Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Drosophila melanogaster Kullanarak Yaşa Bağlı Uyku Bozuklukları İçin Yüksek Verimli Küçük Moleküllü İlaç Taraması

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65787
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1School of Life Science and Technology, Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University

Summary

Sunulan, yaşlı bir Drosophila modelinde meyve sineklerinin uyku davranışını izleyerek uykuyu iyileştirmek için yüksek verimli ilaç taraması için bir protokoldür.

Abstract

Sağlığın ve genel refahın önemli bir bileşeni olan uyku, genellikle kısa uyku süresi ve parçalanmış kalıplarla karakterize uyku bozuklukları yaşayan yaşlı bireyler için zorluklar sunar. Bu uyku bozuklukları ayrıca yaşlılarda diyabet, kardiyovasküler hastalıklar ve psikolojik bozukluklar dahil olmak üzere çeşitli hastalık riskinin artmasıyla da ilişkilidir. Ne yazık ki, uyku bozuklukları için mevcut ilaçlar, bilişsel bozukluk ve bağımlılık gibi önemli yan etkilerle ilişkilidir. Sonuç olarak, yeni, daha güvenli ve daha etkili uyku bozukluğu ilaçlarının geliştirilmesine acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Bununla birlikte, mevcut ilaç tarama yöntemlerinin yüksek maliyeti ve uzun deneysel süresi sınırlayıcı faktörler olmaya devam etmektedir.

Bu protokol, memelilere kıyasla yüksek oranda korunmuş bir uyku düzenleme mekanizmasına sahip bir tür olan Drosophila melanogaster'ı kullanan ve onu yaşlılarda uyku bozukluklarını incelemek için ideal bir model haline getiren uygun maliyetli ve yüksek verimli bir tarama yöntemini tanımlar. Yaşlı sineklere çeşitli küçük bileşikler uygulayarak, uyku bozuklukları üzerindeki etkilerini değerlendirebiliriz. Bu sineklerin uyku davranışları kızılötesi izleme cihazı kullanılarak kayıt altına alınmakta ve açık kaynak kodlu veri paketi Uyku ve Sirkadiyen Analiz MATLAB Programı 2020 (SCAMP2020) ile analiz edilmektedir. Bu protokol, uyku regülasyonu için düşük maliyetli, tekrarlanabilir ve verimli bir tarama yaklaşımı sunar. Meyve sinekleri, kısa yaşam döngüleri, düşük yetiştirme maliyetleri ve kullanım kolaylıkları nedeniyle bu yöntem için mükemmel konular olarak hizmet eder. Örnek olarak, test edilen ilaçlardan biri olan Reserpine, yaşlı sineklerde uyku süresini artırma yeteneğini gösterdi ve bu protokolün etkinliğini vurguladı.

Introduction

İnsanın hayatta kalması için gerekli olan temel davranışlardan biri olan uyku, iki ana durumla karakterize edilir: hızlı göz hareketi (REM) uykusu ve hızlı olmayan göz hareketi (NREM) uykusu1. NREM uykusu üç aşamadan oluşur: N1 (uyanıklık ve uyku arasındaki geçiş), N2 (hafif uyku) ve N3 (derin uyku, yavaş dalga uykusu), uyanıklıktan derin uykuyailerlemeyi temsil eder 1. Uyku hem fiziksel hem de zihinsel sağlıkta çok önemli bir rol oynar2. Bununla birlikte, yaşlanma yetişkinlerde toplam uyku süresini, uyku verimliliğini, yavaş dalga uyku yüzdesini ve REM uyku yüzdesini azaltır3. Yaşlı bireyler, yavaş dalga uykusuna kıyasla hafif uykuda daha fazla zaman geçirme eğilimindedir ve bu da onları gece uyanmalarına karşı daha duyarlı hale getirir. Uyanma sayısı arttıkça, ortalama uyku süresi azalır, bu da yaşlılarda parçalanmış bir uyku düzenine neden olur, bu da farelerdeHcrt nöronlarının aşırı uyarılmasıyla ilişkili olabilir 4. Ek olarak, sirkadiyen mekanizmalarda yaşa bağlı düşüşler, uyku süresinde daha erken bir kaymaya katkıda bulunur 5,6. Fiziksel hastalık, psikolojik stres, çevresel faktörler ve ilaç kullanımı ile birlikte, bu faktörler yaşlı yetişkinleri uykusuzluk, REM uykusu davranış bozukluğu, narkolepsi, periyodik bacak hareketleri, huzursuz bacak sendromu ve uykuda solunum bozukluğu gibi uyku bozukluklarına karşı daha duyarlı hale getirir 7,8.

