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Bioengineering

小鼠后肢外植体研究跟腱撞击力学生物学的模型

Published: December 8, 2023 doi: 10.3791/65801
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Orthopaedics, Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center, 3Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester Medical Center

Summary

我们提出了一个定制的实验平台和组织培养方案，该方案以持续的细胞活力再现了由小鼠后肢外植体中跟腱插入撞击驱动的纤维软骨变化，提供了一个适合探索肌腱撞击的机制生物学的模型。

Abstract

肌腱撞击骨骼会产生多轴机械应变环境，横向压缩应变明显升高，从而引发局部纤维软骨表型，其特征是富含糖胺聚糖 （GAG） 的基质积累和胶原网络的重塑。虽然纤维软骨是健康肌腱撞击区域的正常特征，但过多的 GAG 沉积和胶原网络紊乱是肌腱病的标志性特征。因此，撞击在临床上被认为是肌腱病发生和发展的重要外在因素。然而，肌腱撞击背后的机制生物学研究仍未得到充分研究。先前阐明细胞对肌腱撞击反应的努力已经对细胞施加了单轴压缩，并在 体外切除了肌腱外植体。然而，分离的细胞缺乏对机械反应至关重要的三维细胞外环境，并且 体外 和切除的外植体研究都无法概括 体内肌腱撞击产生的多轴应变环境，这取决于撞击区域的解剖学特征。此外， 肌 腱撞击的体内模型缺乏对机械应变环境的控制。为了克服这些局限性，我们提出了一种适用于研究跟腱撞击机制生物学的新型小鼠后肢外植体模型。该模型将跟腱保持在 原位 以保持局部解剖结构，并再现了在被动应用踝关节背屈期间跟腱插入跟骨上产生的多轴应变环境，同时将细胞保留在其原生环境中。我们描述了该模型不可或缺的组织培养方案，并提供了在 7 天内建立持续外植体活力的数据。代表性结果表明，组织学 GAG 染色增强，继发于撞击的胶原纤维排列减少，表明纤维软骨形成增加。该模型可以很容易地适应研究不同的机械负荷方案，并允许操纵感兴趣的分子途径，以确定介导跟腱表型变化响应撞击的机制。

Introduction

许多肌腱，包括跟腱和肩袖肌腱，由于正常的解剖定位而经历骨撞击1,2,3,4.肌腱撞击产生横向指向纵向纤维轴的压缩应变5,6,7.肌腱撞击区域表现出独特的纤维软骨表型，其中收缩的圆形细胞（纤维软骨细胞）嵌入无组织的胶原网络中，糖胺聚糖 （GAG） 含量显着增加2,3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24.先前的研究表明，肌腱撞击产生的不同机械环境通过驱动大型聚集蛋白聚糖（尤其是聚集聚糖）的沉积来维持这种富含GAG的基质，尽管其潜在机制尚不清楚1,3,12,13,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.虽然纤维软骨是健康肌腱撞击区域的正常特征，但与纤维软骨形成过度相关的异常蛋白多糖代谢是肌腱病的标志特征，肌腱病是一种常见且使人衰弱的疾病，不成比例地出现在慢性撞击肌腱中1,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49.因此，肌腱撞击在临床上被认为是驱动几种最常见的肌腱病的重要外在因素，包括肩袖疾病和插入性跟腱病 （IAT）50,51,52.目前，肌腱病的治疗效率低下。例如，大约 47% 的 IAT 患者在保守治疗失败后需要手术干预，术后结局各不相同53,54,55,56.尽管撞击和肌腱病之间存在明显的关系，但撞击肌腱细胞感知和响应其机械环境的机械生物学机制描述甚少，这模糊了对肌腱病发病机制的理解并导致治疗不充分。

外植体模型是肌腱机械生物学研究的有用工具57,58。作为了解肌腱撞击机制生物学的第一步，一些先前的研究已经探索了对细胞或切除的肌腱外植体应用简单单轴压缩后的细胞反应 27,29,30,31,32,33,34,39。然而，体外细胞缺乏细胞外和细胞周基质，这些基质可促进菌株转移，隔离机械变形释放的重要生长因子和细胞因子，并为在机械转导中发挥作用的粘着斑复合物提供底物57,59。此外，体外和切除的外植体研究都无法概括体内肌腱撞击产生的多轴机械应变环境，这取决于撞击区域的解剖学特征 5,6。在跟腱插入受撞击的情况下，这包括周围组织，例如跟骨后滑囊和 Kager 的脂肪垫 60,61,62,63。相反，肌腱撞击的体内模型 25,28,36,37,38,64,65,66 允许对直接施加到肌腱的载荷的大小和频率进行最小的控制，这是研究肌腱机械生物学的体内模型的一个公认的局限性 57,58，67,68,69,70.鉴于在体内测量肌腱应变的挑战，这些模型中产生的内部应变环境通常表征不佳。

在这篇手稿中，我们提出了一个定制的实验平台，该平台在整个小鼠后肢外植体中重建了跟骨上的跟腱插入的冲击，当与这种组织培养方案配对时，在外植体培养中保持活力超过 7 天，并允许研究肌腱撞击的生物学后遗症。该平台建立在 3D 打印的聚乳酸 （PLA） 基座上，为夹具和 3D 打印 PLA 减容插件的连接奠定了基础。握把用于将大腿和膝盖夹紧在跟腱肌腱交界处的近端，后肢的尾侧朝上，允许使用超声探头或倒置显微镜从上方对跟腱进行成像（图1A）。减容插入物沿着底座上的轨道滑动，并减少所需的组织培养基体积。缠绕在后爪上的编织线利用基础设计和 3D 打印的 PLA 夹从平台中布线。通过拉动绳子，后爪背屈，跟腱插入物撞击跟骨，导致横向压缩应变升高 5,6（图 1A）。该平台包含在丙烯酸浴中，该浴将后肢外植体浸没在组织培养基中。用胶带将绷紧的绳子固定在浴缸的外面，可以保持脚踝背屈，从而对跟腱插入产生静电冲击。3D 打印组件的 CAD 文件以多种格式提供（补充文件 1），允许导入到一系列商业和免费的开源 CAD 软件中进行修改以满足实验需求。如果无法使用 3D 打印机进行制造，则可以将 CAD 文件提供给在线 3D 打印服务，这些服务将以低成本打印和运输零件。

