Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. הפרוטוקול מספק כלי רב ערך לחקר אירועים איקטליים בדרוזופילה בוגרת באמצעות הדמיית סידן ex vivo , המאפשר לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של אפילפסיה ברמה התאית.
Abstract
אפילפסיה היא הפרעה נוירולוגית המאופיינת בהתקפים חוזרים, בקורלציה חלקית עם מוצא גנטי, המשפיעה על יותר מ-70 מיליון אנשים ברחבי העולם. למרות החשיבות הקלינית של אפילפסיה, הניתוח התפקודי של הפעילות העצבית במערכת העצבים המרכזית עדיין צריך להתפתח. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית ההדמיה, בשילוב עם ביטוי יציב של מדדי סידן מקודדים גנטית, כגון GCaMP6, חוללו מהפכה בחקר האפילפסיה הן ברמת המוח והן ברמת הרזולוציה של תא בודד. Drosophila melanogaster התפתחה ככלי לחקר המנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס אפילפסיה בשל הגנטיקה המולקולרית המתוחכמת שלה ומבחני ההתנהגות שלה. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול חדשני ויעיל להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. המוח כולו מוכן מקאק, גן אפילפסיה ידוע, זבובים להדמיית סידן במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לזהות את הפעילות העצבית כהמשך לבדיקת התנהגות דמוית פרכוס. זבובי ה-cac הראו שיעור גבוה יותר של התנהגות דמוית התקפים ופעילויות סידן חריגות, כולל יותר קוצים גדולים ופחות קוצים קטנים מאשר זבובי בר. פעילויות הסידן היו בקורלציה להתנהגות דמוית התקף. מתודולוגיה זו משמשת כמתודולוגיה יעילה בסינון הגנים הפתוגניים לאפילפסיה ובחקר המנגנון הפוטנציאלי של אפילפסיה ברמה התאית.
Introduction
אפילפסיה, הפרעה נוירולוגית כרונית מורכבת המאופיינת בהישנות של התקפים ספונטניים וללא התגרות ופעילות חריגה ברשת העצבית, השפיעה על יותר מ -70 מיליון אנשים ברחבי העולם, מה שהופך אותה לאחת המחלות הנוירולוגיות הנפוצות ביותר1 ומוביל לנטל כבד של משפחות וחברה. בהתחשב בהשפעת האפילפסיה, נערכו מחקרים רבים לזיהוי האטיולוגיה של התקפים, אשר גנטיקה אושרה כגורם עיקרי לסוגים רבים של אפילפסיה או תסמונות אפילפטיות. בעשורים האחרונים, התקדמות בטכנולוגיות גנומיות הובילה לעלייה מהירה בגילוי גנים חדשים הקשורים לאפילפסיה, הממלאים תפקיד מכריע בהתרחשות פרכוסים, כולל תעלות יונים וגנים שאינם תעלות יונים 3,4. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים והניתוח הפונקציונלי בין הגנים לפנוטיפים אפילפטיים אינם מובנים לחלוטין. זיהוי גנים ומנגנונים הקשורים לאפילפסיה מציע אפשרות לניהול יעיל של חולים 5,6.
אותות סידן ציטוסוליים הם מרכיבים מרכזיים בפעילות העצבית ובהעברה סינפטית. הדמיית סידן, כולל פרוסות מוח7, in vivo 8,9, ו- ex vivo10, שימשה לניטור פעילות עצבית11 כסמן לעוררות עצבית מאז שנות השבעים12,13. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית ההדמיה, בשילוב עם מדדי הסידן המקודדים גנטית (GECIs), כגון GCaMP6, חוללו מהפכה בחקר האפילפסיה הן ברמת הרזולוציה של המוח הרחב והן ברמת הרזולוציה של תא בודד 14,15,16, שיש לה רמה גבוהה של דיוק מרחבי-זמני. שינויים בריכוז הסידן ובמעברים נצפו בפוטנציאלי פעולה ובשידור סינפטי, בהתאמה14, מה שמצביע על כך שהשינוי ברמות הסידן התוך-תאי מציג מתאם קפדני עם ההתרגשות החשמלית של נוירונים17,18. הדמיית סידן יושמה גם כמודל התקפים התפתחותי9 ובוצעה בדרוזופילה לבדיקת תרכובות נוגדות פרכוסים19.