Epidemiyolojik çalışmalar, uyku bozukluklarının yaşlılardadepresyon 10, kardiyovasküler hastalık11 ve demans12 dahil olmak üzere kronik hastalıklarla 9 yakından bağlantılı olduğunu göstermiştir. Uyku bozukluklarının ele alınması, kronik hastalıkların iyileştirilmesinde ve tedavi edilmesinde ve yaşlı yetişkinler için yaşam kalitesinin artırılmasında çok önemli bir rol oynar. Şu anda, hastalar uyku kalitesini artırmak için öncelikle benzodiazepinler, benzodiazepin olmayanlar ve melatonin reseptör agonistleri gibi ilaçlara güvenmektedir13. Bununla birlikte, benzodiazepinler, uzun süreli kullanımdan sonra reseptörlerin aşağı regülasyonuna ve bağımlılığa yol açabilir ve kesilme üzerine ciddi yoksunluk semptomlarına neden olabilir14,15. Benzodiazepin olmayan ilaçlar da demans16, kırıklar17 ve kanser18 dahil olmak üzere riskler taşır. Yaygın olarak kullanılan melatonin reseptörü agonisti ramelteon, uyku gecikmesini azaltır, ancak uyku süresini artırmaz ve kapsamlı ilk geçiş eliminasyonu nedeniyle karaciğer fonksiyonuyla ilgili endişeleri vardır19. Bir melatonin reseptörü agonisti ve serotonin reseptör antagonisti olan Agomelatin, depresyona bağlı uykusuzluğu iyileştirir, ancak aynı zamanda karaciğer hasarı riski taşır20. Sonuç olarak, uyku bozukluklarını tedavi etmek veya hafifletmek için daha güvenli ilaçlara acil ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, otomatik sistemler ve bilgisayar analizi ile birleştirilmiş moleküler ve hücresel deneylere dayanan mevcut ilaç tarama stratejileri pahalı ve zaman alıcıdır21. Reseptör yapısına ve özelliklerine dayanan yapıya dayalı ilaç tasarım stratejileri, reseptör üç boyutlu yapısının net bir şekilde anlaşılmasını gerektirir ve ilaç etkileri için öngörü yeteneklerinden yoksundur22.

2000 yılında, Campbell ve Tobler tarafından 1984'te önerilen uyku kriterlerine dayanarak 23, araştırmacılar, uyku benzeri durumlar sergileyen Drosophila melanogaster de dahil olmak üzere uyku24'ü incelemek için basit hayvan modelleri oluşturdular25,26. Drosophila ve insanlar arasındaki anatomik farklılıklara rağmen, Drosophila'da uykuyu düzenleyen birçok nörokimyasal bileşen ve sinyal yolu memeli uykusunda korunur ve insan nörolojik hastalıklarının incelenmesini kolaylaştırır27,28. Drosophila, sinekler ve memeliler arasındaki çekirdek osilatörlerindeki farklılıklara rağmen, sirkadiyen ritim çalışmalarında da yaygın olarak kullanılmaktadır 29,30,31. Bu nedenle Drosophila, uyku davranışını incelemek ve uyku ile ilgili ilaç taraması yapmak için değerli bir model organizma olarak hizmet eder.

Bu çalışma, yaşlı sinekler kullanılarak uyku bozukluklarını tedavi etmek için küçük moleküllü ilaçların taranması için uygun maliyetli ve basit fenotipe dayalı bir yaklaşım önermektedir. Drosophila'da uyku regülasyonu yüksek oranda korunur25 ve yaşla birlikte gözlenen uykudaki düşüş ilaç uygulaması ile geri dönüşümlü olabilir. Bu nedenle, bu uyku fenotipine dayalı tarama yöntemi, ilaç etkinliğini sezgisel olarak yansıtabilir. Sinekleri incelenen ilaç ve yiyecek karışımı ile besliyoruz, Drosophila Activity Monitor (DAM)32 kullanarak uyku davranışını izliyor ve kaydediyoruz ve elde edilen verileri MATLAB'daki açık kaynaklı SCAMP2020 veri paketini kullanarak analiz ediyoruz (Şekil 1). İstatistiksel analiz, istatistik ve grafik yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Örnek olarak, uykuyu arttırdığı bildirilen veziküler monoamin taşıyıcının küçük moleküllü bir inhibitörü olan Reserpin hakkında deneysel veriler sunarak bu protokolün etkinliğini gösteriyoruz33. Bu protokol, yaşa bağlı uyku problemlerini tedavi etmek için ilaçları tanımlamak için değerli bir yaklaşım sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokol, Bloomington Drosophila Stok Merkezi'nden 30 günlük w1118 sineğini kullanır (BDSC_3605, bkz.

1. Yaşlı meyve sineklerinin hazırlanması

  1. Yemek hazırlama
    1. 50 g/L mısır gevreği, 110 g/L şeker, 5 g/L agar ve 25 g/L mayayı karıştırarak standart mısır nişastası kültür ortamını hazırlayın. Mısır gevreğini ve mayayı jelatinleştirmek için suyla ısıtın ve ardından tüm maddeleri tamamen çözün.
    2. Ortam 50-60 °C'ye soğuduğunda, 6 mL/L propiyonik asit ekleyin ve bunları hemen kültür şişelerine koyun.
  2. Sinek yetiştiriciliği ve yaşlı sineklerin hazırlanması
    1. Sinek suşunu w 1118'i standart bir mısır nişastası kültürü ortamı içeren şişelerde üretin ve şişeleri 25 ° C'de,% 68 bağıl nemde, 500-1000 lüks aydınlatma koşullarında ve 12 saat: 12saat ışıkta sabit sıcaklıkta bir inkübatöre koyun: karanlık döngü.
    2. Sineklerin büyüme döngüsüne göre sinekleri her 7 günde bir yeni bir şişeye aktarın ve aynı şişedeki bireylerin yaşını tutarlı tutun.
    3. Orijinal şişeden çıkan yeni sinek grubunu aktardıktan 3 gün sonra toplayın ve yeni bir şişeye koyun. Şişeyi her 7 günde bir değiştirme prensibine göre, yaklaşık 30 günlük olana kadar kültürleneceklerdir.

2. İzleme için tıbbi gıda ve cam tüplerin hazırlanması

NOT: Cam tüp hazırlama prosedürü, Jin ve ark.modifikasyonlarla 34.