重要的是，肱三头肌-跟腱肌腱复合体横跨膝关节和踝关节 71,72,73。因此，跟腱的拉伸拉伤受膝关节屈曲的影响。膝关节伸展使跟腱处于紧张状态，而膝关节屈曲可降低张力。通过首先伸展膝盖，然后被动地背屈踝关节，撞击插入处的压缩应变可以叠加在拉伸应变上。相反，通过在膝关节屈曲的情况下被动地背屈踝关节，拉伸应变会减少，并且压缩应变仍然存在。目前的协议探讨了三种这样的条件。1） 对于静态撞击，足背弯曲相对于胫骨 < 110° 以撞击插入物，膝盖弯曲以减少张力。2） 对于基线张力组，踝关节伸展至背屈 145° 以上，膝关节伸展，在插入处产生主要拉伸应变。3）对于卸载组，在没有外部施加负荷的情况下，将外植体培养在培养皿中，膝盖和脚踝处于中立位置。上述角度是相对于坐标系进行照相测量的，其中足部和胫骨以 180° 的角度平行，以 90° 的角度垂直。

该方案的关键步骤包括 1） 解剖后肢外植体并小心切除皮肤和足底肌腱;2）地塞米松预处理48小时后的外植体培养;3）组织切片和组织学染色;4）彩色图像分析以评估纤维软骨的形成。解剖后，将每个后肢外植体在补充有地塞米松74的培养基中预处理48小时。将每只小鼠的对侧肢体分配到单独的实验组进行成对比较，这有助于控制生物学变异性。预处理后，将外植体如上所述放置在平台中并再培养7天（图1B）。与预处理组（第 0 天）进行额外的比较，其中在预处理 48 小时后立即去除外植体。

外植体培养后，修剪后肢，将福尔马林固定，脱钙并包埋在石蜡中。矢状面方向的连续切片提供了从肌腱交界处到跟骨插入处的跟腱的可视化，同时允许通过整个肌腱跟踪切片深度。末端脱氧核苷酸转移酶 （TdT） 介导的 dUTP X-nick 标记 （TUNEL） 用于可视化继发于细胞凋亡的 DNA 损伤并评估活力。进行甲苯胺蓝组织学和定制彩色图像分析以量化 GAG 染色的变化。然后将甲苯胺蓝染色的组织切片用于SHG成像，以表征胶原纤维组织的改变（图1B）。

提供的代表性结果表明，富含GAG的基质的组织学染色改变，模型内7天的静态撞击产生的细胞外胶原网络紊乱。该模型可用于探索撞击驱动的纤维软骨变化的分子机制。

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Protocol

所有动物工作均由罗切斯特大学动物资源委员会批准。

1.组织培养基的制备

  1. 在37°C和5%CO2的培养箱中，在Dulbecco改良的Eagle培养基（1x DMEM）中培养所有外植体，其中含有1%v / v青霉素 - 链霉素和200μM L-抗坏血酸。对于最初的 48 小时预处理，在补充有 100 nM 地塞米松74 的 70 mL 培养基中培养每个外植体。预处理后，在没有地塞米松的情况下再培养肢体7天，每48-72小时更换一次培养基。
    注：不建议将血清（如胎牛血清）添加到培养基中，这与 Wunderli、Blache 和 Snedeker 提供的建议一致57。简而言之，无血清条件更能代表 体内存在的无血管、营养不良的肌腱微环境。此外，在某些培养条件下，血清补充剂可以促进组织降解75 ，并刺激细胞增殖和从组织中迁移，这两者都是肌腱病理学的特征57。
  2. 对于未上样的组，在 70 mL 培养基中培养每个外植体。对于基线张力组和静态撞击组，每个平台需要大约 125 mL 的培养基来保持肢体浸没。该体积可能因大腿在握把中的位置和 3D 打印参数（主要是填充密度）而异。

2.外植体解剖和地塞米松预处理

  1. 通过吸入 CO2 和继发性颈椎脱位或根据机构指南对小鼠实施安乐死。该方案利用小于1岁的C57BL / 6小鼠。后肢的大小会随着年龄的增长而增加，并且可能变得难以适应握把。
  2. 在解剖之前，将70mL预热（37°C）培养基转移到无菌生物安全柜（BSC）中的100mm（直径）x 25mm（高度）培养皿中。加入地塞米松以达到 100 nM 工作浓度。
  3. 解剖可以使用吸收性底垫在工作台上进行，在将后肢外植体转移到 BSC 之前迅速完成解剖。组装解剖所需的手术工具，包括光滑、笔直、细尖镊子;笔直、细尖的镊子，带有锯齿状;和直的、锋利的、细的剪刀。
  4. 对于后肢外植体的解剖，将小鼠置于仰卧位并识别髋关节。使用细剪刀，在大腿近端和前部（颅面）的皮肤上做一个小切口（5-10 毫米）。
  5. 将切口拉开以扩大，用手指捏住裸露的大腿，然后小心地将皮肤向远端拉动，使后肢脱屑至脚踝水平。沿着脚背轻轻地将一把剪刀刀片插入皮肤下，并切开一个延伸到脚趾的切口。继续向远端拉扯皮肤以完全去除。
  6. 放置鼠标以可视化跟腱插入跟骨的后（尾）侧，靠近脚踝。足底肌腱位于跟腱插入的近端，紧邻跟腱的内侧缘，向足底远端延伸，越过跟骨后侧。
  7. 要去除足底肌腱，请小心地将光滑、细尖钳的尖端插入两个肌腱之间，并将尖端向内侧延伸，穿过足底肌腱下方。将尖端向近端拉出并撕裂足底肌肉。使用细尖锯齿状镊子，抓住足底肌腱分离的近端并向远端拉动以将其移除。
  8. 在髋关节处，用细剪刀切开骨盆，隔离后肢。用剪刀撬开剩余的骨盆，露出股骨头。
  9. 将后肢外植体转移到 BSC 中，并转移到含有地塞米松的细胞培养基的培养皿中。将培养皿移入培养箱并预处理48小时。