Drosophila melanogaster כבר מסתמן כאורגניזם מודל רב עוצמה במחקר מדעי, כגון אפילפסיה, עבור גנטיקה מולקולרית מתוחכמת שלה בדיקות התנהגותיות20,21,22. יתר על כן, הכלים הגנטיים המתקדמים בדרוזופילה תרמו לביטוי של אינדיקטור סידן מקודד גנטית GCaMP6. לדוגמה, מערכות השעתוק הבינארי מבוססות Gal4 ו- UAS מאפשרות ביטוי ספציפי של GCaMP6 באופן מבוקר מרחבית וזמנית. מכיוון שדרוזופילה היא אורגניזם זעיר, הדמיית סידן in vivo דורשת מיומנויות תפעול מיומנות כדי לבצע התערבות כירורגית, שבה רק חלק קטן מהגב של המוח נחשף דרך חלון קטן14,23. במקביל, הדמיית סידן ex vivo במוח השלם של דרוזופילה יכולה לשמש לניטור אזורי העניין (ROIs) של המוח כולו.
במחקר זה, אנו מציגים הדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 כדי לעקוב אחר פעילויות אפילפטיפורמיות. CACNA1A הוא גן אפילפסיה ידוע, cac שייך ערוץ Cav2, שהוא הומולוג CACNA1A. התחלנו בניתוח המוחות של זבובי cac knockdown tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi והדמיתם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם מצב סריקה xyt. לאחר מכן ניתחנו את השינויים באותות הסידן של החזר השקעה על ידי חישוב אינדיקטורים המכמתים אירועים דמויי התקפים ספונטניים, כגון ערך %ΔF/F ואירועי סידן של פלואורסצנטיות GCaMP6. בנוסף, ביצענו גירוי מכני על ידי מכונת מערבולת כדי לגרום לבדיקות התנהגות התקפים על זבובי cac-knockdown, כמו גם כדי לאמת את התוצאות של הדמיית סידן. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק כלי רב ערך לחקר אירועים איקטליים בדרוזופילה בוגרת באמצעות הדמיית סידן ex vivo , המאפשר לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של אפילפסיה ברמה התאית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פרוטוקול לבדיקה רגישה למפץ
- ביסוס זבובי הניסוי על ידי חציית קו הנהג tub-Gal4 עם קו UAS-cac-RNAi דרך מערכת Gal4/UAS21. אספו את הזבובים הבתוליים של קו אמבט-Gal4 ואת הזבובים הזכרים של קו UAS-cac-RNAi . לאחר מכן, העבירו את הזבובים הבתולים והזכרים לאותו בקבוקון כדי לקצור את הצאצאים.
הערה: קו דרייבר tub-Gal4 יאפשר להשיג הפלה גלובלית של גן ה-cac . השתמש בקו UAS-cac-RNAi כקבוצת הבקרה. - לאחר 3-5 ימים של אקלוסיה, הרדימו בעדינות את הזבובים באמצעות 100% CO2 (ציוד הרדמה CO2 ) ואספו הן את זבובי האמבט-Gal4>UAS-cac-RNAi והן את זבובי ה-UAS-cac-RNAi בעזרת מברשת. העבירו את הזבובים האלה לבקבוקוני מזון חדשים ונקיים יום אחד לפני הבדיקה כדי לוודא שהם מוכנים היטב.
- הרדימו בעדינות את הזבובים באמצעות CO2. לאחר ההרדמה, הניחו בזהירות 4-6 זבובים בבקבוקונים טריים בודדים. אפשרו לזבובים להתאושש מההרדמה במשך כשעה לפני שהמשיכו בבדיקה.
