Summary
O protocolo apresenta um método não invasivo para o diagnóstico rápido de infecções estomacais pelo Helicobacter pylori através do teste de cordas e determina sua resistência antibiótica à claritromicina e levofloxacina usando a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR).
Abstract
O Helicobacter pylori é um importante patógeno humano que infecta aproximadamente metade da população mundial e está se tornando uma séria ameaça à saúde devido à sua crescente resistência aos antibióticos. É o agente causador de gastrite crônica ativa, úlcera péptica e câncer gástrico e foi classificado como carcinógeno do Grupo I pela Agência Internacional de Pesquisa em Câncer. Portanto, o diagnóstico rápido e preciso do H. pylori e a determinação de sua resistência a antibióticos são importantes para a erradicação eficiente desse patógeno bacteriano. Atualmente, os métodos de diagnóstico do H. pylori incluem principalmente o teste respiratório da ureia (UBT), o teste de antígeno, o teste de anticorpos séricos, a gastroscopia, o teste rápido da urease (RUT) e a cultura bacteriana. Dentre eles, os três primeiros métodos de detecção são não invasivos, ou seja, são testes de fácil realização. No entanto, as bactérias não podem ser recuperadas através dessas técnicas; portanto, o teste de resistência a drogas não pode ser realizado. Os três últimos são exames invasivos, mas são caros, exigem alta habilidade e têm o potencial de causar danos aos pacientes. Portanto, um método não invasivo, rápido e simultâneo para detecção de H. pylori e teste de resistência a drogas é muito importante para a erradicação eficiente do H. pylori na prática clínica . Este protocolo tem como objetivo apresentar um procedimento específico envolvendo o teste de cordas em combinação com a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para a rápida detecção da infecção por H. pylori e resistência a antibióticos. Ao contrário das culturas bacterianas, este método permite o diagnóstico fácil, rápido e não invasivo do estado de infecção por H. pylori e resistência aos medicamentos. Especificamente, usamos qPCR para detectar rea para infecção por H. pylori e mutações nos genes 23S rRNA e gyrA , que codificam resistência contra claritromicina e levofloxacina, respectivamente. Comparado às técnicas de cultivo rotineiramente utilizadas, este protocolo fornece uma técnica não invasiva, de baixo custo e economia de tempo para detectar a infecção por H. pylori e determinar sua resistência a antibióticos usando qPCR.
Introduction
H. pylori é uma bactéria gram-negativa em forma espiral, altamente móvel, que vive principalmente na região do piloro do estômago1. É um patógeno comum que infecta cerca de 50% da população mundial2. A maioria das pessoas com infecção por H. pylori não tem manifestações clínicas, e a maioria desenvolve diferentes doenças após vários anos de infecção, incluindo gastrite crônica, úlceras pépticas, úlceras gástricas e câncer gástrico3. Em vários estudos baseados em diferentes populações, a eficácia da eliminação do H. pylori na prevenção do câncer de estômago e lesões pré-cancerosas tem sido demonstrada 4,5. Por isso, a Agência Internacional de Pesquisa em Câncer da Organização Mundial da Saúde (OMS) tem aconselhado a erradicação do H. pylori como medida preventiva6.
O uso de métodos não invasivos para identificar a infecção por H. pylori é um componente fundamental do tratamento para a maioria dos indivíduos com dispepsia assintomática. O teste respiratório da ureia (UBT), o teste do antígeno fecal do H. pylori (SAT) e o teste sorológico são técnicas não invasivas populares. Dentre estes, a UBT é o procedimento menos intrusivo e mais preciso disponível. A UBT usa urease, abundantemente presente em H. pylori, para hidrolisar ureia marcada isotopicamente em amônia e dióxido de carbono (13C ou 14C). Em contraste, o ensaio imunocromatográfico (ICA)7 é conveniente, simples e não invasivo para amostragem. No entanto, a acurácia do teste é afetada por vários fatores, como a qualidade da amostra de fezes, a temperatura e o intervalo entre a coleta da amostra e o teste. Outro teste baseado na resposta imune é o teste de anticorpos séricos contra H. pylori , que detecta anticorpos no soro do paciente. No entanto, esse teste não é adequado para análise pós-tratamento, uma vez que os anticorpos permanecem por muito tempo após a eliminação da bactéria8. Outra grande desvantagem é que esses métodos apenas diagnosticam a infecção por H. pylori e não permitem testes de resistência a drogas para orientar o tratamento baseado na sensibilidade.