3. 外植体培养和装载平台

  1. 随着48小时预处理的结束，预热足够体积的培养基（第1节）。从现在开始，地塞米松不会添加到培养基中。此时，可以将预处理组（第 0 天）的肢体固定、脱钙并包埋在石蜡中，以便将来进行切片、染色和分析。
  2. 对于未加载的组，吸出预处理培养基并将外植体转移到新鲜的培养皿中，每个加入 70 mL 培养基，然后返回培养箱。
  3. 对于基线张力组和静态冲击组，准备外植体平台。切割大小与握把压板相似的砂纸片。对于静电冲击组，将编织线剪成约 18 英寸长的碎片，并沿线长度的一半预打一个松散的反手结。撕下铝箔片以覆盖每个丙烯酸浴，并喷洒 70% 乙醇 （EtOH）。将准备工作转移到平衡计分卡。
  4. 每个平台都包括一个亚克力浴缸、底座、减容插件、夹子和把手。每个夹具包括两个压板和三种不同类型的螺钉，包括一个 M5 x 0.8 mm 螺纹 x 10 mm 长的螺钉，用于将夹具连接到底座;两个 M6 x 1 mm 螺纹 x 20 mm 长的螺钉，可延伸压板以夹紧夹具;以及四个 M3 x 0.5 mm 螺纹 x 14 mm 长的螺钉，这些螺钉与四个压缩弹簧相结合，可缩回压板以打开夹具。
  5. 将所有组分放入能够在发生泄漏时捕获所有培养基的二级容器中。浸入≥10%漂白剂溶液中并浸泡至少1小时。用自来水冲洗漂白剂溶液（根据需要使用高压灭菌器）并进入 BSC。
    注意： 为了排除污染，请考虑对所有自来水进行高压灭菌或使用纯净水。有关解决污染问题的其他提示，请参阅 讨论 。
  6. 使用 M3 螺钉和压缩弹簧将压板连接到夹具上，使用 M5 螺钉将夹具固定到底座上，然后插入 M6 螺钉，直到它们与压板啮合。使用双面胶带将砂纸粘在压板上，然后关闭把手以促进砂纸与压板的粘合。对所有平台重复上述步骤。
  7. 当准备加载平台时，完全打开把手并使用镊子，将大腿和膝盖放在压板之间，跟腱的表面朝上（图1A）。松散地关闭把手以轻轻固定到位。
  8. 使用镊子抓住暴露的股骨头或股骨头，并操纵膝关节屈曲角度，同时逐渐合上把手以固定到位。对于基线张力组，如前所述伸展膝关节。当握把随着膝盖伸展而收紧时，脚踝应该自然伸展。对于静态撞击组，如前所述，在握把之间弯曲膝关节。
  9. 对于静态撞击组，将绳子的反手结放在远端爪子周围并收紧。将绳子穿过位于外植体下方的底座上的槽并穿过夹孔。将底座放入亚克力浴中，并将夹子固定在浴槽的顶部边缘（图1A）。
  10. 拉动绳子，使脚相对于胫骨至少 110°，并在绳子离开夹子时使用永久性记号笔标记绳子。在这个位置拍摄外植体的照片，以量化背屈角（图1A）。
  11. 取下底座并沿底座上的轨道滑动以连接减容插件。将底座（现在连接到减容插件）放回亚克力浴中，并将夹子重新定位在顶部边缘。以标记的绳子为引导，拉动绳子以返回原来的背屈角度，并用胶带将绳子固定在浴缸的外面，以保持静态的背屈。
  12. 对于基线张力组，只需将外植体定位在握把之间后，将带有体积减小插件的底座放入亚克力浴中，并拍照以量化背屈角。
  13. 向每个平台中加入 125 mL 预热 （37 °C） 培养基以浸没外植体。用铝箔盖住浴槽的顶部，放入辅助容器中，然后进入培养箱。培养7天，每48-72小时更换培养基。
    注意： 在浴缸顶部放置胶带可以防止 PLA 部件漂浮。

4.固定、脱钙和石蜡包埋

  1. 外植体培养后，用剪刀修剪脚趾甲/远端脚趾，并切掉跟腱肌腱交界处近端的大腿。将每个修剪过的踝关节放入衬有泡沫活检垫的加工盒中。将脚踝推入盒角，使脚踝处于大约 90° 的背屈位置，然后关闭盒以保持到位。
  2. 在 10% 中性缓冲福尔马林 （NBF） 中固定 3 天，并在溶解在蒸馏水 （diH2O） 中的 14% 乙二苯四乙酸 （EDTA） 中脱钙 2 周，pH 值用冰醋酸调节至 7.4-7.6。
  3. 为了去除盐分，在 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中彻底冲洗样品 3 次，然后用 diH2O 彻底冲洗，每次 5 分钟。对石蜡组织学进行常规样品处理：通过一系列分级的 EtOH 脱水，在二甲苯中清除，然后用石蜡浸润。将样品定向并嵌入石蜡中，以通过跟腱获得矢状组织切片，如下文第5节所述（图1B）。

5. 组织切片

  1. 使用切片机，小心地修剪到样品中，直到切片平行于块面。从关节的内侧粗略地修剪到脚踝，在到达跟腱插入的内侧边界之前停止。
  2. 将样品转移到冰块中以调节温度和水合作用，并更换刀片（或转移到当前刀片的新鲜部分）。继续以 10 μm 厚度切片样品，并用明场显微镜仔细识别跟腱插入的入口。一旦确定，通过整个跟腱插入进行连续切片跟踪切片编号（即组织深度）。

6. 脱蜡/补水和玻片选择

  1. 对于下面的每个测定，从每对对侧肢体中选择水平匹配的组织切片。染色前，放在载玻片架上，经过 3 次二甲苯更换、2 次更换 100% EtOH、2 次更换 95% EtOH 和 1 次更换 70% EtOH，每次 5 分钟。在 diH2O 中完成补水。

7. TUNEL 评估跟腱活力

  1. 对于TUNEL标签，请根据制造商的方案进行染色。在室温下在20μg/ mL蛋白酶K中孵育20分钟，并在diH2O中冲洗。 在diH2O.中冲洗，用含有DAPI和盖玻片的抗淬灭试剂安装。
  2. 使用带有 4 倍物镜的荧光显微镜对跟腱插入进行成像。包括一个DAPI通道（激发/发射波长= 360/460 nm）以可视化所有细胞核，一个TUNEL（TMR红色）通道（激发/发射波长= 540/580 nm）以可视化凋亡细胞核，如果可能的话，还包括一个明场通道。
  3. 对于图像分析，将图像导入适用于基于 ROI 的处理的图像分析软件，例如 FIJI/ImageJ 或 MATLAB。定义一个感兴趣的区域（ROI），勾勒出整个跟腱（图2A），排除表腱中的细胞，这些细胞在被放入培养物中时极易因夹层和环境条件的突然变化而死亡。
  4. 为此，请在 MATLAB 中通过导入明场图像并使用 drawpolygon（） 函数跟踪和包围肌腱的边界来执行 ROI 选择。MATLAB 为 ROI 创建一个 Polygon 对象，然后可以将其应用于 DAPI 和 TUNEL 通道图像，以使用 createMask（） 屏蔽 ROI 之外的像素强度数据，以便仅分析跟腱内的细胞核。
  5. 导入 DAPI 和 TUNEL 通道图像，并通过归一化到非活组织（如骨骼、肌肉或脂肪）中凋亡核的最大荧光强度来确定用于定义凋亡 （TUNEL+） 细胞核的荧光强度阈值，这些组织在组织切片中偶然捕获。图像被遮蔽后，计算跟腱内凋亡核（TUNEL+核/DAPI核）的比例。