הערה: עבור כל גנוטיפ נבדקו לפחות חמישה ניסויים, וכל ניסוי כלל שישה בקבוקונים של זבובים. - הגדר את ציוד ההקלטה. מקם מצלמה (720-1080P, 30-60 FPS לפחות, מיקוד אוטומטי נעול) על חצובה מול לוח מחיק. כוונן את מיקוד המצלמה באופן ידני באמצעות בקבוקון ריק כדי להבטיח צילומים ברורים ומדויקים.
- השתמש במערבל מערבולות כדי לבצע את ההתנהגות דמוית ההתקף המושרה באופן מכני. מניחים כל בקבוקון המכיל 4-6 זבובים על מערבל המערבולת ומפעילים אותו במצב הגבוה ביותר (2800 סל"ד) למשך 10 שניות בדיוק. לאחר המערבולת, הניחו מיד את הבקבוקון על הלוח.
- התבוננו בזבובים ותיעדו כל התנהגות דמוית התקף שהם מפגינים.
הערה: התנהגות דמוית התקף שנצפתה בזבובים מורכבת משלושה שלבים: התקף (המתבטא בכנפיים רוטטות), שיתוק והתאוששות24. היחס בין זבובי ההתקפים לזבובים שנבדקו הוגדר כשיעור ההתקפים.- מדדו את זמן ההתאוששות כזמן הדרוש לאחר מערבולות עד שהזבובים יחזרו לעמוד זקוף25.
2. פרוטוקול להדמיית סידן במוח ex vivo
- הקימו את זבובי הקו tub-Gal4>UAS-GCaMP6m ו-tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi , בהתאמה. צור את הזבובים באמצעות מערכת ביטוי בינארי Gal4/UAS21 כדי לאפשר ניטור של פעילות הסידן במוח ex vivo .
- הכינו את תמיסת הדיסקציה כמתואר במתכון המצורף (טבלה 1)26.
- הכן את הפתרון החיצוני כמתואר בטבלה 1. כוונן ל- pH 7.2 עם NaOH וכוונן את האוסמולריות ל- 250-255 mOsm/L.
הערה: ניתן לאחסן את התמיסה החיצונית בטמפרטורה של 4°C למשך שבוע אחד. - להכנת תמיסת הדיסקציה, הוסף 9 יחידות של תרחיף פפאין ול-ליזין (2 מ"ג/מ"ל) ל-600 מיקרוליטר של התמיסה החיצונית. מערבבים את התמיסה וממתינים 15 דקות עד שהפתרון ברור.
הערה: מומלץ להשתמש בתמיסת הדיסקציה תוך 4 שעות.
- הכן את הפתרון החיצוני כמתואר בטבלה 1. כוונן ל- pH 7.2 עם NaOH וכוונן את האוסמולריות ל- 250-255 mOsm/L.
- יש לערבב את התמיסה החיצונית במי מלח מחומצנים (95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני) למשך 5 דקות לפני השימוש. השתמשו בפיפטה כדי להעביר כ-10 מיקרוליטר מתמיסת הדיסקציה לצלחת פטרי. פתרון זה יספק את התנאים הדרושים לדיסקציה והדמיה של המוח.
- נתחו בזהירות את המוחות של קווי tub-Gal4>UAS-GCaMP6m ו-tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi באמצעות מחטי המזרק והמיקרוסקופ. עקוב אחר הפרוטוקול שנקבע לדיסקציה מוחית27.
- השתמשו בפיפטה כדי להעביר את המוח המוכן לצלחת הקלטה המכילה 5 מ"ל של תמיסה חיצונית טרייה ושתקו את המוח באמצעות מחזיק C-sharp בצלחת ההקלטה למשך 3-5 דקות להתאוששות.
הערה: מחזיק C-sharp היה עשוי חצי עיגול מתכתי בקוטר 7 מ"מ שנחצה על ידי סיבים מקבילים במרחק 0.5 מ"מ זה מזה. - הקמה ורכישה של הדמיה קונפוקלית
- עבור דימות קונפוקלי, צלם כל מוח עם מטרה של 20x ומצב סריקה xyt. זהה את נוירוני גוף הפטריות עם הגברה דיגיטלית נוספת של 4.5x המבוססת על הגברה אופטית פי 20.