Para métodos de teste invasivos, o tecido da biópsia gástrica precisa ser colhido por endoscopia e, em seguida, submetido à histologia, teste rápido da urease e cultura bacteriana. Esses métodos de teste também são muito limitados devido a vários fatores. Atualmente, essas técnicas são limitadas a pacientes idosos, pacientes com alto risco de doença pré-cancerosa ou maligna e pacientes que falharam na terapia de primeira linha para doença do refluxo gastroesofágico ou infecção por H. pylori9. Em segundo lugar, devido às características únicas de crescimento de H. pylori, a taxa de sucesso da cultura bacteriana atinge apenas 50%10. Assim, os métodos de detecção molecular oferecem uma nova esperança para superar as altas demandas dos métodos de detecção invasivos e orientar o tratamento baseado na sensibilidade. Dentre os métodos de detecção molecular, a PCR quantitativa evoluiu tremendamente nos últimos anos. A qPCR, ao contrário da PCR tradicional, não requer eletroforese em gel e quantifica com precisão o DNA/RNA em amostras adicionando primers e sondas na fase de recozimento. Kits de qPCR para a detecção de infecção por H. pylori e resistência a drogas estão agora disponíveis comercialmente. No entanto, cada método tem suas limitações; Portanto, o diagnóstico clínico e o tratamento de um paciente devem ser considerados em conjunto com seus sintomas, sinais, história, outros exames laboratoriais e resposta ao tratamento.
Atualmente, o principal método de tratamento das infecções por H.pylori é o uso de antibióticos, mas ultimamente, está se tornando cada vez mais difícil tratar essas infecções devido ao aumento da resistência aos antibióticos. Posteriormente, um declínio significativo na eficácia do tratamento do H. pylori foi observado em todo o mundo, tornando a erradicação do H. pylori um importante problema de saúde pública11.
Claritromicina e levofloxacina são os dois antibióticos de amplo espectro usados para tratar infecções causadas por H.pylori, mas vários estudos relataram resistência generalizada contra essas duas drogas em isolados de H.pylori. A2143G, A2142G e A2142C são três das numerosas mutações pontuais encontradas no gene 23S rRNA de 2,9 kb que resultam em resistência à claritromicina, impedindo que o macrolídeo se ligue. Ao mesmo tempo, os loci de mutação do gene de resistência à levofloxacina estão localizados principalmente nos seis sítios de mutação (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) do gene gyrA 12. A descoberta desses mecanismos de resistência baseados em mutações genéticas levou a uma mudança gradual na detecção do H. pylori através de estudos de base cultural para testes moleculares.
Em geral, há uma necessidade clínica urgente de um método diagnóstico não invasivo, eficaz e simultâneo para a detecção de infecções por H. pylori e resistência a drogas. Adotamos um teste combinado de cordas e o método qPCR para superar as dificuldades de amostragem e atingir o objetivo de detecção simultânea de infecção por H. pylori e resistência a drogas usando diferentes sondas de primer.
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Protocol
O presente estudo foi conduzido de acordo com as considerações éticas estabelecidas pelo comitê de ética do Hospital Popular da Província de Guangdong, Southern Medical University, Guangzhou, China (Número de aprovação: KY-Q-2022-384-02). Foram incluídos pacientes na faixa etária de 18 a 60 anos. Pacientes em uso de antibióticos, medicamentos antibacterianos chineses, medicamentos como inibidores da bomba de prótons (IBP) ou antagonistas do receptor H 2, etc., dentro de2 semanas antes do teste não foram incluídos neste estudo. Os pacientes que receberam tratamento contra H.pylori nos últimos 3 meses também foram excluídos deste estudo. Aqueles com problemas cardíacos, hepáticos, renais, neuropatia grave ou doença mental graves também não foram autorizados a participar deste estudo. Não foram incluídas no estudo gestantes e lactantes. Detalhes dos insumos (reagentes, produtos químicos, equipamentos e softwares) utilizados neste estudo são apresentados na Tabela de Materiais.