8. 甲苯胺蓝组织学表征纤维软骨形成

  1. 一旦再水化（第 6 节），将具有水平匹配组织切片的载玻片架从对侧外植体对转移到 0.4% w/v 甲苯胺蓝 O 的 0.1 M 醋酸钠缓冲液中，使用 glacial 乙酸调节 pH 至 4.0。在室温下孵育10分钟，然后在diH2O中冲洗3次，每次30秒。
  2. 通过三次更换 95% EtOH 和两次更换 100% EtOH 脱水，每次 30 秒。通过三次更换二甲苯清除，每次 1 分钟。盖玻片与二甲苯基封固剂。
  3. 获取跟腱插入的 24 位红蓝绿 （RGB） 彩色图像。例如，对于此协议，使用适配器将数码彩色相机连接到具有 4 倍物镜的简单明场显微镜的目镜。
  4. 为了量化跟腱插入处受压肌腱纤维软骨（CTF）16内甲苯胺蓝染色的差异（图3A，B），将RGB图像导入能够定义和管理多个ROI的图像分析软件中。选项包括 FIJI/ImageJ 中的选择和 ROI 管理器工具或 MATLAB 中的图像处理工具箱。首先设置像素/长度比例。
    注意：软件选择由研究人员自行决定，当然不限于 MATLAB 或 FIJI/ImageJ。作者提供了 MATLAB 代码（补充文件 2）、描述实现的文档（补充文件 3）和示例图像（补充文件 4）。我们鼓励研究人员根据需要或首选将此代码翻译成其他编程语言，以便在其他软件中使用。
  5. 通过所选软件中显示的图像，确定深肌腱边界与跟骨的交点。从这里开始，沿着深肌腱边界近端追踪 800 μm，以建立 CTF 的深边界。例如，使用 MATLAB 中的 drawpolyline（） 函数以交互方式在 RGB 图像上绘制多段线。MATLAB 创建一个包含线顶点的折线对象，该对象可以处理并修剪为 800 μm 的长度。
  6. 从该位置，通过绘制一条连接到垂直于局部纤维方向的浅表肌腱边界的线段来创建 CTF 的近端边界。
  7. 回到深肌腱边界和跟骨的交点，并通过沿着将 CTF 与附着区纤维软骨 （AZF） 分开的明显潮标绘制一条连接到浅表肌腱边界的线段来定义 CTF 的远端边界16（图 3A，B）。最后，通过追踪要封闭的浅表肌腱边界来生成 CTF 的浅表边界。
  8. 为了描述插入处GAG染色的空间变化，将总CTF分为4个象限（图3A，B）。将深部和浅表 CTF 边界的中点与线段连接起来，以创建远端/近端边界。穿过该边界的中点，沿纤维方向连接远端和近端 CTF 边界的中点，以创建浅层/深层边界。
  9. 这 6 个边界提供了可用于定义代表整个 CTF 的 ROI 的信息，以及细分 CTF 的 4 个象限。例如，在 MATLAB 中，将定义每个单独 ROI（CTF，象限 1-4）边界的顶点编译为向量，并使用 images.roi.Polygon（） 为每个 ROI 生成封闭的 Polygon 对象。
  10. 定义 ROI 后，使用 FIJI 中的颜色转换器插件、MATLAB 中的 rgb2hsv（） 函数或其他应用适当变换方程的软件将 RGB 像素数据转换为色相饱和值 （HSV） 颜色空间76。然后，HSV数据可以投射到2D色相饱和空间中，其中色相和饱和度的每个组合都编码了一种独特的颜色（图3C）。
  11. 在每个 ROI 中，计算描述 ROI 中平均染色颜色的平均色调和饱和度。例如，这可以在 MATLAB 中实现，通过使用定义每个 ROI 的 Polygon 对象来使用 createMask（） 遮罩图像，以便专门分析每个 ROI 中的色调饱和度像素数据。
  12. 在骨膜纤维软骨（PF）16内定义另一个小的ROI（图3A，B）并计算平均色调和饱和度。然后，计算将 CTF 的每个 ROI 中的平均颜色与 PF 的平均颜色分开的欧几里得距离（图 3C）。
    Equation 1
    注意：欧几里得距离计算描述了 ROI 的平均颜色与 PF（一种典型的纤维软骨组织 16,17,77）的平均颜色之间的相似程度。较小的欧几里得距离表示外观上更像纤维软骨的 ROI 颜色。
  13. 使用此距离计算纤维软骨分数，如果 ROI 颜色与 PF 颜色相同，则假设最大值为 1，如果 ROI 和 PF 颜色在色调饱和度颜色空间内达到最大分离度，则最小值为 -1。
    Equation 2
  14. 每个肢体组织切片中每个 ROI 内的色调、饱和度和纤维软骨评分的平均数据。对侧肢体组之间进行配对统计比较。