הערה: ניתן לצלם כל מוח ex vivo במשך יותר משעה אחת. - קבל את כל פליטת המוח-GCaMP6m בעירור לייזר של 488 ננומטר עם עוצמת לייזר של 16 μw. הגדר את פרמטרי הסריקה למהירות של 400, עם גודל פיקסל של 256 פיקסלים x 256 פיקסלים. השתמש בקצב רכישה של 5.3 הרץ והקלט למשך 3 דקות.
- עבור דימות קונפוקלי, צלם כל מוח עם מטרה של 20x ומצב סריקה xyt. זהה את נוירוני גוף הפטריות עם הגברה דיגיטלית נוספת של 4.5x המבוססת על הגברה אופטית פי 20.
- זהה 5-8 ROI בכל מוח ונתח את הפלואורסצנטיות. לקבוע באופן ידני את גוף התא של נוירונים בגוף פטריות כמו האזור של עניין28.
- תייגו את תאי העצב שזוהו ומדדו את עוצמות הפלואורסצנטיות שלהם באמצעות ImageJ. נתח את נתוני הפלואורסצנטיות של GCaMP6m באמצעות %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). הגדירו את הפלואורסצנטיות התוך-תאית, הגדלה בין 2 ל-2.5 סטיות תקן מעל קו הבסיס, כקוצים קטנים, ואת הפלואורסצנטיות התוך-תאית, הגדלה של יותר מ-2.5 סטיות תקן מעל קו הבסיס, כקוצים גדולים. נתח את התדירות של קפיצות סידן על ידי מבחן t של התלמיד.
הערה: F0 הוגדר כקו הבסיס על ידי עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של 5 המסגרות הראשונות בהחזר השקעה, F1 כעוצמת הפלואורסצנטיות של נקודת הזמן הנתונה, ו- B כרקע ללא פלואורסצנטיות. פעילויות פיזיולוגיות זמניות של תאי עצב עוזרות גם להבדיל אותם מסימני רעש.
- תייגו את תאי העצב שזוהו ומדדו את עוצמות הפלואורסצנטיות שלהם באמצעות ImageJ. נתח את נתוני הפלואורסצנטיות של GCaMP6m באמצעות %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B). הגדירו את הפלואורסצנטיות התוך-תאית, הגדלה בין 2 ל-2.5 סטיות תקן מעל קו הבסיס, כקוצים קטנים, ואת הפלואורסצנטיות התוך-תאית, הגדלה של יותר מ-2.5 סטיות תקן מעל קו הבסיס, כקוצים גדולים. נתח את התדירות של קפיצות סידן על ידי מבחן t של התלמיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות פרוטוקול זה, מצאנו כי זבובי קאק הראו שיעורים גבוהים משמעותית של התנהגות דמוית התקף מאשר זבובי WT (17.00 ± 2.99 [n = 6] לעומת 4.50 ± 2.03 [n = 6]; P = 0.0061; מבחן t של תלמיד, איור 1A). רוב זבובי tub-Gal4>UAS-cac-RNAi התאוששו תוך 1-5 שניות, בעוד שזבובי UAS-cac-RNAi התאוששו תוך 2 שניות. אחוז ההתאוששות של זבובי קאק תוך שנייה אחת היה נמוך משמעותית מזבובי WT (88.08 ± 1.89 [n = 6] לעומת 96.50 ± 1.82 [n = 6]; P = 0.0093; מבחן t של תלמיד, איור 1B). כפי שניתן לראות באיור 2, אותות סידן נצפו בגוף הפטריות של זבובים. קוצים קטנים התרחשו פחות בזבובי הפלה של cac (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2.97 ± 0.96 [n = 13] לעומת tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 5.33 ± 1.31 [n = 13]; P < 0.0001; מבחן t של סטודנט), בעוד שקפיצות גדולות התרחשו יותר בזבובי הפלה של cac (tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi, 2.87 ± 0.63 [n = 13] לעומת tub-Gal4>UAS-GCaMP6m, 1.72 ± 0.62 [n = 13]; P < 0.0001). תוצאות אלה מצביעות על כך שאותות הסידן שנצפו בזבובים היו בקורלציה גבוהה עם הפעילות העצבית והראו עקביות עם ההתנהגות דמוית ההתקף בזבובי cac .
