50 μm. यह आंकड़ा गोंग एट अल 26 से है। संक्षेप: एसटीएटी 3 = सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन 3 के उत्प्रेरक; Col1a = कोलेजन 1-अल्फा; टीए = टैमोक्सीफेन; डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; ओटीएम = ऑर्थोडॉन्टिक दांत आंदोलन; ओपीएन = ऑस्टियोपोंटिन; DAPI = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: स्टेट 3 की ओस्टियोब्लास्टिक कमी ने ऑर्थोडोंटिक दांत आंदोलन को धीमा कर दिया (ए) विवो में ओटीएम मॉडल का योजनाबद्ध आरेख। स्प्रिंग छेदक और पहले दाढ़ (एम 1) के बीच स्थित होता है और एम 1 को मेसिअल रिज की ओर ले जाने के लिए ऑर्थोडोंटिक बल को प्रेरित करता है। (बी) डब्ल्यूटी चूहों और स्टेट 3कोल 1 2 ईआरटी 2 चूहों में ओटीएम के बाद डी 0, डी 4, डी 7, और डी 10 की ओटीएम दूरी। (सी) माइक्रो-सीटी द्वारा ओटीएम के बाद डी 10 पर डब्ल्यूटी और स्टेट 3कोल 1 ए 2 ईआरटी 2 चूहों में गैर-ओटीएम पक्षों और ओटीएम पक्षों की प्रतिनिधि छवियां। n = 5. स्केल बार = 1 मिमी (बी), 500 μm (C)। यह आंकड़ा गोंग एट अल.26 का है। संक्षेप: एसटीएटी 3 = सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन 3 के उत्प्रेरक; Col1a = कोलेजन 1-अल्फा; डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; ओटीएम = ऑर्थोडॉन्टिक दांत आंदोलन; एसएजी = धनुविमान। डैश्ड कर्व्स ओटीएम दूरी को इंगित करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: रुचि के क्षेत्रों का चित्रण । (ए) आरओआई के क्षेत्रों का योजनाबद्ध आरेख। मैक्सिला के क्रॉस-सेक्शन में एम 1 की तीन जड़ों के भीतर स्थित डॉटेड क्षेत्र को आरओआई के रूप में चुना गया था। एम 1 की तीन जड़ों में मेसिओबुकल जड़, डिस्टोब्यूकल जड़ और पलाटल जड़ शामिल हैं। (बी) चूहों में एम 1 की पूरी वायुकोशीय हड्डी का धुंधला होना। (सी) चूहों में एम 1 की पूरी वायुकोशीय हड्डी में ओपीएन का इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधलापन। स्केल सलाखों = 200 μm (B), 100 μm (C)। यह आंकड़ा गोंग एट अल.26 का है। संक्षेप: आरओआई = रुचि के क्षेत्र; एमबी = मेसिओबुकल जड़; डीबी = डिस्टोब्यूकल जड़; पी = पालटल जड़; एचई = हेमटोक्सीलिन-ईओसिन; ओपीएन = ऑस्टियोपोंटिन; पीडीएल = पेरियोडोंटल लिगामेंट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: स्टेट 3 बिगड़ा हुआ ऑर्थोडोंटिक बल-प्रेरित हड्डी गठन और पुनरुत्थान की ओस्टियोब्लास्टिक कमी । (ए) ओटीएम के दौरान डब्ल्यूटी और स्टेट 3कोल 1 ए 2 ईआरटी 2 चूहों में कैल्सीन और एलिजारिन रेड एस द्वारा अनुक्रमिक फ्लोरोक्रोम लेबलिंग और खनिज अपस्थिति दरों का परिमाणीकरण। n = 5. (बी) डब्ल्यूटी और स्टेट 3कोल 1 ए 2 ईआरटी 2 चूहों में ओटीएम के बाद डी 10 पर वायुकोशीय हड्डी में इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला पन और ओपीएन + कोशिकाओं का परिमाणीकरण। n = 5. (ग) डब्ल्यूटी और स्टेट 3कोल12ईआरटी2 चूहों में ओटीएम के बाद डी4 पर वायुकोशीय हड्डी में ट्रैप पॉजिटिव कोशिकाओं का ट्रैप धुंधला होना और मात्रा निर्धारित करना। n = 5. (डी) डब्ल्यूटी और स्टेट 3कोल 1 ए 2 ईआरटी 2 चूहों में ओटीएम के बाद डी 4 पर वायुकोशीय हड्डी में सीटीएसके + कोशिकाओं का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला पन और परिमाणीकरण। n = 5. स्केल सलाखों = 10 μm (A), 50 μm (B-D)। यह आंकड़ा गोंग एट अल.26 का है। संक्षेप: एसटीएटी 3 = सिग्नल ट्रांसड्यूसर और ट्रांसक्रिप्शन 3 के उत्प्रेरक; Col1a = कोलेजन 1-अल्फा; डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; ओटीएम = ऑर्थोडॉन्टिक दांत आंदोलन; ओपीएन = ऑस्टियोपोंटिन; DAPI = 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल; ट्रैप = टार्टरेट-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट; एमएआर = खनिज अपपोजिशन दरें; CTSK = कैथेप्सिन K. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