9. SHG成像研究胶原网络组织的变化

  1. 使用带有 20 倍物镜的功能强大的显微镜系统对甲苯胺蓝染色切片进行 SHG 成像。通过截面厚度获取 z 堆栈，并根据需要执行瓷砖扫描以完全捕获跟腱插入。
  2. 将SHG图像导入首选图像分析软件，并定义ROI，包括和细分跟腱插入处的CTF，如第8节中甲苯胺蓝图像分析所述（图4A，B）。
  3. 如果将SHG图像导入MATLAB，请使用在MATLAB中定义CTF ROI的方法，如第8节所述。定义 ROI 后，通过将 MATLAB 中的 ROI 顶点导出为 .txt 文件并使用 文件>导入 XY 坐标导入 FIJI，将 ROI 坐标传输到 FIJI>。覆盖选择并发送给 ROI 管理器进行分析。
  4. 要量化胶原蛋白的组织，请使用 FIJI 中的 Directionality 插件，该插件执行傅里叶谱分析以计算跨越 ROI 的小窗口中纤维取向的分布。这种分布的扩散称为色散，与光纤排列成反比。
    注意：由于肌腱的粗大弯曲而不是缺乏对齐/组织，胶原纤维可能会在 CTF 的不同窗口中呈现出可变的方向。为了更好地区分胶原组织的变化与插入时肌腱的总弯曲，有必要定义较小的 ROI。
  5. 将 SHG 图像导入 FIJI 并设置像素/长度比例。将最大像素强度数据投影到 2D 合成图像中，并将 ROI 添加到 ROI 管理器中。按顺序将每个 CTF ROI 叠加到图像上，并在 ROI 中绘制 10 个大小一致的小子 ROI，将子 ROI 添加到 ROI 管理器中。
  6. 在每个子 ROI 中，运行 FIJI 中的方向性插件以计算光纤色散。每个 CTF ROI 内子 ROI 的平均离散数据，以及每个外植体各部分的每个 CTF ROI 中的平均离散数据。对侧肢体组之间进行配对统计比较。

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Representative Results

TUNEL染色组织切片的代表性图像显示，在实验组的外植体培养7天后，跟腱体内的凋亡核最小（图2A）。这些图像的定量提供了证据，证明在外植体培养 7 天后，组织培养方案在不同负载条件下的外植体培养 7 天后，在跟腱内平均保持高达 78% 的活力（图 2B）。

定性地，与未加载的对照组相比，在静电冲击 7 天后，增强的甲苯胺蓝染色是值得赞赏的（图 3A，B），特别是在跟骨附近的深象限中，我们之前已经测量过最大横向压缩应变 5,6。这些甲苯胺蓝染色组织切片的定量表明，与对侧未加载的外植体相比，静电撞击 7 天后色调（图 3D）、饱和度（图 3E）和纤维软骨评分（图 3F）发生了显着变化。这种改变的 GAG 染色可能代表该模型中继发于静电撞击的纤维软骨形成。在基线紧张 7 天后，仅在象限 1 中检测到饱和度和纤维软骨评分的统计学显着差异（图 3E，F）。此外，饱和度和纤维软骨评分相对于对侧无负荷肌腱下降，与静态撞击相比呈相反趋势。这些数据可能支持拉伸载荷可以减弱或逆转撞击驱动的纤维软骨形成的假设，并值得将来进行进一步的研究。

SHG 成像的定量表明，在静电撞击 7 天后，胶原纤维取向发生了细微但显着的变化，同样在跟骨附近的深部和远端区域，如分散的显着差异所示（图 4C）。

Figure 1
图1：外植体平台和实验设计。 （A） 外植体平台的摄影和示意图。（返回顶部）整个小鼠后肢外植体被装载到平台中的照片，并标记了关键组件。（底部）该外植体模型中由被动应用的踝背屈引起的插入跟腱撞击的示意图。（B）研究设计和外植体培养示意图。将后肢外植体在100nM地塞米松中预处理48小时74。然后从每只小鼠中培养一个后肢外植体，在未加载的培养皿中培养7天，同时将对侧肢体加载到实验平台中，以将跟腱置于基线张力或静态撞击下7天。对侧肢体对的连续组织切片要么用甲苯胺蓝染色以显示富含GAG的组织，要么用于TUNEL染色。然后使用甲苯胺蓝染色切片进行 SHG 成像以评估胶原组织。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2：外植体活力。 （A） 来自预处理（第 0 天）外植体（左上）、卸载肌腱（右上）、保持在基线张力的肌腱（左下）和静态撞击肌腱（右下）的 TUNEL 染色切片的代表性图像。跟腱用白色虚线勾勒并标记为 AT，而跟骨以黄色实线勾勒并标记为 C.凋亡核呈红色 （TUNEL），所有细胞核呈蓝色 （DAPI）。（B） 空载组、基线张力组和静态撞击组的死细胞分数量化平均小于 22%。数据表示平均值±标准差。这些数据集中存在异常值，细胞死亡率大于 50%，这可能归因于不良解剖技术引起的肌腱损伤。所有组中去除统计异常值的平均死细胞分数均小于 15%。未加载组、基线张力组和静态撞击组之间的细胞死亡无统计学意义差异（p < 0.05）。第 0 天对照：n=8。空载：n=18。基线张力：n=8。静电冲击：n=12。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图3：甲苯胺蓝组织学。 （A） 空载培养 7 天后的代表性甲苯胺蓝色染色，描绘了跟腱插入处的压迫肌腱纤维软骨 （CTF）、附着区纤维软骨 （AZF） 和骨膜纤维软骨 （PF）16。Calcaneus 标记为 C. ROI 捕获 CTF 以红色勾勒，并进一步细分为 4 个象限以提供额外的空间信息。（B） 静态撞击 7 天后的代表性甲苯胺蓝染色，CTF 染色增强，特别是在象限 1 中，我们之前测量过最大横向压缩应变 5,6。（C） 用于彩色图像分析的色相饱和色彩空间示意图。颜色由色调 （0°-360°） 和饱和度 （0-255）76 的组合来描述。通过计算将每个 ROI 中的颜色与 PF 中的颜色分开的欧几里得距离，将每个 ROI 中的平均颜色归一化为 PF 的平均颜色，从而提供归一化的纤维软骨评分。（D-F）与对侧无负荷肌腱相比，静态撞击（上）和基线张力（下）7 天后甲苯胺蓝染色的变化。数据表示平均值±标准差。（D） 色调的量化表明，与对侧无负荷肌腱相比，静电冲击 7 天后所有区域的平均色调存在显着差异。与对侧无负荷肌腱相比，基线张力 7 天后未检测到类似的趋势。（E） 饱和度的量化，与对侧无负荷肌腱相比，静电冲击 7 天后整个 CTF 和象限 1-3 内的平均饱和度发生显着变化。相反，仅在基线紧张 7 天后在第 1 象限中检测到显着差异，与对侧未负荷肌腱相比，饱和度降低。（F） 纤维软骨评分的量化，与对侧无负荷肌腱相比，静态撞击 7 天后所有区域的纤维软骨评分都有显着变化。相反，仅在基线紧张 7 天后在第 1 象限中检测到显着差异，与对侧无负荷肌腱相比，纤维软骨评分下降。数据表明，静电撞击导致的GAG染色增强，表明纤维软骨形成增加。使用 Wilcoxon 匹配对有符号秩检验比较描述总 CTF 的数据。使用重复测量双因素方差分析和 Šídák 的多重比较检验比较象限数据。*p < 0.05。**p < 0.01。p < 0.005。p < 0.001。基线张力与空载：n = 6 对。静电冲击与空载：n = 8 对。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4：SHG 成像。 （A） 卸载培养 7 天后具有代表性的 SHG 图像与 （B） 静态撞击 7 天相比。CTF 以红色勾勒，并按标记分为 4 个象限，与上述甲苯胺蓝色分析中的 ROI 一致。（C）在每个象限内，使用斐济的方向性插件在移动子窗口中进行傅里叶谱分析。每个子窗口内光纤取向分布的扩散称为色散 （°），与光纤取向成反比。色散 = 0° 表示光纤的完美平行对准。分散度的增加代表胶原纤维排列的减少。数据表示平均值±标准差。与对侧无负荷肌腱相比，在静态撞击 7 天后，象限 1 的分散性存在统计学显着差异，表明胶原紊乱增加。使用重复测量双因素方差分析和 Šídák 的多重比较检验比较象限数据。* p < 0.05。静电冲击与空载：n = 5 对。 请点击这里查看此图的较大版本.