1. Teste de cordas para amostragem de líquido gástrico
- Solicitar ao paciente que faça jejum durante a noite antes da coleta da amostra.
- No dia seguinte, abra o kit de teste de corda, pegue a cápsula e segure o laço no final da corda.
- Tape o fio na bochecha do paciente e peça-lhe para colocar a cápsula em sua língua perto da parte de trás da garganta e engoli-lo com um gole de água.
- Permitir que a cápsula seja dissolvida no estômago do paciente, expondo assim o fio dentro da cápsula para absorver o muco gástrico.
- Peça a um assistente treinado para puxar a corda cuidadosamente 1 h depois que o paciente engoliu a cápsula.
- Cortar a extremidade inferior da corda (40 cm) embebida no líquido gástrico, colocá-la na solução de preservação da amostra de EET (Tris/soro fisiológico/EDTA) e, em seguida, enviá-la ao laboratório clínico à temperatura ambiente (RT) para a posterior detecção de H. pylori e determinação dos perfis de resistência aos antibióticos usando qPCR.
2. Extração de DNA
- Coloque os tubos de coleta que transportam amostras em um rack de tubo de ensaio, devidamente rotulado, e vote-os por 10 s.
- Vire a placa de 32 poços (kit de extração ou purificação de ácido nucleico) de cabeça para baixo várias vezes para ressuspender as esferas magnéticas. Depois de um vórtice curto por 10 s, remova cuidadosamente a vedação da folha de alumínio da placa.
- Transferir 200 μL de líquido gástrico de cada amostra e DNA de H. pylori como controle positivo para os poços separados.
- Coloque a placa de 32 poços no slot de amostra correspondente da máquina extratora de ácido nucleico para extração automática de DNA.
- Após a extração e confirmação do DNA, iniciar o teste de resistência a antibióticos para claritromicina e levofloxacina através de qPCR nas amostras positivas.
- Coloque o excesso de líquido gástrico e as amostras de DNA extraídas a -20 °C para armazenamento a longo prazo e uso futuro.
- Execute todas essas etapas em um gabinete de biossegurança para evitar qualquer contaminação.
3. qPCR para detecção de H. pylori e resistência a antibióticos (claritromicina e levofloxacina)
- Realizar qPCR para a detecção de H. pylori e as suspeitas de mutações de resistência a antibióticos em seu genoma.
- Descongelar a mistura de reação qPCR (kit de detecção de ácido nucleico H. pylori ) no gelo e misturá-la agitando e girando para evitar qualquer perda de reagente.
- Para cada amostra em uma placa de 32 poços, misturar 20 μL de mistura de reação de PCR (pré-mistura de reação de genotipagem [contendo a enzima Taq, desoxirribonucleosídeo trifosfato, tampão de reação e cloreto de magnésio], com primers ureA forward e reverse e uma sonda ureA ) e 5 μL do DNA extraído.
- Execute a placa qPCR de 32 poços na máquina qPCR. Programar o termociclador: a mistura reacional será primeiramente reagida sequencialmente a 42 °C e 95 °C (ambas para um ciclo) por 2 min cada; em seguida, 40 ciclos a 95 °C, desnaturação por 10 s e recozimento e extensão a 58 °C por 45 s.
- Ajuste a aquisição do sinal de fluorescência para FAM (H. pylori) e a aquisição de dados para o período de extensão da amplificação. Depois que a reação for concluída, salve os dados para análise de resultados futuros.
- Analise os dados usando um software específico para qPCR, pois o instrumento selecionará automaticamente os limiares basais.