איור 1: שיעורי התקפים קלאסיים וזמן התאוששות בזבובים. (A) התקפים התרחשו בשיעור גבוה יותר בזבובי הפלה של CAC . (ב) זמן ההחלמה מהתקף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אותות סידן מייצגים בגוף הפטריות של זבובים. (A) אותות סידן ב-5 תאים נבחרים בגוף הפטריות של זבובים. (B) עקבות אופייניות: שינוי בפלואורסצנטיות (ΔF/F) לאורך זמן מתא בודד בגוף הפטרייה בקבצים מסוג knockdown ו-wild-type. (C) אירועי סידן גלובליים או עצביים המתרחשים בגוף הפטריות של זבובים המובחנים לקוצים קטנים וגדולים. (D) קפיצות סידן בכל המוח של זבובים ובקרות. נתון זה שונה באישור Liu et al.29. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| פתרון חיצוני להקלטה וביצוע פתרון דיסקציה. | |
| נתרן כלורי | 101 מ"מ |
| אשלגן כלורי | 3 מ"מ |
| סידן כלורי | 1 מ"מ |
| מגנזיום כלורי | 4 מ"מ |
| גלוקוז | 5 מ"מ |
| נתרן פוספט מונובייסיק | 1.25 מ"מ |
| סודיום ביקרבונט | 20.7 מ"מ |
| פתרון דיסקציה | |
| פתרון חיצוני | 600 מיקרוליטר |
| מתלה פפאין | 9 U |
| ל-ליזין | 2 מ"ג/מ"ל |
טבלה 1: הרכב פתרונות חיצוניים ופתרונות דיסקציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יון הסידן משמש כשליח שני מכריע, וממלא תפקיד מרכזי במגוון תגובות פיזיולוגיות ופתופיזיולוגיות להפרעות כימיות וחשמליות כאחד. יתר על כן, היסוד הטופולוגי של ערוצי P/Q הפרה-סינפטיים, המקודדים על ידי הגן CACNA1A האדם, זוהה כאחראי לתיווך פריקה של מוליכים עצביים שונים, כולל גלוטמט 30,31,32, והוא קשור קשר הדוק לאפילפסיה33,34. בעבר, התנהגותם של זבובי הפלה של Cac לא הפגינה את החומרה שדווחה בחלק מהמוטנטים ואף הציגה השפעות דיכוי בזבובים מוטנטיים כפולים מסוימים35 . ממצאי מחקר זה מגלים כי זבובי הקאק מועדים יותר להתקפים מאשר עמיתיהם הפראיים. תצפית זו תואמת את העובדה שחולים ומודלים אחרים של בעלי חיים הנושאים CACNA1A גרסאות אובדן תפקוד לוקים באפילפסיה28,36. ברחבי העולם, הפלת cac עלולה לשבש ישירות את ההולכה העצבית-שרירית בנוירונים מוטוריים. למרות שתנועה אצל מבוגרים וזחלים נמצאה כבלתי מנבאת רגישות להתקפים, יש להמשיך ולחקור את תרומת ה-cac של הנוירונים המוטוריים בהתנהגות ההתקפים37. באופן עקבי, בהדמיית סידן ex vivo שמנו לב לחלק גדול יותר של אירועי סידן בגוף הפטריות של זבובי קאק מאשר זה של זבובי הבר (WT), מה שהצביע על תדירות גבוהה יותר של ירי עצבי9. גוף הפטריות של הזבובים נחשב באופן רופף מקביל להיפוקמפוס ולקליפת המוח במוח היונקים. מאחר שהתקפים מתרחשים בדרך כלל בהיפוקמפוס ובקליפת המוח של בני אדם, גוף הפטרייה משמש לחקר פעילות הסידן העצבי הקשורה להתקפים במחקר זה. לסיכום, מחקר זה ביסס את העקביות של הבדיקה דמוית ההתקף הרגיש לבאנג והדמיית סידן בדרוזופילה.