补充文件 1：CAD 文件。 这些CAD文件，编译成多种文件格式，可用于3D打印平台底座，体积减少插件和夹子。 请点击这里下载此文件。

补充文件 2：MATLAB 文件。 编译的MATLAB文件允许对甲苯胺蓝组织学进行量化，如方案第8节所述，以评估通过跟腱插入处GAG染色的空间变化形成纤维软骨。 请点击这里下载此文件。

补充文件 3：实现 MATLAB 代码的指南。 本文档介绍了一种管道，用于通过使用提供的 MATLAB 代码对甲苯胺蓝组织学进行图像分析来量化跟腱插入处 GAG 染色的变化。 请点击这里下载此文件。

补充文件 4：甲苯胺蓝组织学样本图像。 甲苯胺蓝组织学的RGB彩色图像可用于执行提供的MATLAB代码。 请点击这里下载此文件。

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Discussion

实验性小鼠后肢外植体平台与本研究中描述的组织培养方案相结合，为研究跟腱插入处撞击驱动的纤维软骨形成的机制生物学提供了合适的模型。代表性结果证明了该外植体模型的实用性，该结果表明，在静态撞击 7 天后，甲苯胺蓝染色的显着和空间异质性变化同时维持了细胞活力。这些发现表明继发于机械撞击的富含GAG的基质分子的代谢改变，与其他模型和临床研究一致3,4,9,13,23,25,28,29,30,31,32,33,34,35 ，36,37,38,44,49.此外，静电撞击 7 天后，通过 SHG 成像检测到胶原组织发生细微但显着的变化，这与撞击相关肌腱病的临床特征和肌腱撞击的体内模型一致28、37、38、43、44、49、64。

先前探索肌腱撞击的生物学后遗症的努力已经对分离的肌腱细胞应用了简单的压缩27,29。一旦确定了感兴趣的机械生物学机制，与我们的外植体模型相比，这些模型提供了优越的治疗筛选平台。然而，这些研究的结果必须谨慎解释，因为在体外培养的分离细胞缺乏影响机械反应的三维细胞外环境57,59。此外，在没有细胞外环境的情况下，从其他胶原组织（例如软骨）中分离的细胞在体外进行机械攻击时表现出改变的机械敏感离子通道活性78,79。所提出的模型通过提供一个平台来使活的外植体中的原位肌腱细胞受到生理相关的负载条件，从而解决了这些局限性。

外植体模型是用于探测肌腱生物学和生理学的流行实验系统57,58。在肌腱撞击的特定背景下，先前的几项研究已经使用部分和全肌腱外植体来探索肌腱细胞对人工单轴压缩的反应 30,31,32,33,34,39。虽然这些研究表明单轴压缩与纤维软骨形成之间存在直接联系，但肌腱撞击产生的体内机械应变环境是多轴的，并且取决于撞击区域的解剖学特征 5,6。例如，踝关节背屈期间跟骨撞击跟腱所产生的应变环境受插入角度、附着区域和周围软组织的存在的影响 60,61,62,63,80,81.我们的外植体平台保留了这些外部结构，并再现了撞击产生的多轴应变环境，同时将细胞保持在其天然环境中6.

动物模型在证实机械撞击与肌腱纤维软骨和病理学的典型特征之间的直接关系方面发挥了重要作用，它们具有相似的表型 1,25,28,37,64,65,66。近几十年来，大多数体内撞击研究都利用啮齿动物模型通过手术缩小肩峰下空间以人工撞击肩袖肌腱来研究肩袖疾病。这些动物模型已被用于描述体内撞击肌腱病的细胞和分子发病机制，并且可以扩展到评估新的治疗策略，以促进撞击研究的临床转化36,37,38,66,82,83,84,85。

然而，肌腱撞击的体内模型在研究机械生物学方面有几个重要的局限性57,58。这些模型通过手术引入或去除肌腱撞击的外部来源并恢复身体活动（自由笼式活动、强制跑步机跑步等）这种方法缺乏对在整个实验过程中直接施加在肌腱上的力的大小、方向和频率的控制。鉴于在体内测量组织应变的困难，这些模型对肌腱内响应撞击而产生的机械环境的控制或表征有限。这种局限性在肌腱机械生物学研究领域得到了公认的认可 57,58,67,68,69,70。在其他地方，已经设计了复杂的实验平台，以在麻醉下将受控的机械过载（疲劳）直接施加到体内肌腱67,68,69。这些模型在麻醉下控制短时间内机械刺激的应用，并且在实验的剩余时间内无法控制加载历史，因为动物在机械过载后数天至数周内恢复正常笼子活动。该协议中描述的外植体模型提供了跟腱撞击的受控处方，以产生可测量和良好描述的组织应变模式6，从而允许对撞击机械生物学进行严格研究。然而，应该注意的是，这种外植体模型并不能消除对肌腱撞击进行体内研究的需要，而是作为一种补充工具，以丰富从这些不可或缺的动物模型中获得的数据。使用这种外植体模型定义的与撞击力学相关的细胞和分子途径可以在体内表征，并使用动物模型以互补的方法评估为治疗靶点，以增强机制生物学研究的临床转化。这种综合策略的力量正在肌腱机械生物学研究的其他领域得到利用 58,86,87,88，这种外植体模型将其应用于肌腱撞击。