  1. Cam tüplerin temizlenmesi ve kurutulması
    1. Cam tüpü (5 mm çap x 65 mm uzunluk, Malzeme Tablosuna bakın) büyük bir behere yerleştirin, ıslatın ve çift damıtılmış su ile 20 dakika kaynatın. 3 kez tekrarlayın.
    2. Cam tüpü çıkarın ve paketleyin, içini 3-5 kez çift damıtılmış suyla durulayın ve kuruması için fırına koyun.
  2. Basit kültür ortamının hazırlanması (100 mL)
    1. 1.5 g agar ve 5 g sükrozu çift damıtılmış suda çözün, ısıtın ve 100 mL'ye konsantre edin.
    2. Ortam yaklaşık 70 °C'ye soğuduğunda 600 μL propiyonik asit ekleyin ve sabit sıcaklıkta bir su banyosu kullanarak katılaşmasını önleyin.
    3. İlaç 20 μM veya 50 μM'ye ulaşana kadar 10 mL'lik küçük bir behere yaklaşık 4 mL basit ortam ve Reserpin (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
  3. İlaç içeren cam tüplerin hazırlanması
    1. Ortamın akışını kolaylaştırmak için, uygun uzunlukta bir cam tüpü küçük bir behere dikkatlice yerleştirin. Ortam, atmosferik basınç nedeniyle doğal olarak cam tüpe girecektir.
    2. Kültür ortamı tamamen katılaştığında cam tüpü dışarı çekin ve bir ucunda ilaç içeren bir kültür ortamı bulunan bir izleme cam tüpü elde etmek için dış duvarı silin.
    3. Katı parafini bir beherde 70 °C'de eriyene kadar ısıtın, cam tüpün ucunu yiyeceğe yakın bir yerde yaklaşık 5 mm parafin sıvısına koyun ve hızlıca çıkarın. Cam tüpün yiyecek ucunu kapatmak için parafinin katılaşmasını bekleyin.

3. Deneysel tasarım ve sinek tedavisi

  1. Tablo 1'i takip ederek sinek tedavisi için deneyi tasarlayın.

4. Drosophila montajı ve uyku izleme

NOT: Drosophila montajı prosedürü, Jin ve ark.34'ün çalışmalarını değişikliklerle takip eder.

  1. Sinekleri CO2 gazı ile uyuşturun, parafinle kapatılmış cam tüplere (tüp başına bir tane) koyun ve sineklerin kaçmasını önlemek ve hava sirkülasyonunu sağlamak için gıda dışı ucunu emici bir pamuk top ile bloke edin.
  2. Tüpleri izlemek için kızılötesi monitöre yükleyin.
    1. Sinek içeren cam tüpleri aynı yönde bir kızılötesi monitöre monte edin ve her ilaca karşılık gelen monitör numarasını ve delik numarasını kaydedin.
    2. Her tüpün hizalamasını ayarlayın ve kızılötesi ışınların sineğin aktivite aralığının merkezinden dikey olarak geçmesini sağlayın.
    3. Monitörü, belirtilen ayarları izleyerek sinek uykusu karanlık odasında bulunan 25 °C'lik bir inkübatörün içine yerleştirin: 25 °C sıcaklık, Zeitgeber 12 (ZT12) (yerel saat 08:00'e eşdeğer) ve ZT24 (yerel saat 08:00'e eşdeğer). Bu kurulum, sineklerin 12 saatlik aydınlık ve karanlık dönemlerini dönüşümlü olarak deneyimlemelerini sağlar.
      NOT: İzleme sırasında inkübatörde sabit bir ortam sağlamak için izleme verilerinin toplanması tamamlanana kadar kapıyı açmamaya çalışın.
    4. DAM2 sistemini kullanarak izlemeye başlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
    5. İzleme tamamlandıktan sonra, toplanan verileri sistemden .txt formatında indirin.

5. Veri işleme

NOT: DAM sistemi, DAMFileScan107 ve SCAMP kullanılarak veri işleme, resmi web sitelerindeki talimatlara göre gerçekleştirilmiştir (bkz.

