Summary
Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) в различных экстрагонадных тканях и органах связан с патогенезом множественных заболеваний. Овариэктомированная и обработанная ФСГ мышиная модель (OVF) может быть использована для изучения экстрагонадного действия ФСГ.
Abstract
Во время перехода из репродуктивной фазы в нерепродуктивную (менопаузу) у многих женщин наблюдаются значительные физиологические и патологические изменения, включая снижение костной массы, повышение уровня липидов в крови, увеличение висцерального ожирения. Уровень фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) повышается во время менопаузального перехода. Многие исследования показали, что ФСГ в различных экстрагонадных тканях и органах связан с патогенезом множественных заболеваний. Таким образом, создание животной модели, которая может помочь в изучении независимых эффектов ФСГ in vivo , особенно важно. В данном исследовании самкам мышей C57BL/6 была овариоэктомизирована и добавлена эстрадиола валерат (OVX + E2) для устранения эффекта гипоталамо-гипофизарно-гонадной оси. Мыши OVX + E2 получали растворитель (N.S.) или различные дозы рекомбинантного ФСГ через внутрибрюшинную инъекцию для создания мышиной модели (OVF), характеризующейся относительно стабильным эстрогеном и повышением уровня ФСГ. Таким образом, мы успешно создали экспериментальную мышиную модель, имитирующую раннюю стадию менопаузального перехода, характеризующуюся повышенным уровнем ФСГ в сыворотке крови. Модель оптического видоискателя обладает такими преимуществами, как стабильность, низкая стоимость и простота в эксплуатации, что подходит для исследований экстрагонадного действия ФСГ. Здесь мы опишем подробные протоколы для модели оптического видоискателя мыши.
Introduction
Уровень фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) повышается во время менопаузального перехода (термин менопаузальный переход был определен в 2011 году на этапах семинара по репродуктивному старению (система STRAW) + 10)1. Именно во время менопаузального перехода, периода, характеризующегося повышением уровня ФСГ и относительно стабильным эстрогеном1, женщины испытывают изменения менструального цикла и значительные физиологические изменения, затрагивающие различные клетки и ткани. Эти изменения могут серьезно повлиять на качество жизни и здоровье женщин. Изучение эффектов ФСГ может улучшить качество жизни и здоровье женщин.
ФСГ секретируется из гонадотропных клеток передней доли гипофиза и имеет решающее значение для контроля функции и репродукции гонад2. Функция ФСГ опосредована рецептором ФСГ (FSHR), который относится к рецептору, связанному с G-белком (GPCR)3. FSHR обычно экспрессируется в гонадах, а именно в яичнике и яичке. Доказано, что FSHR универсально экспрессируется во многих экстрагонадных клетках и тканях, включая печень4, гиппокамп5, остеокласты6, адипоциты7 и эндотелиальные клетки8. Новые исследования выявили экстрагонадное действие ФСГ и его потенциальную клиническую значимость при дислипидемии4, болезни Альцгеймера5, остеопорозе 9,10, атеросклерозе11, ожирении9 и раке12. Таким образом, создание животной модели, которая может помочь в изучении независимых эффектов ФСГ in vivo, особенно важно при изучении действия только ФСГ.
В протоколе мы ввели процедуру создания мышиной модели с относительно стабильным эстрогеном и повышенным уровнем ФСГ13. Мышиная модель имитирует переход к менопаузе с помощью овариэктомии, а затем добавляется эстрадиола валерат и рекомбинантный ФСГ. Поскольку овариэктомированные мыши были дополнены экзогенным эстрогеном для поддержания уровня эстрогена, аналогичного искусству мышей, уровни эндогенного ФСГ были стабильными из-за обратной связи эстрогена в гипофизе. В этом состоянии он может контролировать уровень ФСГ, вводя экзогенный ФСГ без изменения уровня эстрогена. Таким образом, модель мыши с оптическим видоискателем позволяет исключить влияние эстрогенов и наблюдать экстрагонадные физиологические и патологические эффекты ФСГ. Мы считаем, что детальная и визуализированная процедура полезна для исследователей, чтобы создать модель OVF мыши в своей лаборатории и применить ее для изучения физиологических и патологических изменений во время менопаузы по мере необходимости.