- Se o resultado do teste para H. pylori for positivo, a máquina iniciará automaticamente o teste de resistência a medicamentos na amostra. Substitua o kit de reagentes por reagentes de detecção para mutações no gene 23S rRNA e no gene gyrA no kit H. Pylori (qPCR).
NOTA: O kit de reagentes (reagentes de detecção para o gene 23S rRNA e mutações no gene gyrA no Helicobacter pylori [qPCR]) inclui a mistura de reação de PCR (premix de reação de genotipagem [contendo a enzima Taq, desoxirribonucleosídeo trifosfato, tampão de reação, cloreto de magnésio], primers e sondas). Todos os produtos de controle de qualidade negativo são água purificada e estéril. O produto de controle de qualidade positivo no kit de detecção de ácido nucleico de H. pylori é contas padrão de H. pylori inativadas (ATCC 43504). Os produtos de controle de qualidade positivos fortes e positivos fracos do kit (reagentes de detecção para o gene 23S rRNA e mutações no gene gyrA em H. pylori) são o DNA da cepa inativada de H. pylori contendo o gene alvo e o gene mutante. Da mesma forma, com base na situação real, todos os padrões diagnósticos, incluindo a presença de infecção por H. pylori ou resistência a drogas, são ajustados para TC ≤ 35 e têm uma curva típica em forma de S. A concentração do controle de qualidade fraco é de 1,0 x 103 cópias/mL, enquanto a concentração do controle de qualidade forte é de 1,0 x 108 cópias/mL.
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Representative Results
Detecção de infecção por H. pylori e resistência a antibióticos em fluido gástrico por qPCR
Realizamos qPCR para a detecção da infecção por H. pylori amplificando o gene ureA e determinamos seu perfil de resistência a antibióticos visando mutações pontuais no gene 23S rRNA e no gene gyrA (Tabela 1). Os valores de CT de controle de qualidade nos três grupos de experimentos de qPCR estavam dentro da faixa recomendada, indicando que as amostras estavam todas em um estado normal no momento do experimento e que os resultados dos testes eram confiáveis. Neste estudo, cinco amostras com diferentes resultados de testes (S1-S5) foram selecionadas para caracterizar a confiabilidade do protocolo experimental. S1 representa uma cepa representativa de H. pylori sem infecção, enquanto as amostras S2-S5 são aquelas infectadas por H. pylori com diferentes resultados de resistência (Figura 1). Configuramos o sistema para não realizar testes adicionais de resistência com as amostras não infectadas com H. pylori, de modo que a amostra S1 não entrou no teste de resistência depois que o teste do sistema mostrou um resultado negativo para H. pylori. Em relação às amostras positivas para infecção por H. pylori, os valores de S2 CT estavam todos dentro da faixa de detecção, indicando que a amostra era positiva para H. pylori e apresentava dupla resistência à claritromicina e à levofloxacina, e os clínicos foram recomendados a escolher outros métodos de tratamento a seu critério. Os valores de TC de S3 estavam dentro da faixa de detecção de infecção por H. pylori e do teste de resistência à levofloxacina, enquanto nenhum valor de TC foi detectado no teste de resistência à claritromicina, indicando que a amostra de S3 era de um paciente resistente à levofloxacina. Da mesma forma, o valor de TC da amostra de S4 estava dentro da faixa de detecção para infecção por H. pylori e resistência à claritromicina, enquanto nenhum valor de TC foi detectado para resistência à levofloxacina, indicando que esse paciente era resistente à claritromicina, e foi recomendado que eles tomassem levofloxacina para tratamento. Finalmente, o teste da amostra S5 mostrou valores de TC dentro da faixa de detecção apenas para a detecção da infecção por H. pylori, indicando que este paciente era sensível a ambos os antibióticos e poderia ser tratado com qualquer uma das duas drogas. Comparado ao método de cultura bacteriana, que também detecta infecção por H. pylori e resistência a drogas, esse método é seguro e eficaz na detecção de infecção e resistência a drogas por H. pylori sem causar danos ao paciente e pode ser usado para orientar o médico na formulação de um plano de tratamento adequado.