  1. Yukarıdaki txt dosyasını taramak için DAMFileScan107 yazılımına aktarın ve uyku verilerini elde etmek için gerektiği gibi bölün.
    1. Segmentasyon verilerinin başlangıç saatini, monitörleri başlattıktan sonraki üçüncü sabah 8:01 (1 dakikalık segmentasyon) veya 8:00 (30 dakikalık segmentasyon) olarak ayarlayın ve sonlandırma saati, başlangıç saatinden üç gün sonra 8:00'dir (Şekil 2A1).
      NOT: Sinekler en az bir gün boyunca izleme ortamına uyum sağlamalıdır. Böylece, bölünmüş veri başlangıç saati, monitör başladıktan sonraki üçüncü gün sabah 8'e ayarlanabilir.
    2. Verileri 1 dakika ve 30 dakika aralıklarla bölün. "Bin Uzunluğu" seçeneğini 1 dakika olarak değiştirin, "Çıktı Dosyası Türü" seçeneğini Kanal dosyaları, yeniden adlandırın ve çıktı olarak değiştirin. 30 dakikalık veri segmentasyon yöntemi yukarıdakiyle aynıdır (Şekil 2A2-5).
      NOT: 1 dakika ve 30 dakika aralıklarla veri segmentasyonu gerçekleştirirken, iki dosyanın son yeniden adlandırılması tutarlı olmalıdır; aksi takdirde, sonraki Matlab işlemleri sırasında okunamayabilir. Gerekirse, farklılaştırmayı kolaylaştırmak için çıktıdan sonra dosya adı değiştirilebilir.
  2. SCAMP2020 kullanarak veri işleme
    1. Matlab'da SCAMP2020 program paketini açın ve Vecsey Uyku ve Sirkadiyen Analiz MATLAB Programı (SCAMP) üzerine çift tıklayın (Şekil 2B).
    2. Yola "Vecsey SCAMP Scripts" alt klasörünü ekleyin, bu klasörde "scamp.m" dosyasını bulun ve çalıştırın. Aşağıdaki açılır pencerede, sırayla 1 dakika ve 30 dakika klasörlerini seçin (Şekil 2C,D).
    3. Bir monitör seçin, Bireysel yükle'ye tıklayın Önizlemek için Grafiklere bakın (Şekil 3A1) ve görünen görüntüyü kontrol edin. İlgili ölü sinek kanalının işaretini kaldırın (Şekil 3A2, Şekil 3B).
    4. Tüm monitörleri kontrol etmek için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
    5. Her monitördeki her kanalı, test edilecek ilgili ilaca göre yeniden adlandırın (Şekil 3A3), tüm monitörleri seçin ve analiz için Seçilen Verileri ANALİZ ET'e tıklayın (Şekil 3A4).
    6. Varsayılan olarak seçilen seçenek, Seçilen Bölme için Analiz Et'e tıklayın, Verileri Dışa Aktar'ı işaretleyin ve son olarak sonuçların çıktısını almak için GRAPH 30 dk Seçili Gruplar için Tüm Günler için Veri Türleri ve Tüm Verileri İHRACAT üzerine tıklayın (Şekil 3C).
  3. CSV dosyasından s30 adlı dosyayı seçin, her monitör için karşılık gelen ortalama değeri ve standart hata verilerini bulun, değişiklik ve ayarlama için Excel'e yedekleyin ve bir uyku durumu diyagramı çizmek için GraphPad Prism'e yapıştırın (Malzeme Tablosuna bakın) (Şekil 4A,B).
  4. "Stdur" adlı dosyayı bulun ve üç gün içinde her sinek için gündüz, gece ve toplam uykunun ortalama değerlerini hesaplayın (Şekil 4A, C). Fark testini tamamlamak ve bir grafik çizmek için verileri Prism yazılımına yapıştırın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reserpin, monoaminlerin presinaptik veziküllere geri alımını inhibe eden ve uykunun artmasına neden olan veziküler monoamin taşıyıcısının (VMAT) küçük moleküllü bir inhibitörüdür33. Reserpin'in uykuyu teşvik edici etkileri 30 günlük sineklerde incelendi ve kontrol grubu sadece çözücü dimetil sülfoksit (DMSO) ile beslendi. Reserpin grubunda, yaşlı sinekler, DMSO grubuna kıyasla hem gündüz hem de gece boyunca önemli ölçüde artmış uyku sergiledi. Şekil 5A, E, Reserpin ve DMSO sineklerinin art arda üç gün boyunca uyku düzenlerini gösterirken, Şekil 5B-D ve Şekil 5F-H, uyku verileri üzerindeki diferansiyel testin sonuçlarını göstermektedir. İlacın yalnızca bir cinsiyete etki etme olasılığını ortadan kaldırmak için, deneyler erkek sinekler kullanılarak tekrarlandı. 20 μM ve 50 μM olmak üzere farklı Reserpin konsantrasyonları uygulandı ve bu da Reserpin konsantrasyonu ile uykunun teşviki arasında pozitif bir korelasyon olduğunu gösterdi.