चूंकि मालोक्यूलेशन सांस लेने, मस्ती, बोलने और यहां तक कि उपस्थिति को बाधित करने वाले सबसे आम मौखिक विकारों में से एक है, ऑर्थोडोंटिक्स की मांग दिन-प्रतिदिन बढ़ रही है, पिछले महामारी विज्ञान सर्वेक्षण31,32 के अनुसार घटना 70% से 93% तक बढ़ रही है। ऑर्थोडोंटिक उपचार की दक्षता को सुरक्षित रूप से बढ़ाने के लिए वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग में तेजी कैसे लाई जाए, यह इस क्षेत्र में एक गर्म विषय बन गया है; इसलिए, ओटीएम द्वारा संचालित वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग के तंत्र को स्पष्ट करना आवश्यक है। पिछले अध्ययनों में, शोधकर्ताओं ने पशु मॉडल21,33 में ओटीएम के तंत्र का अध्ययन करने के लिए विवो ड्रग इंजेक्शन में इस्तेमाल किया, जो सरल और आसान था, लेकिन अन्य प्रणालियों की कोशिकाओं पर दवाओं के प्रभाव को खारिज करना मुश्किल था। इसलिए, विवो में ऑर्थोडॉन्टिक बल के तहत हड्डी रीमॉडेलिंग के तंत्र का अध्ययन करना अत्यधिक आवश्यक है।

हाल के वर्षों में, जीन नॉकआउट चूहों का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, जो जीन फ़ंक्शन के अध्ययन औरचिकित्सीय लक्ष्यों की खोज के लिए एक ठोस आधार प्रदान करता है। इन तकनीकों में, पूरे जीन नॉकआउट तकनीक सबसे शुरुआती दृष्टिकोण था। एड्रीनर्जिक रिसेप्टर (एडीआरबी 2) नॉकआउट माउस मॉडल का उपयोग ओटीएम35 के दौरान वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग में सहानुभूति तंत्रिका तंत्र की भूमिका का पता लगाने के लिए किया गया था। हालांकि, कुल जीन-नॉकआउट चूहों के परिणामस्वरूप कुछ मामलों में भ्रूण की घातकता हो सकती है, जिससे जीन फ़ंक्शन के अध्ययन में बाधा आ सकती है। इसलिए, सशर्त नॉकआउट चूहों को विकसित किया गया था, जो विशिष्ट सेल प्रकारों में एक जीन को लक्षित करते थे। हालांकि, क्योंकि वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग से संबंधित शोध अक्सर समय-संवेदनशील होता है, इसलिए, मॉडलिंग के बाद विशिष्ट समय बिंदुओं पर वायुकोशीय हड्डी में परिवर्तन का निरीक्षण करना आवश्यक है।

इंड्यूसेबल सशर्त जीन नॉकआउट चूहों में डीएनए पुनर्संयोजन और ऊतक विशिष्टता के अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण के दोहरे फायदे हैं, और जीन नॉकआउट को दवाओं या हार्मोन के आवेदन के माध्यम से विशिष्ट समय बिंदुओं और विशिष्ट ऊतकों पर प्राप्त किया जा सकता है, जो अनुसंधान आवश्यकताओं को बेहतर ढंग से पूरा कर सकते हैं। इसके अलावा, एसटीएटी 3 एक प्रतिलेखन कारक है जो हड्डी और अन्य ऊतकों में व्यापक रूप से व्यक्त किया जाता है और इसमें कोशिका प्रसार, भेदभाव, एपोप्टोसिस और प्रतिरक्षा और अन्यमहत्वपूर्ण कार्यों को विनियमित करने के कार्य होते हैं। हमने पहले बताया था कि गैर-प्रेरित ओस्टियोब्लास्ट-विशिष्ट स्टेट 3 नॉकआउट चूहों का अस्थि खनिज घनत्व28 कम हो गया था, यह सुझाव देते हुए कि गैर-प्रेरित सशर्त स्टेट 3 नॉकआउट चूहे वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग के यांत्रिक अध्ययन के लिए उपयुक्त नहीं हैं जिन्हें विकास के प्रभाव को बाहर करने की आवश्यकता है।