Protocol
Следующий протокол соответствовал всем институциональным этическим принципам, касающимся использования подопытных животных, и был одобрен Комитетом по этике животных в больнице провинции Шаньдун, Китай. Все хирургические манипуляции проводились под глубоким наркозом, и животные не испытывали боли ни на одном из этапов процедуры.
1. Предоперационная подготовка
- Стерилизация инструментов
- Перед операцией стерилизовать хирургические инструменты паром в автоклаве (121°C в течение 15 минут). Подготовьте достаточное количество одноразовых швов и игл.
- Настройка операционной платформы
- Проводите операцию в кабинете, предназначенном для хирургических процедур. Выделите для операции площадь скамьи не менее 60 см х 60 см. Очистите поверхность участка 75% спиртом и накройте одноразовым медицинским полотенцем, а затем продезинфицируйте его ультрафиолетовым излучением за 30 минут до этого (рис. 1А).
- Подготовка животных
- Содержате всех животных в помещении с регулируемой температурой (20-25 °C) с циклом 12 часов света и 12 часов темноты. Акклиматизируйте 8-недельных самок мышей C57BL/6 в условиях содержания в течение 1 недели перед операцией.
- Взвесьте мышей перед операцией. Всем 9-недельным самкам мышей вводят общий наркоз путем внутрибрюшинной инъекции трибромэтанола (280 мг/кг), чтобы добиться безболезненности на любом этапе процедуры. Вводят мелоксикам (2 мг/кг) подкожно примерно за 1 ч до операции для облегчения боли.
- Нанесите глазную мазь, чтобы предотвратить сухость роговицы во время операции.
- Нанесите лосьон для удаления волос на спину с помощью чистого ватного тампона. Оставьте лосьон на мышке на 3-5 минут, затем удалите волосы с помощью марли и ватных палочек. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока все волосы не будут удалены с задней части мыши.
- Используйте марлевые и ватные тампоны, чтобы очистить кожу 75% спиртом. Зафиксируйте мышь на операционной платформе с помощью резиновой полоски или хлопчатобумажной веревки (Рисунок 1B) и нанесите раствор йодофора для очистки спины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед овариоэктомией подтвердите глубину анестезии с помощью щипки пальца ноги.
2. Овариоэктомия
ПРИМЕЧАНИЕ: Трибромэтанол можно поддерживать в течение примерно 30 минут, обеспечивая максимально возможное завершение операции.
- Сделайте продольный разрез на спине ~1,0 см от основания бедра вверх с помощью одноразового скальпеля, следя за тем, чтобы разрезались только кожа и подкожная фасция, и избегая разреза задней брюшины в это время.
- Потяните разрез влево, и можно будет увидеть белую жировую комок. Разрежьте ~0,5 см вдоль белого жирового комка, чтобы обнажить внутрибрюшинную полость с помощью микрощипцов и ножниц.
- После разрезания задней брюшины медленно и осторожно удалите белый жировой комок из внутрибрюшинной полости с помощью микрощипцов. Сразу же смочите белую жировую ткань 0,9% стерильным физиологическим раствором снаружи смоченной марли. Всегда держите открытые ткани влажными, находясь вне брюшной полости.
- Розовое зернистое вещество, а именно завязь, прикрепляется к нижней части белого жирового пакета (рис. 2А). Яичники соединены с тонким протоком, а именно маткой. Используйте рассасывающиеся нити 5-0, чтобы перевязать яичник матки и удалить левый яичник (Рисунок 2B).
- При удалении яичника максимально сохраняйте окружающую жировую ткань. Избегайте прямого контакта хирургических инструментов с яичниками и предотвращайте внутрибрюшинную имплантацию ткани яичника.