Figure 1
Şekil 1: Yaşa bağlı uyku bozuklukları için küçük moleküler ilaç taraması deneysel süreci. Yaşlı sinekler, test edilecek ilaçları içeren yiyeceklerle birlikte küçük bir cam tüpe yerleştirildi. Uyku düzenleri DAM Sistemi kullanılarak üç gün boyunca sürekli olarak izlendi. Elde edilen veriler, işleme, görselleştirme ve analiz için bir bilgisayara aktarıldı ve sonuçlara yol açtı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Verilerin taranması ve bölünmesi . (A) Veri seçimi ve tarama, ardından sıralı zamansal segmentasyon. (B) "Vecsey Uyku ve Sirkadiyen Analizi MATLAB Programı (SCAMP)" klasörünün konumu. (C) Yola "Vecsey SCAMP Scripts" alt klasörünün eklenmesi. (D) "scamp.m" dosyasının konumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Uyku verilerinin seçimi ve işlenmesi . (A) Sinek uyku koşullarının önizlemesi, ölü sinekler için kanalın işaretini kaldırma ve seçilen verilerin gruplandırılması ve analiz edilmesi. (B) Tek tip mavi bir dikdörtgenin aktif uykuyu gösterdiği, tek tip mavi bir dikdörtgenin belirli bir anının sineğin öldüğünü gösterdiği Drosophila uykusunun önizlemesi. Ölü sinekler kırmızı dikdörtgenlerle işaretlenmiştir. (C) Seçilen verilerin analizi ve çıktısı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Uyku verileri analizinin sonuçları . (A) CSV dosyasından s30 ve stdur dosyalarının seçimi. (B) "s30.csv" daki her grup için ortalama uyku değerinin (SEM) ortalama değeri ve standart hatası. (C) Gündüz (Bin1, Bin3, Bin5), gece (Bin2, Bin4, Bin6) ve "stdur.csv" cinsinden üç gün içinde her sinek için toplam uyku değerleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Reserpin ile tedavi edilen yaşlı sineklerin uyku koşulları. (A)% 0.2 DMSO, 20 μM Reserpin ve 50 μM Reserpin ile beslenen yaşlı kadınlarda 3 gün içindeki uyku süresinin şematik gösterimi. (B-D) İlaçlı veya ilaçsız 3 gün içinde ortalama gündüz, gece ve toplam uyku süresinin kantitatif analizi. Sonuçlar, Reserpin ile beslenen yaşlı kadınlarda uyku süresinde önemli bir artış olduğunu göstermektedir. Her grup için N = 8, Tek yönlü ANOVA, **p < 0.01, ***p < 0.001. (E)% 0.2 DMSO, 20 μM Reserpin ve 50 μM Reserpin ile beslenen yaşlı erkeklerde 3 gün içinde uyku süresinin şematik gösterimi. (F-H) İlaçlı veya ilaçsız 3 gün içinde ortalama gündüz, gece ve toplam uyku süresinin kantitatif analizi. Sonuçlar, Reserpin ile beslenen erkeklerde uyku süresinin arttığını göstermektedir. n = 16 her grup için, Tek yönlü ANOVA, *p < 0.05, **p < 0.01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Genç ve yaşlı sinekler arasındaki uyku süresinin karşılaştırılması. (A) Genç ve yaşlı erkeklerde 3 gün boyunca uyku süresinin izlenmesini gösteren şematik diyagram. (B-D) Genç ve yaşlı erkeklerde 3 gün boyunca ortalama gündüz, gece ve toplam uyku süresinin kantitatif analizi anlamlı bir fark ortaya koymadı. n = 32 her grup için, eşleşmemiş t-testi, n.s., anlamlı değil. (E) Genç ve yaşlı kadınlarda 3 gün boyunca uyku süresinin şematik olarak izlenmesi. (F-H) Genç ve yaşlı kadınlarda 3 gün boyunca ortalama gündüz, gece ve toplam uyku süresinin kantitatif analizi, yaşlı kadınlarda genç kadınlara kıyasla gündüz, gece ve toplam uyku süresinde önemli bir azalma olduğunu göstermiştir. n = 32 her grup için, eşleştirilmemiş t-testi, ****p < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Grup Çalışma grubu Muamele Sineklerin yaşı ve cinsiyeti Sinek sayısı
Equation 1 Normal kontroller 4 gün boyunca% 0.2 DMSO içeren 4 mL basit kültür ortamı 30 gün erkek/kadın Grup başına 16 uçuş
Equation 2 Düşük doz uyuşturucu testiEquation 6 4 gün boyunca 20 μM reserpin içeren 4 mL basit kültür ortamı 30 gün kadın Grup başına 16 uçuş
Equation 3 Yüksek doz uyuşturucu testiEquation 6 4 gün boyunca 50 μM reserpin içeren 4 mL basit kültür ortamı 30 gün kadın Grup başına 16 uçuş
Equation 4 Düşük doz uyuşturucu testiEquation 7 4 gün boyunca 20 μM reserpin içeren 4 mL basit kültür ortamı 30 günlük erkekler Grup başına 16 uçuş
Equation 5 Yüksek doz uyuşturucu testiEquation 7 4 gün boyunca 50 μM reserpin içeren 4 mL basit kültür ortamı 30 günlük erkekler Grup başına 16 uçuş

Tablo 1: Sinek tedavisi için deneysel tasarım.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tarif edilen yöntem, küçük ve orta ölçekli uyku ilaçlarını hızlı bir şekilde taramak için uygundur. Şu anda, çoğu ana akım yüksek verimli ilaç tarama yöntemi biyokimyasal ve hücresel seviyelere dayanmaktadır. Örneğin, reseptörün yapısı ve özellikleri, ona bağlanabilen spesifik ligandları aramak için incelenir22. Başka bir yaklaşım, kütle spektrometresi35 ile Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) kullanılarak seçilen ilaçların moleküler fragmanlarının bağlanma modunu ve gücünü analiz etmeyi içerir. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle nispeten yüksek bir tarama hatası oranına sahiptir ve bunlar aracılığıyla seçilen ilaçlar genellikle hayvan veya klinik deneylerde hiçbir etki göstermez. İlaçların vücuttaki etkinliği, ilaç emilimi, dağılımı, metabolizması ve atılımı gibi çeşitli faktörlerden etkilenir ve bu da yüksek oranda yanlış taramaya yol açar. Buna karşılık, önerdiğimiz yöntem, yüksek verimli yöntemlere kıyasla daha küçük bir tarama ölçeğine sahip olmasına rağmen, fenotipler üzerindeki ilaç etkilerini doğrudan gözlemleyerek daha basit ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunmaktadır. Bu, etkili ilaç taraması ve ilaç hedeflerinin belirlenmesi için Drosophila modelinin kullanılma potansiyelini göstermektedir.