इसलिए, इस अध्ययन में, हमने क्रे / लॉक्सपी प्रणाली के आधार पर इंड्यूसेबल सशर्त जीन नॉकआउट तकनीक को नियोजित करके टैमॉक्सिफेन-इंड्यूसेबल ओस्टियोब्लास्ट-विशिष्ट स्टेट 3 जीन नॉकआउट चूहों, स्टेट 3कोल 1 ए 2 ईआरटी 2 को उत्पन्न किया, जो समय और स्थान में नियंत्रणीय है और वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग के तंत्र के अध्ययन के लिए अधिक उपयुक्त है, साथ ही वंश अनुरेखण के साथ संयुक्त विशिष्ट कोशिकाओं और जीन के कार्य के आगे के अध्ययन की अनुमति देता है। टैमोक्सीफेन के प्रेरण से पहले, स्टेट 3कोल 12 ईआरटी 2 और जंगली प्रकार के चूहों के बीच कोई स्पष्ट अंतर नहीं था और प्रजनन में कुछ खास नहीं था। हमने पहले पाया है कि Col1a2+ ओस्टियोब्लास्ट में स्टेट 3 के इंड्यूसेबल विलोपन ने हड्डी के गठन को बाधित किया औरवयस्क चूहों में हड्डी द्रव्यमान को कम कर दिया। इस अध्ययन में, गैर-ओटीएम समूहों में स्टेट 3Col12ERT2 चूहों की हड्डी के चयापचय स्तर में कमी आई, जो पिछले परिणामों के अनुरूप थी। इसके अलावा, चूंकि ऑर्थोडोंटिक बल के जवाब में ओटीएम समूह के हड्डी चयापचय स्तर में अधिक महत्वपूर्ण कमी आई है, इसलिए यह माना जा सकता है कि स्टेट 3 ने यांत्रिक बल के तहत हड्डी के चयापचय के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। हमने आगे स्टेट 3 द्वारा विनियमित हड्डी रीमॉडेलिंग के तंत्र का पता लगाया। परिणामों ने संकेत दिया कि स्टेट 3 सीधे ओस्टियोब्लास्ट भेदभाव 28,29 को बढ़ावा दे सकता है और एमएमपी 3 ट्रांसक्रिप्शन 29 के मॉड्यूलेशन के माध्यम से ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट के बीच क्रॉसस्टॉक को विनियमित करके ओस्टियोक्लास्ट भेदभाव को प्रभावित कर सकता है।

इस प्रोटोकॉल में, हमने वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग का मूल्यांकन करने के लिए आरओआई के रूप में चूहों की मैक्सिलरी हड्डी में क्रॉस-सेक्शन में एम 1 की तीन जड़ों के भीतर स्थित क्षेत्र का चयन किया। इस क्षेत्र के साथ, वायुकोशीय हड्डी का विश्लेषण लंबी हड्डियों के करीब है, जिसमें विभिन्न पक्षों की विशेषताओं का विश्लेषण करने की पारंपरिक विधि के बजाय ओस्टियोजेनेसिस और ओस्टियोक्लास्टोजेनेसिस की गतिविधि का विश्लेषण एक ही क्षेत्र में किया जाता है। इसके अलावा, क्लासिक परिकल्पना के अनुसार, दांतों की गति दर में तेजी लाने के लिए विपरीत प्रभाव वाली दो दवाओं को क्रमशः दबाव और तनाव पक्षों पर लागू किया जाना चाहिए। इस पद्धति ने इन बाधाओं पर काबू पाने के लिए एक सैद्धांतिक आधार प्रदान किया। इस ओटीएम मॉडल में, ऑर्थोडॉन्टिक बल के परिमाण को डायनेमोमीटर का उपयोग करके मापा गया था। हालांकि, पहले दाढ़ और छेदक के बीच की दूरी में कमी के साथ बल थोड़ा क्षीण हो जाएगा। इसलिए, अधिक स्थिर और स्थिर ऑर्थोडोंटिक बल उत्पन्न करने के लिए एक मानकीकृत यांत्रिक प्रणाली स्थापित करना आवश्यक है।

प्रोटोकॉल के भीतर, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, ओटीएम मॉडल निर्माण की प्रक्रिया में, पहले दाढ़ और छेदक को मजबूती से बंद किया जाना चाहिए ताकि निष्कासन द्वारा बल आवेदन की विफलता से बचा जा सके। दूसरा, बल की दिशा पर ध्यान दिया जाना चाहिए, और ऊर्ध्वाधर बल के आवेदन के कारण दांत निष्कर्षण से बचने के लिए पहले दाढ़ पर क्षैतिज बल लागू किया जाना चाहिए। अंत में, एम्बेड करते समय, नमूना का अभिविन्यास लक्ष्य क्रॉस-सेक्शन के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए, और आदर्श वर्गों को प्राप्त करने के लिए अभिविन्यास को समायोजित करने के लिए अनुभागों को समय पर देखा जाना चाहिए।