- Осторожно поместите белый жировой комок обратно во внутрибрюшинную полость. Выполните простой прерывистый шов на задней брюшине рассасывающимся швом 5-0 (Рисунок 2C). После завершения наложения шва протрите кровотечение 0,9% стерильной марлей, смоченной физиологическим раствором.
- Потяните разрез кожи вправо и удалите правый яичник тем же методом.
- Выполните прерывистый шов с помощью нерассасывающихся нитей 4-0 и очистите кровотечение 0,9% стерильной марлей, пропитанной физиологическим раствором (Рисунок 2D).
- Очистите рану раствором йодофора после наложения обоих швов. Внутрибрюшинно вводят антибиотики широкого спектра действия.
3. Послеоперационное наблюдение
- После операции переместите мышей в одеяло с постоянной температурой 37 °C. До тех пор, пока мыши не смогут свободно двигаться, держите животных в их индивидуальной клетке. Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание, достаточное для поддержания положения грудины.
- Мелоксикам (2 мг/кг) вводят подкожно через 24 ч после операции для облегчения боли.
- Ежедневно наблюдайте за мышами, чтобы убедиться, что операционная рана заживает должным образом, без каких-либо признаков осложнений (расхождения).
4. Прием эстрадиола
- Готовят комбикорм с добавлением эстрадиола валерата. Используйте 2,6 мг бета-эстрадиола 17-валерата с добавкой на 1 кг корма.
- Через 3 дня после завершения операции кормить мышей эстрадиола валератом.
5. Инъекция ФСГ
- Приготовьте рекомбинантный раствор ФСГ человека. Растворить рекомбинантный порошок ФСГ человека для инъекций с 0,9% стерильным физиологическим раствором до 100 МЕ/мл.
- Группировать мышей в соответствии с планами эксперимента и вводить растворитель или различные дозы рекомбинантного ФСГ через внутрибрюшинную инъекцию в течение 2 недель. По биологической активности рекомбинантного ФСГ используют инъекционную дозу ФСГ у мышей, эквивалентную уровню ФСГ в сыворотке крови у женщин в период менопаузы.
Примечание: На основании различных методов лечения, мыши, получавшие овариэктомию с добавлением эстрогена, были случайным образом разделены на три группы: группа растворителей (N.S.), получавшая 100 мкл/сут растворителя, группа с низкими дозами ФСГ (L-FSH), получавшая 15 МЕ/кг массы тела в день, и группа с высокими дозами ФСГ (H-FSH), получавшая 30 МЕ/кг массы тела в день.
Representative Results
Мышиная модель оптического видоискателя имитирует раннюю стадию перехода к менопаузе с относительно стабильным эстрогеном и повышением уровня ФСГ13. Во-первых, для операции по удалению яичников 9-недельным самкам мышей C57BL/6 была введена общая анестезия и подвергнута либо фиктивной операции (Sham), либо двусторонней овариэктомии (OVX). По мере того, как мазки клеток, окрашенных по Папаниколау, четко определяли стадии проэструса, эструса, метэструса и диэструса эстрального цикла, мыши OVX потеряли эстральный цикл (рис. 3А), а метод ИФА показал значительное снижение уровня эстрадиола (Е2) в сыворотке крови (Рисунок 3Б). Во-вторых, мышам OVX добавляли бета-эстрадиол 17-валерат (OVX + E2) для поддержания уровня эстрогена в сыворотке крови на том же уровне, что и в группе Sham. В-третьих, мыши OVX + E2 получали растворитель (N.S.) или различные дозы рекомбинантного ФСГ через внутрибрюшинную инъекцию для создания мышиной модели (OVF), характеризующейся относительно стабильным эстрогеном и повышением уровня ФСГ (рис. 4).