Figura 1: Detecção de H. pylori e sua resistência a antibióticos no líquido gástrico por qPCR.
(A) Amplificação quantitativa por PCR da infecção por H. pylori , (B) detecção de resistência à claritromicina e (C) detecção de resistência à levofloxacina. "S" significa amostra. "S1" é uma amostra que deu negativo para infecção por H. pylori e também foi testada para resistência a antibióticos; "S2" é uma amostra infectada por H. pylori com resistência tanto à claritromicina quanto à levofloxacina; "S3" também é uma amostra positiva para H. pylori, mas é suscetível à claritromicina e resistente à levofloxacina; "S4" também é uma amostra positiva para H. pylori, mas é resistente à claritromicina e suscetível à levofloxacina; "S5" é uma amostra positiva para H. pylori, mas é suscetível tanto à claritromicina quanto à levofloxacina. A concentração do controle de qualidade fraco é de 1,0 x 103 cópias/mL, enquanto a concentração do controle de qualidade forte é de 1,0 x 108 cópias/mL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Amostra | H. pylori | Claritromicina | Levofloxacina | |||
| +/- | CT | +/- | CT | +/- | CT | |
| E1 | - | U | - | U | - | U |
| E2 | + | 22.61 | + | 22.77 | + | 23 |
| E3 | + | 28.32 | - | U | + | 30.18 |
| E4 | + | 28.76 | + | 27.67 | - | U |
| E5 | + | 31.59 | - | U | - | U |
Tabela 1: Tabela mostrando os resultados da qPCR da detecção da infecção por H. pylori e resistência à claritromicina e levofloxacina. Esta tabela apresenta os resultados qualitativos para a infecção por H. pylori , a detecção de mutações no gene 23S rRNA mostrando que o isolado é resistente à claritromicina e a detecção de mutações no gene gyrA mostrando que o isolado é resistente à levofloxacina. +/−, resultado qualitativo; +, resultado positivo; − resultado negativo.
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Discussion
A detecção do H. pylori pode ser realizada por métodos invasivos e não invasivos13. Técnicas invasivas comumente utilizadas, como histopatologia, teste rápido da urease, reação em cadeia da polimerase (PCR) e cultura bacteriana, requerem endoscopia e biópsia. Dentre os procedimentos não invasivos, recomendam-se testes sorológicos, testes respiratórios de ureia e ensaios imunoenzimáticos (ELISA)14. Enquanto os métodos não invasivos são fáceis de executar, econômicos e mais confortáveis para os pacientes, o isolamento e a cultura do H. pylori para realizar ensaios adicionais, como identificação de cepas e testes de sensibilidade a antibióticos, requerem testes invasivos. Com o atual aumento da resistência aos antibióticos, os antibióticos anteriormente utilizados estão se tornando ineficazes e, portanto, falhando no tratamento da infecção causada por isolados de H. pylori resistentes a medicamentos. Neste caso, a recuperação do H. pylori para realizar testes de sensibilidade a antibióticos pode ser necessária para selecionar os antibióticos que provavelmente eliminarão com sucesso as bactérias resistentes.
Ensaios de suscetibilidade baseados em cultura conduzidos rotineiramente, como o método de diluição em ágar e o teste do epsilometro (E-test), têm várias limitações: são demorados, uma vez que o H. pylori é uma bactéria de crescimento lento, dispendiosa, baseada em habilidades e requer técnicas invasivas. Alternativamente, diferentes técnicas moleculares, como as técnicas de hibridização in situ fluorescente (FISH) e qPCR, podem ser usadas para identificar várias mutações, como no gene 23S rRNA, que codifica a resistência à claritromicina15,16. Três sítios de mutação de ponto (A2142G, A2143G, A2142C) do gene de resistência ao RNAr 23S de H. pylori e seis sítios de mutação de ponto (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) do gene de resistência gyrA de antibióticos quinolonas foram selecionados para projetar primers e sondas para determinar a resistência contra claritromicina e levofloxacina, respectivamente.