अंत में, हम ओटीएम के एक इंड्यूसेबल, विशिष्ट, जीन नॉकआउट माउस मॉडल के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो विभिन्न समय बिंदुओं पर वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग का खुलासा करता है। हम आगे वंश अनुरेखण के साथ संयुक्त विशिष्ट कोशिकाओं और जीनों के कार्य का अध्ययन करने के लिए इसका उपयोग करेंगे। फिर हमने ओटीएम तंत्र अनुसंधान के क्षेत्र में विवो में एक गतिशील और सेल-विशिष्ट पैटर्न स्थापित किया, जो क्लिनिक में ऑर्थोडोंटिक्स के लिए सबूत पेश करता है। इसके अलावा, यह अध्ययन एक ओटीएम मॉडल के निर्माण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है, जो ओस्टियोब्लास्ट और ओस्टियोक्लास्ट को उत्तेजित करके तेजी से हड्डी रीमॉडेलिंग को सक्षम बनाता है और यांत्रिक बल के जवाब में हड्डी रीमॉडेलिंग के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रदान करता है। इससे भी अधिक, हम कंकाल यांत्रिक जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक नई रणनीति प्रदान करने के लिए ओटीएम के दौरान वायुकोशीय हड्डी रीमॉडेलिंग का विश्लेषण करने के तरीकों का वर्णन करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81870740, 82071083, 82271006, 82101048, 81800949) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; शंघाई के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (21ZR1436900, 22ZR1436700); शंघाई अकादमिक / प्रौद्योगिकी अनुसंधान नेता का कार्यक्रम (20XD1422300); एसएचडीसी की नैदानिक अनुसंधान योजना (SHDC2020CR4084); शंघाई नौवीं पीपुल्स हॉस्पिटल के क्रॉस-डिसिप्लिनरी रिसर्च फंड, शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (JYJC201902, JYJC202116); शंघाई में उच्च स्तरीय स्थानीय विश्वविद्यालयों की नवाचार अनुसंधान टीम (SSMUZLCX20180501); अनुसंधान अनुशासन निधि सं. नौवीं पीपुल्स अस्पताल, शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन, और कॉलेज ऑफ स्टोमेटोलॉजी, शंघाई जिओ टोंग विश्वविद्यालय से KQYJXK2020; शंघाई नौवीं पीपुल्स अस्पताल की मूल अन्वेषण परियोजना, शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (JYYC003); शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन की दो सौ प्रतिभा परियोजना; बायोमटेरियल्स और पुनर्योजी चिकित्सा संस्थान सहकारी अनुसंधान परियोजना शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (2022 एलएचबी02); शंघाई नौवीं पीपुल्स हॉस्पिटल के बायोबैंक की परियोजना, शंघाई जिओ टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (YBKB201909, YBKB202216)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.  P1020
4% paraformaldehyde Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1101
Alizarin red Sigma-Aldrich A5533
Anti-CTSK antibody Santa Cruz sc-48353
Anti-OPN antibody R&D Systems, Minneapolis, MN, USA AF808
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Closed-coil springs Innovative Material and Devices, Shanghai, China CS1006B
Col1α2CreERT2 mice A gift from Bin Zhou, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences.
Dexmedetomidine hydrochloride Orionintie Corporation, Orion Pharma Espoo site
EDTA Beyotime Biotechanology ST069
Embedding tanks Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd 80106-1100-16
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 100092183
ImageJ software NIH, Bethesda, MD, USA
Mounting medium with DAPI Beyotime Biotechanology P0131
Mouse dissection platform Shanghai Huake Experimental Devices and Materials Co., Ltd. HK105
Paraffin Sangon biotech Co., Ltd. A601889
Primers for genotyping Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Cre F-CGATGCAACGAGTGATGAGG; Cre R-CGCATA ACCAGTGAAACAGC
Protease K Sigma-Aldrich 539480
Self-curing restorative resin 3M ESPE, St. Paul, MN, USA 712-035
Stat3fl/fl mice GemPharmatech Co., Ltd D000527
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648
TRAP staining kit Sigma-Aldrich 387A
Tris-HCl Beyotime Biotechanology ST780
Universal tissue fixative Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. G1105
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 10023418
Zoletil VIRBAC 

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References

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