Drosophila , korunmuş bir uyku düzenleme mekanizmasına sahiptir ve yaşlanma ile ilişkili uyku bozuklukları sergiler. 30 günlük dişi sineklerin uyku süresinin 7 günlük sineklere göre anlamlı olarak daha kısa olduğunu, 30 günlük erkek sineklerin ise uyku süresinin 7 günlük sineklere göre anlamlı farklılık göstermediğini gözlemledik (Şekil 6). Sonuç olarak, mevcut deneyler için 30 günlük dişi sinekler seçildi. Kazara faktör girişimini en aza indirmek için birden fazla turda tarama işlemi gerçekleştirildi. İlk turdaki ilaç konsantrasyonu, sinek ölümlerine yol açabilecek toksik yan etkilerden kaçınmak için 20 μM olarak ayarlandı. İkinci tarama turunda, ilacın farklı konsantrasyonlardaki etkilerini değerlendirmek için ilaç konsantrasyonu 50 μM'ye yükseltildi. İkinci turdan seçilen ilaçlar, ilaç etkilerindeki cinsiyet farklılıklarını değerlendirmek için erkek sineklere hem 20 μM hem de 50 μM'de uygulandı. Bu, sürekli olarak uyku ile ilgili etkiler gösteren ilaçların taranmasına izin verdi. Örneğin, Reserpin'in daha önce 4-6 günlük yetişkin sineklerde uykuyu arttırdığı gösterilmiştir31. Bu sonucu, yaşlı dişilerin Reserpin uygulandıktan sonra uykuda önemli bir artış gösterdiği yaşlı sinekleri kullanarak modelimizde başarılı bir şekilde tekrarladık (Şekil 5).

İlaçları çözmek için DMSO kullanıldı, ancak potansiyel toksisitesi göz önünde bulundurulmalıdır. Önceki çalışmalar, kültür ortamındaki %0.1 ila %0.25 DMSO konsantrasyonlarının 24 saat içinde sıçan kılı hücrelerine zarar vermediğini, %0.5 ila %6'lık konsantrasyonların ise hücre ölümünü önemli ölçüde artırdığını göstermiştir36. Benzer şekilde,% 0.1 veya daha düşük DMSO konsantrasyonlarının, insan hepatositlerinde anahtar ilaç metabolizması ile ilgili enzimlerin veya taşıyıcıların ekspresyonunu etkilemediği bulunmuştur. Yine de, daha yüksek konsantrasyonlar ekspresyonda değişikliklere neden olabilir37. Bununla birlikte,% 0.1 DMSO'nun dişi sineklerin ömrünü önemli ölçüde etkilediği, ancak erkeklerin ömrünü önemli ölçüde etkilemediği tespit edilmiştir38. Ek olarak,% 15 ve% 20 DMSO'nun intraperitoneal uygulamasının sıçanlarda uykuya müdahale ettiği gösterilmiştir39. DMSO'nun potansiyel toksisitesini azaltmak için konsantrasyonunu% 0.2'nin altında tuttuk.

Şu anda, Drosophila'nın davranışını karakterize etmek için kullanılan iki ana yöntem vardır. Bir yöntem, uçuş pozisyonu, hız ve vücut bölümlerinin ince hareketleri dahil olmak üzere çok sayıda davranışsal parametre sağlayan video analizine dayanmaktadır. Diğer yöntem, DAM sistemi gibi kızılötesi ışın kırılmasına dayanır. 40. Bununla birlikte, PySolo gibi bazı video analiz araçlarının, bir kameranın41 altına yerleştirilebilecek sinek sayısını sınırlayarak, birden fazla tek yerleşik sineği incelemek için tasarlandığını belirtmek önemlidir. C-trax42 ve JAABA43 gibi diğer araçlar nüfus takibi yapabilir, ancak hesaplama açısından pahalı ve zaman alıcıdır. Yüksek verimli tarama için, sineklerin genel uyku süresini yakalamak genellikle yeterlidir ve hassas hareket parametreleri gerekli değildir. Bu nedenle, kızılötesi ışın kırılmasına dayalı, yaygın olarak kullanılan ve yüksek oranda ölçeklenebilir yöntem tercih edilir. Bununla birlikte, bu yöntemin de sınırlamaları vardır. Örneğin, sinekler kızılötesi ışını kesmeden tüpün yalnızca bir ucunda hareket ederse, sistem yanlışlıkla bunu uyku olarak kaydedebilir ve bu da uykunun fazla tahmin edilmesine yol açabilir44. Ek olarak, istenmeyen etkilerden kaçınmak için taramada kullanmadan önce sinek suşunun hareketliliğini dikkatlice test etmek önemlidir.

Başarılı bir kurulum için bazı yararlı ipuçları: (1) Katılaşmadan sonra küçük beherden çıkarırken yiyeceklerin cam tüpe yapışmasını önlemek için, yiyecek katılaşmadan önce cam tüpü küçük beherin dibine dikey olarak yerleştirmeyi deneyebilirsiniz. Cam tüpü hafifçe ileri geri çekmek, havanın girmesine izin vermek için beherin altına hafifçe vurmak, tüm yiyecekleri ve cam tüpü çıkarmak için beheri yavaşça döndürmek ve ardından cam tüpün dış duvarında kalan yiyecekleri dikkatlice silmek etkili olabilir. (2) Cam tüpün yiyecek ucunu parafin film ile kapatırken, parafin eriyene kadar filmi yavaşça ısıtmak için bir su banyosu kullanılması önerilir. Bu yaklaşım, tıbbi gıdaların yüksek sıcaklıklarda şiddetli bir şekilde sıçraması ve parafin filmini kirletmesi sorununun önlenmesine yardımcı olur. Alternatif olarak, sızdırmazlık için küçük plastik kapaklar kullanılabilir, ancak sızdırmazlık sırasında havanın girebileceğinden emin olun, bu da yiyeceğin genel olarak yukarı itilmesine neden olur. (3) Bazı güçlü uykuyu teşvik eden ilaçların başlangıçta test edilen sineklerin ölü olarak yanlış yargılanmasına yol açabileceğini düşünmeye değer. Bu sorunun üstesinden gelmek için, optimal ilaç konsantrasyonunun araştırılmasına ve deneyin tekrarlanmasına izin veren bir konsantrasyon gradyanı ayarlanması önerilir. (4) İlacın kokusunun, sinekler tarafından tüketilen yiyecek miktarını ve ilacı alımını etkileyebileceğini ve potansiyel olarak deney sonuçlarının doğruluğunu etkileyebileceğini dikkate alın. Bu nedenle, deneyin süresini uygun şekilde uzatmak, sineklerin mümkün olduğu kadar fazla ilaç tüketmek için yeterli zamana sahip olmalarını sağlamak ve ilacın birikim etkisini arttırmak faydalı olabilir. (5) Veri işleme için, birçok üniversite ve enstitünün kamu kullanımı için Matlab'a erişimi olsa da, programı henüz satın almamış bireyler veya araştırma kurumları için daha düşük maliyetli alternatifler mevcuttur. Önerilen seçeneklerden biri ShinyR-DAM v3.1 «Yenile»45'tir.