Рисунок 1. Операционная среда и поза мыши. (А) Площадь скамьи не менее 60 см x 60 см для проведения операции. Очистите поверхность участка 75% спиртом и накройте его одноразовым медицинским полотенцем, а затем продезинфицируйте ультрафиолетовым излучением за 30 минут. (B) Закрепите мышь на операционной платформе с помощью резиновой полоски или хлопчатобумажной веревки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Основные этапы хирургической операции. (A) положение яичника, (B) овариоэктомия, (C) наложение швов на брюшину и (D) разрез кожи с наложением швов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Цитология влагалища. Влагалищная цитология представляет собой стадии эстрального цикла и эндогенных эстрогенов у овариэктомированных мышей (OVX) и мышей, прооперированных (Sham; n = 12 для группы Sham; n = 10 для групп OVX). (А) Цитология влагалища представляет собой стадии эстрального цикла в соответствии с относительным присутствием лейкоцитов, ороговевших эпителиальных клеток и ядросодержащих эпителиальных клеток. К стадиям течки относят проэструс, преобладание ядросодержащих эпителиальных клеток; течка, преобладание энуклеированных ороговевших клеток; метэструс, наличие лейкоцитов, ороговевших и ядросодержащих эпителиальных клеток; diestrus, преобладание лейкоцитов. Масштабная линейка = 100 мкм. (B) Эндогенный эстроген у овариэктомизированных мышей (OVX) и мышей, прооперированных (Sham). Данные представлены в виде среднего ± SEM. Для статистического анализа используется t-критерий Стьюдента. С< 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Модель оптического видоискателя и уровни гормонов в сыворотке крови. (A) Блок-схема модели оптического видоискателя. (Б) ИФА-анализ сывороточных концентраций эстрогена (Е2) и ФСГ. Данные представлены в виде среднего ± SEM. Для статистического анализа использовался односторонний ANOVA. * p< 0,05 и ** p< 0,01. Эта цифра была изменена с4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Во время перехода из репродуктивной фазы в нерепродуктивную (менопаузу) у многих женщин наблюдаются значительные физиологические и патологические изменения. Уровень ФСГ повышается во время менопаузального перехода1. Новые исследования показали, что ФСГ в различных экстрагонадных тканях и органах имеет решающее значение в патогенезе многих заболеваний, включая дислипидемию4, болезнь Альцгеймера5, остеопороз 9,10, атеросклероз11, ожирение9 и рак12. Таким образом, создание животной модели, которая может помочь в изучении независимых эффектов ФСГ in vivo, особенно важно. Мышиная модель оптического видоискателя имитирует раннюю стадию перехода к менопаузе с относительно стабильным эстрогеном и повышением уровня ФСГ и особенно подходит для исследований экстрагонадного действия ФСГ.
В этом методе овариоэктомия выполнялась с использованием одного дорсального разреза спины, примерно на 1 см от основания бедра вверх (рис. 1B). Кожа разрезалась почти вместе с тыльными мышцами с помощью острых рассекающих ножниц, и таким образом осуществлялся доступ к брюшной полости. После операции разрез мышцы не требовал наложения швов, а кожная рана закрывалась двусторонне одним кетгутовым швом (рис. 2). Операция технически проще, менее трудоемка и менее вредна для самок мышей по сравнению с другими используемыми методами.
Некоторые детали, на которые следует обратить внимание во время операции. Во-первых, все хирургические процедуры должны содержаться в чистоте и быть как можно более стерильными, чтобы снизить риск послеоперационной инфекции. Во-вторых, из-за того, что ткань яичника очень хрупкая, хирургические инструменты не могут контактировать с яичниками непосредственно во время овариоэктомии, чтобы избежать внутрибрюшинной имплантации. В-третьих, после операции мышей поместили в одеяло с постоянной температурой 37 °C во время восстановления, чтобы предотвратить послеоперационную гипотермию, приводящую к смерти.
Предыдущее исследование доказало, что эндогенный эстроген синтезируется в тека-клетках яичников женщин в пременопаузе или жировых стромальных клетках молочной железы женщин в постменопаузе и в незначительных количествах в периферических тканях14. Уровень эстрогена в сыворотке крови резко снизился у мышей, подвергшихся овариоэктомии, но не может быть устранен (рис. 3B). Однако эндогенный эстроген, синтезируемый в экстрагонадной ткани, не влияет на стабильность уровней эстрогенов в модели OVF (рис. 4B).