外植体模型并非没有局限性。与所有外植体模型一样，机械生物学只能在相对较短的时间尺度上进行研究，而组织仍然存活57,89。虽然该模型是研究细胞对机械撞击的即时反应的有力工具，但它不适合研究与撞击相关的慢性肌腱疾病。此外，该模型无法解释全身反应和组织串扰，因为血液供应和神经通讯无法维持。然而，该模型提供了一个平台来描述内源性肌腱细胞对机械冲击的内在反应。该模型的另一个局限性是，根据先前的研究 32,90,91,92，我们预计在预处理和外植体培养的早期时间点期间，许多富含 GAG 的大蛋白聚糖会从肌腱中扩散出来，特别是聚集蛋白聚糖的片段未锚定在地面基质上。因此，在模型中继发于撞击的GAG染色的变化可能反映了新合成的富含GAG的大分子的变化，这些大分子尚未分解代谢并保持锚定在细胞外基质中。鉴于这些富含GAG的蛋白聚糖定位于细胞周间隙22,30,93,94,95，外植体模型可能有助于研究继发于肌腱撞击的PCM重塑。

本协议中描述的小鼠后肢外植体的解剖需要练习，但可以快速实现熟练的技术。完全脱皮（即皮肤去除）可能具有挑战性，尤其是在后爪的手指周围。虽然脚趾周围的皮肤不需要完全去除，但由于皮肤和皮毛上存在细菌，它确实加强了整个培养过程中的无菌性。

解剖术最困难的方面是切除跟腱近端内侧的足底肌腱，并在远端通过跟腱的浅表。足底肌腱单元横跨膝关节和踝关节，与肱三头肌和跟腱81、96、97、98、99 密切相关。在被动踝关节背屈期间，传递到踝关节后侧的机械负荷分布在足底肌腱和跟腱之间，已知足底肌腱在体内承受高应力 100,101。此外，人类足底的解剖变异性得到了很好的描述96,102,103，虽然这种变异性在啮齿动物中不太普遍97，但它倾向于原位影响跟腱内的机械环境。与先前用于测量原位跟腱内应变的技术一致 6,104，应移除足底肌腱以控制外部肌腱撞击产生的内部应变环境。

为了避免解剖诱导的跟腱细胞死亡，必须小心切除足底，并且数据中存在的细胞凋亡变异性（图2B）可能反映了由于解剖技术不佳而导致的解剖诱导损伤。去除足底肌腱的好处是用细尖镊子小心地将足底与跟腱分开，并在近端释放足底肌腱复合体。锯齿状镊子有助于抓住足底肌腱的近端游离端，向远端、跟骨周围和爪子的手指拉动，以便完全移除。Lee 和 Elliott 对大鼠足底和跟腱以及相关肌肉组织进行了有用的解剖学描述97。

虽然我们发现本研究中描述的解剖技术足以确保无菌，但在保持无菌被证明具有挑战性的情况下，可以根据需要调整或修改方案。手术工具可以高压灭菌，甜菜碱溶液可以局部涂抹在皮肤上，解剖可以在生物安全柜中进行。我们发现，快速有效的台式解剖至关重要，在皮肤提供的无菌边界被突破后，可以将解剖的肢体快速转移到生物安全柜中的无菌培养基中。

排除污染故障的另一个主要目标是用于对平台组件进行灭菌的技术。在我们手中，我们一直成功地将简单的浸泡在 10% 漂白剂溶液中≥并在自来水中充分冲洗而无需高压灭菌。可以根据需要使用70%乙醇进行额外的灭菌，但请注意，任何用PLA打印的3D组件都与EtOH不相容，并且会翘曲。此外，除了丙烯酸浴和 3D 打印的 PLA 组件外，平台的所有部件都可以高压灭菌，浸泡在 10% 漂白剂溶液中的组件可以用高压灭菌或纯净水冲洗≥。为避免生锈，鼓励在每次实验后立即清洗并手干所有金属部件。

本协议中描述的定量甲苯胺蓝染色以表征纤维软骨形成的方法采用了创新的定制彩色图像分析，可为肌腱研究提供广泛的应用。通过将像素数据从 RGB 转换为 HSV 色彩空间76，可以提供显著的优势。在这里，色调将主波长编码为 0°-360° 的特征颜色，而饱和度定义了 0-255 范围内每个色调的纯度。相反，值描述颜色的亮度，因此，HSV 配色方案将亮度（值）与颜色（色调、饱和度）分开。在组织学分析的背景下，HSV 像素数据对显微镜检查期间透光率的变化和组织切片厚度的变化更可靠76。此外，在 HSV 色彩空间中工作允许根据组织学染色76 描绘感兴趣的特定波长（通过色相），例如，甲苯胺蓝染色的 240° 左右的色相。

本研究中提出的甲苯胺蓝色图像分析的一个创新方面是纤维软骨评分，该指标与将每个 ROI 的颜色与骨膜软骨颜色分开的欧几里得距离有关。骨膜纤维软骨在出生后立即作为次级软骨出现，而受压性肌腱纤维软骨在出生后不存在，并且与其他籽骨纤维软骨一样，似乎受到肌腱压迫升高区域的机械需求的调节 16,17,28,77.通过比较实验组之间的纤维软骨评分，我们不仅可以确定甲苯胺蓝色染色是否继发于撞击，而且可以确定这种变化是否会导致外观更接近纤维软骨。这种分析可以扩展到其他流行的GAG染色剂，如阿尔新蓝和番红O，以及肌腱纤维软骨和纤维软骨肌腱附着的其他区域，只要存在类似于骨膜纤维软骨的对照组织。例如，膝关节肌腱和韧带中 GAG 染色的变化可以通过纤维软骨评分归一化为纤维软骨半月板染色。

该协议的一个关键方面是通过跟腱进行连续组织切片和跟踪切片水平，这需要可重复的石蜡包埋和仔细识别进入跟腱插入以跟踪切片深度。这种切片和染色方案无疑需要实践和改进，但可以扩展到冷冻切片。