Sonuç olarak, uyku bozukluklarını tedavi etmek için ilaçların taranması için adım adım bir prosedür geliştirdik. Daha kısa uyku süresi fenotipi sergileyen daha yaşlı bir sinek modeli kullanılarak, Reserpin'in yaşlı dişi sineklerde uyku süresini artırmadaki etkinliği doğrulanmıştır. Bu yöntem, önemli uygulama potansiyeli ile uyuşturucu taramasına yeni bir yaklaşım sunmakta ve daha ileri ilaç araştırmaları için bir temel görevi görmektedir. İlaç etkileri fenotiplere göre değerlendirilirken, ilaç etkisinin altında yatan mekanizma bilinmemektedir. Uyku bozukluklarının patolojisini ve uykunun moleküler regülasyonunu araştırmak ve böylece ilgili farmakolojik mekanizmalara ışık tutmak için daha ileri çalışmalar yapılacaktır. Drosophila'daki sirkadiyen mekanizma insan osilatörleri ile benzerlikler taşısa da, insanlar ve sinekler arasındaki uyku kontrol mekanizmalarındaki farklılıklar göz ardı edilmemelidir. Bu protokol, uyku bozuklukları için ilaç taraması için temel bir çerçeve sağlar. Bununla birlikte, gelecekteki araştırmalar, taranan ilaçlardan herhangi birinin klinik tedavi için kullanılıp kullanılamayacağını belirleyecek ve etki mekanizmalarını aydınlatacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.