Модель оптического видоискателя имеет некоторые ограничения. Если хирургическая операция не является осторожной и приводит к внутрибрюшинной имплантации яичников, это может привести к несостоятельности модели. При этом уровень эстрогена в сыворотке крови не падает резко и колеблется на разных этапах эстрального цикла. После экзогенного введения эстрогена и ФСГ организму требуется примерно 1 неделя, чтобы достичь равновесия. Таким образом, патологические изменения модели оптического видоискателя, происходящие в течение 1 недели, не могут свидетельствовать об эффектах ФСГ.
В заключение следует отметить, что модель оптического видоискателя обладает такими преимуществами, как стабильность, низкая стоимость и простота в эксплуатации. Системные эффекты высокого уровня ФСГ могут наблюдаться после внутрибрюшинного введения ФСГ; то есть модель оптического видоискателя подходит для исследований, изучающих экстрагонадное действие ФСГ. Тем не менее, требования к модельной хирургии и процедурам внутрибрюшинных инъекций достаточно высоки. Если финансирование достаточно, то лучшим выбором будут конкретные нокаут-модели.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотим поблагодарить лабораторию на животных больницы провинции Шаньдун за техническую поддержку. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC 82101645), Фондом естественных наук провинции Шаньдун, Китай (ZR2020QH088) и Планом научно-технической поддержки молодежных инноваций колледжей провинции Шаньдун (2021KJ051).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| beta-estradiol 17-valerate | Macklin | E829824 | |
| Estradiol sensitive ELISA | Demeditec | DE4399 | |
| Hematoxylin Staining Solution | Beyotime | C0107 | |
| Meloxicam | Aladdin | M129228 | |
| recombinant human Follicle-stimulating hormone | Merck Serono | N19Z8803G | |
| Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Aliphatic name: 2,2,2-Tribromoethanol |
References
- Harlow, S. D., et al. Executive summary of the Stages of Reproductive Aging Workshop + 10: addressing the unfinished agenda of staging reproductive aging. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 97 (4), 1159-1168 (2012).
- Ulloa-Aguirre, A., Zariñán, T. The Follitropin Receptor: Matching Structure and Function. Molecular Pharmacology. 90 (5), 596-608 (2016).
- Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Human Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
- Guo, Y., et al. Blocking FSH inhibits hepatic cholesterol biosynthesis and reduces serum cholesterol. Cell Research. 29 (2), 151-166 (2019).
- Xiong, J., et al. FSH blockade improves cognition in mice with Alzheimer's disease. Nature. 603 (7901), 470-476 (2022).
- Sun, L., et al. FSH Directly Regulates Bone Mass. Cell. 125 (2), 247-260 (2006).
- Liu, X. M., et al. FSH regulates fat accumulation and redistribution in aging through the Gαi/Ca(2+)/CREB pathway. Aging Cell. 14 (3), 409-420 (2015).
- Maclellan, R. A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Vascular Anomalies. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3), 344e-351en (2014).
- Liu, P., et al. Blocking FSH induces thermogenic adipose tissue and reduces body fat. Nature. 546 (7656), 107-112 (2017).
- Ji, Y., et al. Epitope-specific monoclonal antibodies to FSHβ increase bone mass. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2192-2197 (2018).
- El Khoudary, S. R., et al. Trajectories of estradiol and follicle-stimulating hormone over the menopause transition and early markers of atherosclerosis after menopause. European Journal of Preventive Cardiology. 23 (7), 694-703 (2016).
- Radu, A., et al. Expression of Follicle-Stimulating Hormone Receptor in Tumor Blood Vessels. The New England Journal of Medicine. 363 (17), 1621-1630 (2010).
- Sowers, M. R., et al. Endogenous hormones and bone turnover markers in pre- and perimenopausal women: SWAN. Osteoporosis International. 14 (3), 191-197 (2003).
- Kristensen, V. N., Kure, E. H., Erikstein, B., Harada, N., Børresen-Dale, A. L. Genetic susceptibility and environmental estrogen-like compounds. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 482 (1), 77-82 (2001).