O teste de cordas, originado do ENTEO-TEST, utiliza uma cápsula presa a um fio de náilon altamente absorvente, que é deglutido para coletar secreções gástricas17. Atualmente, testes de cordas têm sido utilizados para diagnosticar tuberculose18, diferenciar Klebsiella pneumoniae (hvKp) altamente virulenta da Klebsiella pneumoniae tradicional 19, identificar bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e leveduras e diagnosticar H. pylori a partir do líquido gástrico20. Neste estudo, combinamos o teste de cordas, uma técnica minimamente invasiva, com qPCR para a identificação de infecções por H. Pylori em um cenário clínico e realizamos testes de suscetibilidade visando mutações codificadoras de resistência previamente relatadas no genoma do H. pylori. Escolhemos o gene ureA por ser um gene housekeeping exclusivo do H. pylori, sem risco potencial de reação cruzada com outros organismos. Todos os isolados de H. pylori devem ter o gene ureA para sobreviver no estômago humano, e experimentos de nocaute mostraram que H. pylori sem o gene ureA não tem a capacidade de colonizar no estômago.
Para qPCR, os padrões de controle de qualidade são extremamente importantes. Na detecção por qPCR de H. pylori, os requisitos dos padrões de controle de qualidade são os seguintes: um produto de controle de qualidade negativo (nenhum aumento no sinal de fluorescência na via de detecção de FAM, nenhuma curva de amplificação típica do tipo S, valor de TC > 35,00 ou nenhum sinal óbvio); um produto de controle de qualidade positivo (curva de crescimento do sinal de fluorescência da via de detecção de FAM mostrando uma curva em forma de S, valor de CT ≤ 35,00), e os requisitos acima devem ser atendidos simultaneamente; caso contrário, o teste será considerado inválido e precisará ser realizado novamente. Além disso, para a detecção por qPCR da resistência do H. pylori aos antibióticos (claritromicina e levofloxacina), com exceção do valor de CT que distingue entre resultados positivos e negativos, que muda para 30,00 para detecção de resistência, os outros requisitos são os mesmos acima. Notavelmente, as informações de sequência sobre os primers e sondas não estão disponíveis neste artigo porque envolvem direitos de propriedade comercial.
A fim de selecionar antibióticos mais eficientes para cada paciente, é crucial levantar a prevalência local de H. pylori e seu perfil de resistência aos antibióticos devido ao aumento da resistência antimicrobiana globalmente e, adicionalmente, devido à variação nos padrões de resistência entre várias áreas geográficas. A principal limitação do nosso estudo é que o tamanho da amostra foi muito pequeno e não cobriu diferentes regiões geográficas na China para mostrar a prevalência da infecção por H. pylori e seu perfil completo de resistência aos antibióticos, mas a técnica de teste de cordas está bem desenvolvida e, combinando-a com a qPCR, obtivemos o diagnóstico simultâneo de H. pylori detecção de infecção e resistência a drogas. Esses resultados sugerem que essa abordagem poderia ser utilizada em maior escala em diferentes regiões do mundo.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Sanming Project of Medicine em Shenzhen (Grant No. SZSM201510050) e a Fundação de Investigação Básica e Básica Aplicada de Guangdong (Bolsa n.º 2022A1515220023). Fundação de Pesquisa para Talentos Avançados do Hospital Popular Provincial de Guandong (No. KJ012021097), e a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81871734, 82072380, 82272423). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, na coleta e análise dos dados, na decisão de publicar ou na preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin | |
| ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20163220767 | Fluorescent quantitative PCR amplification |
| ABI 7500 software | Thermo Fisher Scientific | Data Analysis | |
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | Biosafety cabinet |
| DNA extraction kit | Daan Gene | ||
| E-Centrifuge | WEALTEC | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. | |
| H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Testing for H. pylori infection | |
| Stream SP96 automated nucleic acid extractor | Daan Gene | SEDA 20140104 | For DNA extraction |
| String test kit | Hongmed Infagen | It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube | |
| Ultra-low temperature freezers (DW-YL450) | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C for storing reagents |
| Vortex-5 | Kylin-bell | For mixing reagent |
References
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