בתחום הדמיית הסידן, שימוש באינדיקטור הסידן GCaMP6 בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקלי מאפשר מעקב אחר שינויים בריכוז הסידן בהקשרים שונים כגון in vivo, בתרביות תאים, בפרוסות מוח וברקמת מוח שלמה ex vivo של מודל דרוזופילה. עם זאת, מקובל להבין כי הדמיה in vivo של שטפי סידן בתוך מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה מחייבת התערבות כירורגית מעודנת כדי להשיג גישה אופטית למוח; מכשול זה עלול לעכב את המעשיות וההתקדמות של טכניקה זו במעבדות בודדות 8,16. דג זברה הוא גם מודל חשוב של בעלי חיים לחקר אפילפסיה. שיטת הדמיית הסידן in vivo נקבעה גם היא בעבר36. עם זאת, רק זחלי דגי זברה יכולים לשמש להקלטת הדמיה in vivo. מצד שני, למרות שמודלים של תרביות תאים ופרוסות מוח יכולים לספק תמונות ברזולוציה גבוהה יותר, שלמות המוח והרשתות העצביות שלו אינה ניתנת לשכפול מלא בתרבית תאים או בפרוסות מוח עקב שיבוש מבני. המחקר הנוכחי מטפל בבעיות אלה על ידי יישום רקמות מוח דרוזופילה שלמות מבודדות להדמיית סידן, ובכך נמנע הצורך בטכניקות כירורגיות מורכבות ושמירה על שלמות המוח והרשתות העצביות ללא הפרעה. גישת ex vivo מניבה גם יחס אות לרעש מעולה בהשוואה לטכניקות הדמיה in vivo.
המחקר הנוכחי מבהיר פרוצדורות מרכזיות שונות בפרוטוקול הנוגעות ליצירת זבובי הקו tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi . בתחילה, המאזן הכפול מילא תפקיד מכריע בהשגת הזבובים הרצויים. מאזנים מסומנים מאפשרים לחוקרים לעקוב אחר אללים וכרומוזומים דרך הצלבות רב-דוריות מורכבות38. לאחר מכן, לצורך הפרדה יעילה של רקמת המוח השלמה ושיפור ההדמיה המיקרוסקופית, היה הכרחי להשתמש בתרחיף פפאין כדי לרכך את סיב פני השטח של המוח. יתר על כן, כדי לייצב את המוח ולמנוע נזק עצבי במהלך ניסויים, השימוש במחזיק C-sharp עם כוונת ניילון נחשב הכרחי27.
לסיכום, הדמיית סידן המיושמת כאן לצד בדיקת התנהגות דמוית פרכוסית רגישה למפץ בדרוזופילה היא מערכת רבת עוצמה לסינון הגנים הקשורים לאפילפסיה וחקירת המנגנון הפוטנציאלי של אפילפסיה ברמה התאית. כמובן, טכניקה זו אינה יכולה לחקור את אותות הסידן בזמן אמת המתואמים להתנהגות בעלי חיים כמו שיטות in vivo אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הבסיסית והיישומית של גואנגדונג (מענק מס '2022A151111123 לג'ינג-דה קיאו) ותוכנית לשפר את המחקר המדעי ב- GMU (ג'ינג-דה קיאו). עבודה זו נתמכה גם על ידי תוכנית Enihancement Innovation Ability של האוניברסיטה הרפואית של גואנגזו (מימון מס '02-408-2304-02038XM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
- Thijs, R. D., Surges, R., O'brien, T. J., Sander, J. W.
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al.
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O'dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O'dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -Q., Lin, Y. -M., Zhang, X. -X., Peng, R. -C., Qiao, J. -D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i, Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S.