本手稿中描述的组织学方法可以很容易地扩展到免疫组化或免疫荧光。在这方面，上述实验设计的一个重要方面是每只小鼠对侧肢体的成对比较。在这里，所有统计比较都是通过分配给不同实验组的同一只小鼠的对侧肢体的跟腱在可比切片水平的组织切片之间绘制的。这种策略有助于控制生物变异性。此外，使用所有试剂、缓冲液和抗体溶液的相同工作溶液（免疫染色）在同一载玻片架上同时对水平匹配的对侧组织切片进行染色（组织学）或同时在载玻片上染色，以帮助控制组织学和免疫标记中固有的染色间变异性，以及取决于切片水平、位置和方向的解剖异质性。

对本手稿中描述的方案进行其他几项修改，以进一步研究其他研究问题。例如，虽然这里提供的代表性数据集中在 7 天的静电撞击上，但这种方法可以用于研究间歇性或周期性撞击的生物学后遗症，方法是将缠绕在后爪上的绳子通过夹子连接到机械致动器，例如注射泵。此外，该平台还通过在培养基中补充小分子激动剂/拮抗剂，或使用来自转基因小鼠品系的后肢外植体，提供了研究感兴趣的分子机制的机会。

总之，我们提出了一种新的小鼠后肢外植体模型，用于研究跟腱撞击的机制生物学。这是由组织培养方案赋予的，该方案可在 7 天内在加载条件下保持细胞活力。该模型概括了撞击驱动的纤维软骨形成和胶原变化，如其他模型系统以及退行性肌腱疾病中所述。该实验平台允许对机械应变模式进行控制和量化，因此为严格研究撞击力学生物学提供了极好的模型。该模型可用于研究感兴趣的分子机制，以确定治疗插入性肌腱病的潜在治疗靶点。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢罗切斯特大学肌肉骨骼研究中心组织学、生物化学和分子成像 （HBMI） 核心的 Jeff Fox 和 Vidya Venkatramani 提供的支持和帮助，部分资金来自 P30AR06965。此外，作者要感谢罗切斯特大学医学中心的光学显微镜和纳米镜中心（CALMN）在多光子显微镜方面的帮助。这项研究由 R01 AR070765 和 R01 AR070765-04S1 以及 1R35GM147054 和 1R01AR082349 资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent underpads VWR 82020-845 For benchtop dissection
Acrylic bath Source One X001G46CB1 Contains the explant platform submerged in culture media
Autoclave bin Thermo Scientific 13-361-20 Used as secondary containment, holds two platforms
Base - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Braided line KastKing 30lb test Used to wrap around paw and apply ankle dorsiflexion
Clip - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Cover glass Fisherbrand 12-541-034 Rectangular, No. 2, 50 mm x 24 mm
Cytoseal XYL VWR 8312-4 Xylene-based mounting media for coverslipping Toluidine blue stained tissue sections
Dexamethasone MP Biomedical LLC 194561 CAS#50-02-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous Invitrogen by ThermoFisher D12345 CAS#67-68-5, use to solubilize dexamethasone into concentrated stock solutions
Double-sided tape Scotch Brand 34-8724-5195-9 To attach sandpaper to Grip platens
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X DMEM) Gibco by ThermoFisher 11965092 high glucose, (-) pyruvate, (+) glutamine
EDTA tetrasodium salt dihydrate Thermo Scientific Chemicals J15700.A1 CAS#10378-23-1, used to make 14% EDTA solution for sample decalcifcation
Ethanol, 200 proof Thermo Scientific T038181000 CAS#64-17-5, 1 L supply
Foam biopsy pads Leica 3801000 Used with processing cassettes, help hold ankle joints in desired position during fixation and decalcification
Forceps, #SS Standard Inox Dumont 11203-23 Straight, smooth, fine tips
Forceps, Micro-Adson 4.75" Fisherbrand 13-820-073 Straight, fine tips with serrated teeth
Garnet Sandpaper, 50-D Grit Norton M600060 01518 Or other coarse grit sandpaper
Glacial acetic acid Fisher Chemical A38S-500 CAS#64-19-7, for adjusting pH of sodium acetate buffer used for Toluidine blue histology, as well as 14% EDTA decalcification solution
Grips ADMET GV-100NT-A4 Stainless steel vice grips, screws and springs described in the protocol are included
Histobond Adhesive Microscope Slides VWR 16005-108 Sagittal sections of hind limbs explants reliably adhere to these slides through all staining protocols
In situ Cell Death Detection Kit, TMR Red Roche 12156792910 TUNEL assay
Labeling tape Fisherbrand 15-959 Or any other labeling tape of preference
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544-100G CAS#50-81-7, for culture media formulation
Neutral buffered formalin, 10% Leica 3800600 For sample fixation, 5 gallon supply
Nunc petri dishes Sigma-Aldrich P7741-1CS 100 mm diameter x 25 mm height, maintain explants submerged in 70 mL of culture media as described in protocol
Penicillin-streptomycin (100X) Gibco by ThermoFisher 15140122 Add 5 mL to 500 mL 1X DMEM for 1% v/v (1X) working concentration
Polylactic acid (PLA) 1.75 mm filament Hatchbox - Choose filament diameter compatible with your 3D printer extruder, in color of choice.
Processing cassettes Leica 3802631 For fixation, decalcification and paraffin embedding
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI Invitrogen by ThermoFisher P36931 Mounting media for coverslipping tissue sections after TUNEL
Proteinase K Fisher BioReagents BP1700-50 CAS#39450-01-6, used for antigen retrieval in TUNEL protocol
Scissors, Fine FST 14094-11 Straight, sharp
Slide Staining Set, 12-place Mercedes Scientific  MER 1011 Rack with 12 stain dishes and slide dippers for Toluidine blue histology
Sodium acetate, anhydrous Thermo Scientific Chemicals A1318430 CAS#127-09-3, used to make buffer for Toluidine blue histology
Tissue-Tek Accu-Edge Low Profile Microtome Blades VWR 25608-964 For paraffin sectioning
Toluidine Blue O Thermo Scientific Chemicals 348601000 CAS#92-31-9
Volume Reduction Insert - - 3D printed from CAD files provided as Supplementary Files
Xylenes Leica 3803665 4 gallon supply for histological staining

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《生物工程》，第202期，
小鼠后肢外植体研究跟腱撞击力学生物学的模型
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Wise, B. C., Mora, K. E., Lee, W., Buckley, M. R. Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement. J. Vis. Exp. (202), e65801, doi:10.3791/65801 (2023).

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