Acknowledgments

Prof. Junhai Han'ın laboratuvar üyelerine tartışmaları ve yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından 32170970 YT'ye ve Jiangsu Eyaletinin "Siyanin Mavisi Projesi" tarafından ZCZ'ye desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ager BIOFROXX 8211KG001
Artificial Climate Box PRANDT PRX-1000A official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity Monitor TriKineics DAM2 official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2system TriKineics version:v3.03 official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScan TriKineics version:1.0.7.0 official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl Sulfoxide SIGMA 276855
Drosophila Activity Monitoring Incubator Tritech Research DT2-CIRC-TK official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila Bottles Biologix 51-17720 official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118 Bloomington Drosophila Stock Center  BDSC_3605
Excel Microsoft version:Excel 2016 official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubes TriKinetics PPT5x65 official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022b MathWorks version:9.13.0.2049777 official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
Prism GraphPad Version:Prism 8.0.1 official website:https://www.graphpad.com/features
Reserpine MACKLIN R817202-1g
Saccharose SIGMA 1245GR500
SCAMP Vecsey Lab N/A official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Bon, O. Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts. Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).
  2. Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. Sleep function: Toward elucidating an enigma. Sleep Medicine Reviews. 28, 46-54 (2016).
  3. Ohayon, M. M., Carskadon, M. A., Guilleminault, C., Vitiello, M. V. Meta-analysis of quantitative sleep parameters from childhood to old age in healthy individuals: developing normative sleep values across the human lifespan. Sleep. 27 (7), 1255-1273 (2004).
  4. Li, S. B., et al. Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging. Science. 375 (6583), eabh3021 (2022).
  5. Rodriguez, J. C., Dzierzewski, J. M., Alessi, C. A. Sleep problems in the elderly. Medical Clinics of North America. 99 (2), 431-439 (2015).
  6. Gulia, K. K., Kumar, V. M. Sleep disorders in the elderly: a growing challenge. Psychogeriatrics. 18 (3), 155-165 (2018).
  7. Wolkove, N., Elkholy, O., Baltzan, M., Palayew, M. Sleep and aging: 1. Sleep disorders commonly found in older people. Canadian Medical Association Journal. 176 (9), 1299-1304 (2007).
  8. Suzuki, K., Miyamoto, M., Hirata, K. Sleep disorders in the elderly: Diagnosis and management. Journal of General and Family Medicine. 18 (2), 61-71 (2017).
  9. Foley, D. J., et al. Sleep complaints among elderly persons - an epidemiologic-study of 3 communities. Sleep. 18 (6), 425-432 (1995).
  10. Yu, D. S. Insomnia Severity Index: psychometric properties with Chinese community-dwelling older people. Journal of Advanced Nursing. 66 (10), 2350-2359 (2010).
  11. Hoevenaar-Blom, M. P., Spijkerman, A. M., Kromhout, D., van den Berg, J. F., Verschuren, W. M. Sleep duration and sleep quality in relation to 12-year cardiovascular disease incidence: the MORGEN study. Sleep. 34 (11), 1487-1492 (2011).
  12. Rebok, G. W., Rovner, B. W., Folstein, M. F. Sleep disturbance and Alzheimer's disease: relationship to behavioral problems. Aging (Milano). 3 (2), 193-196 (1991).
  13. Schroeck, J. L., et al. Review of safety and efficacy of sleep medicines in older adults. Clinical Therapeutics. 38 (11), 2340-2372 (2016).
  14. Pericic, D., Strac, D. S., Jembrek, M. J., Vlainic, J. Allosteric uncoupling and up-regulation of benzodiazepine and GABA recognition sites following chronic diazepam treatment of HEK 293 cells stably transfected with alpha1beta2gamma2S subunits of GABA (A) receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 375 (3), 177-187 (2007).
  15. Lader, M. History of benzodiazepine dependence. Journal of Substance Abuse Treatment. 8 (1-2), 53-59 (1991).
  16. Chen, P. L., Lee, W. J., Sun, W. Z., Oyang, Y. J., Fuh, J. L. Risk of dementia in patients with insomnia and long-term use of hypnotics: a population-based retrospective cohort study. Plos One. 7 (11), e49113 (2012).
  17. Kang, D. Y., et al. Zolpidem use and risk of fracture in elderly insomnia patients. Journal of Preventive Medicine and Public Health. 45 (4), 219-226 (2012).
  18. Kao, C. H., et al. Relationship of zolpidem and cancer risk: a Taiwanese population-based cohort study. Mayo Clinic Protocols. 87 (5), 430-436 (2012).
  19. Sateia, M. J., Kirby-Long, P., Taylor, J. L. Efficacy and clinical safety of ramelteon: an evidence-based review. Sleep Medicine Reviews. 12 (4), 319-332 (2008).
  20. Friedrich, M. E., et al. Drug-induced liver injury during antidepressant treatment: results of amsp, a drug surveillance program. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 19 (4), pyv126 (2016).
  21. Entzeroth, M., Flotow, H., Condron, P. Overview of high-throughput screening. Current Protocols in Pharmacology. Chapter 9, (2009).
  22. Ferreira, L. G., Dos Santos, R. N., Oliva, G., Andricopulo, A. D. Molecular docking and structure-based drug design strategies. Molecules. 20 (7), 13384-13421 (2015).
  23. Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep - a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8 (3), 269-300 (1984).
  24. Hendricks, J. C., Sehgal, A., Pack, A. I. The need for a simple animal model to understand sleep. Progress in Neurobiology. 61 (4), 339-351 (2000).
  25. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  26. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  27. Ly, S., Pack, A. I., Naidoo, N. The neurobiological basis of sleep: Insights from Drosophila. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 87, 67-86 (2018).
  28. Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. International Journal of Molecular Sciences. 10 (2), 407-440 (2009).
  29. Morse, D., Sassone-Corsi, P. Time after time: inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators. Trends in Neuroscience. 25 (12), 632-637 (2002).
  30. De Nobrega, A. K., Lyons, L. C. Drosophila: an emergent model for delineating interactions between the circadian clock and drugs of abuse. Neural Plasticity. 2017, 4723836 (2017).
  31. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  32. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13 (5), 489-499 (2012).
  33. Nall, A. H., Sehgal, A. Small-molecule screen in adult Drosophila identifies VMAT as a regulator of sleep. Journal of Neuroscience. 33 (19), 8534-8464 (2013).
  34. Jin, X., Gu, P., Han, J. Protocol for Drosophila sleep deprivation using single-chip board. STAR Protocols. 2 (4), 100827 (2021).
  35. Kashyap, A., Singh, P. K., Silakari, O. Counting on fragment based drug design approach for drug discovery. Current Topics in Medicinal Chemistry. 18 (27), 2284-2293 (2018).
  36. Qi, W., Ding, D., Salvi, R. J. Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide (DMSO) on cochlear organotypic cultures. Hearing Research. 236 (1-2), 52-60 (2008).
  37. Nishimura, M., Ueda, N., Naito, S. Effects of dimethyl sulfoxide on the gene induction of cytochrome P450 isoforms, UGT-dependent glucuronosyl transferase isoforms, and ABCB1 in primary culture of human hepatocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 26 (7), 1052-1056 (2003).
  38. Solovev, I. A., Shaposhnikov, M. V., Moskalev, A. A. Chronobiotics KL001 and KS15 extend lifespan and modify circadian rhythms of Drosophila melanogaster. Clocks Sleep. 3 (3), 429-441 (2021).
  39. Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats. Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).
  40. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518 (2010).
  41. Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).
  42. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  43. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  44. Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. Plos One. 7 (5), e37250 (2012).
  45. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).

Tags

Yüksek Verimli Küçük Moleküllü İlaç Taraması Yaşa Bağlı Uyku Bozuklukları Drosophila Melanogaster Uyku Süresi Parçalı Örüntüler Yaşlı Hastalıklar Diyabet Kardiyovasküler Hastalıklar Psikolojik Bozukluklar Mevcut İlaçlar Yan Etkiler Bilişsel Bozukluk Bağımlılık Daha Güvenli İlaçlar Etkili Uyku Bozukluğu İlaçları Uygun Maliyetli Tarama Yöntemi Uyku Düzenleme Mekanizması Model Organizma Kızılötesi İzleme Cihazı Uyku ve Sirkadiyen Analizi MATLAB Programı 2020 (SCAMP2020) Düşük Maliyetli Tarama Protokolü
<em>Drosophila melanogaster</em> Kullanarak Yaşa Bağlı Uyku Bozuklukları İçin Yüksek Verimli Küçük Moleküllü İlaç Taraması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han,… More

Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han, S., Zhang, Z. C., Tian, Y. High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (200), e65787, doi:10.3791/65787 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter