Summary
Aqui descrevemos um protocolo de digestão celular em duas etapas para o preparo de uma suspensão unicelular de artérias carótidas de camundongos.
Abstract
As artérias carótidas são os principais vasos sanguíneos do pescoço que fornecem sangue e oxigênio ao cérebro, mas a estenose carotídea ocorre quando as artérias carótidas são obstruídas por placas. Revelar a composição celular da artéria carótida em nível unicelular é essencial para o tratamento da aterosclerose carotídea. No entanto, não há um protocolo pronto para o uso para a preparação de suspensões unicelulares das artérias carótidas. Para obter um protocolo adequado para a dissociação das artérias carótidas normais em nível unicelular com menor dano às células, projetamos um método de digestão em duas etapas, integrando o processo de digestão da colagenase/DNase e tripsina. A contagem de dupla fluorescência de laranja de acridina/iodeto de propídio (AO/PI) foi usada para detectar a viabilidade e concentração celular, e verificou-se que a suspensão unicelular satisfez os requisitos para sequenciamento unicelular, com viabilidade de células acima de 85% e alta concentração celular. Após o processamento de dados de célula única, uma mediana de ~2500 transcritos por célula foi detectada em cada célula da artéria carótida. Notavelmente, uma variedade de tipos celulares da artéria carótida normal, incluindo células musculares lisas vasculares (CMLVs), fibroblastos, células endoteliais (CEs) e macrófagos e células dendríticas (Mφ/DCs), foram detectadas simultaneamente. Este protocolo pode ser aplicado para preparar uma suspensão unicelular de vasos sanguíneos de outros tecidos com modificações apropriadas.
Introduction
A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica associada a fatores de risco como hipertensão arterial, hiperlipidemia ehemodinâmica1. As bifurcações da artéria carótida são propensas a alterações hemodinâmicas e levam à formação de placas carotídeas. A apresentação clínica da aterosclerose carotídea pode ser aguda, como acidente vascular cerebral e isquemia cerebral transitória, ou crônica, como isquemia cerebral transitória recorrente e demênciavascular2. Mecanicamente, a placa carotídea é o resultado da interação entre diferentes células da parede do vaso e várias células sanguíneas em condições patológicas. Portanto, revelar o atlas unicelular dos vasos carotídeos em condições fisiológicas e patológicas é particularmente importante para prevenir e tratar o desenvolvimento da placa carotídea.
O sequenciamento de RNA unicelular é uma das mais poderosas tecnologias de pesquisa biológica devido à sua resolução ultra-alta e detecção de heterogeneidade celular a partir de um mesmo tipo celular de organismos 3,4. Pesquisadores têm usado o sequenciamento de RNA de célula única para conduzir pesquisas em muitos campos, como doenças cardiovasculares5 e câncer6. No entanto, separar os tecidos em células isoladas de forma rápida e precisa ainda é um dos principais desafios. A dissociação enzimática é um método comumente usado que inclui predominantemente colagenase, papaína, tripsina, DNase e hialuronidase. Especificamente, as colagenases são as principais espécies enzimáticas para digestão unicelular, principalmente hidrolisando componentes do colágeno em tecidos conjuntivos. Diferentes tipos de colagenases são aplicáveis para a dissociação de diferentes tecidos, como glândulamamária7, glomérulo8, ângulo iridocorneano9, articulação do joelho 10, aorta11 e pulmão 12. Devido às propriedades fisiológicas únicas de diferentes tecidos, a dissociação usando o mesmo método pode causar muitos problemas na aquisição de células únicas, como baixa viabilidade celular, baixo número de células e grandes debris celulares. Portanto, a invenção de métodos de digestão para diferentes tecidos é essencial para a preparação de suspensões unicelulares de alta qualidade.
Este protocolo visa desenvolver um método de digestão celular em duas etapas para preparar uma suspensão unicelular da artéria carótida de camundongos selvagens. De acordo com as características da artéria carótida, combinamos colagenase/DNase com tripsina para obter uma suspensão unicelular de alta qualidade da artéria carótida de camundongo, pois a colagenase pode hidrolisar o colágeno dos tecidos carotídeos, que foi posteriormente digerido pela tripsina em uma suspensão unicelular. A contagem de dupla fluorescência de laranja de acridina/iodeto de propídio (AO/PI) foi usada para detectar a viabilidade e concentração celular, e verificou-se que a suspensão unicelular satisfez os requisitos para sequenciamento unicelular, com viabilidade de células acima de 85% e alta concentração celular. Após processamento de dados de célula única, quatro tipos celulares, incluindo células musculares lisas vasculares (CMLVs), fibroblastos, células endoteliais (CEs) e macrófagos e células dendríticas (Mφ/DCs), foram identificados em artérias carótidas normais de camundongos após a digestão. As vantagens desse protocolo são que: 1) múltiplos tipos celulares na artéria carótida podem ser identificados, 2) a viabilidade celular está bem preservada e 3) pode ser facilmente repetida sem equipamento especial. Este protocolo é adequado para pesquisadores interessados em estudar a multiômica unicelular das artérias carótidas de camundongos. Este protocolo também pode ser útil na dissociação de outros vasos sanguíneos com modificações apropriadas.
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Protocol
Todos os procedimentos com animais descritos abaixo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Soochow.
1. Preparação de reagentes e materiais
- Utilizar 1x PBS sem cálcio e magnésio e 2,5 U/mL de sal de heparina sódica para preparar a solução de perfusão. Conservar a 4 °C e pré-arrefecer no gelo quando utilizado.
- Preparar o reagente de dissociação A que contém 125 CDU/mL colagenase II e 60 U/mL DNase I diluindo 1250 CDU/mL colagenase II e 3000 U/mL DNase I com HBSS. Conservar a 4 °C até à utilização.
- Preparar o reagente de dissociação B que contém uma concentração final de 0,12% de tripsina diluindo 1 mL de tripsina livre de EDTA a 0,25% (sem vermelho de fenol) em 1 mL de 1x PBS. Conservar a 4 °C até à utilização.
- Preparar 10 mL de FBS a 1,5% e 10 mL de FBS a 5% em 1x PBS. Use 1,5% FBS para agrupar as artérias carótidas e manter no gelo antes de usar. Use 5% FBS para neutralizar a digestão e armazenar à temperatura ambiente (RT).
- Obter os materiais experimentais, incluindo seringas de 1 mL, seringas de 20 mL com agulhas de 26 G, placas de cultura de células de seis poços, tubos de centrífuga de 1,5 mL, filtros de células estéreis de 40 μm e recipientes de gelo.
2. Preparação do equipamento
- Esterilizar todo o equipamento cirúrgico, incluindo microscópio estereoscópico, tesoura dissecante, tesoura microdissecante e pinça de ponta fina.
- Ligue o contador de células automatizado e mantenha-o no RT.
- Ligue o banho-maria a 37 °C com antecedência.
- Pré-resfriar a microcentrífuga a 4 °C antes de usar.
3. Isolamento da artéria carótida de camundongos
- Anestesiar o camundongo com tribromoetanol a 1,25% por injeção intraperitoneal (0,24 mL para cada 10 g de peso corporal) e virar o mouse para verificar se há reflexo de endireitamento após 3 min. Em seguida, eutanasiar o camundongo por deslocamento cervical e deitá-lo em suas costas. Borrife a pele do rato com álcool a 75%.
- Use tesoura dissecante esterilizada para abrir a pele e expor a cavidade torácica. Abra o diafragma.
- Continue cortando para cima até a mandíbula inferior e remova cuidadosamente o excesso de tecido conjuntivo e gordura, expondo a artéria carótida.
- Corte a veia cava inferior do rato para fazer o sangue fluir para fora da circulação fechada.
- Injetar 20 mL de solução de perfusão pré-resfriada no ventrículo esquerdo com uma seringa lenta e continuamente.
NOTA: Se a perfusão for bem-sucedida, os órgãos ricos em sangue, como o fígado, o baço e os rins, ficarão branco-acinzentados. - Descasque toda a gordura e os tecidos conjuntivos ao redor da artéria carótida com uma tesoura microdissecante sob um microscópio estereoscópico.
NOTA: Esta etapa deve ser feita de forma lenta e cuidadosa para evitar danos à artéria carótida. - Isole a artéria carótida do rato, lave com 1x PBS para lavar o sangue novamente e transfira para placas de seis poços contendo 1,5% de SFB no gelo.
4. Digestão da artéria carótida em suspensão unicelular
- Use tesoura microdissecante para dissecar a artéria carótida longitudinalmente e deitar plana em outra placa de cultura celular de 6 poços contendo 1 mL de SFB a 1,5% sobre gelo.
- Lave a íntima cuidadosamente com FBS a 1,5% para remover o sangue residual.
NOTA: O rubor deve ser suave e lento para evitar lesões nas células endoteliais. - Cortar cada artéria carótida em aproximadamente 2 mm2 pedaços de tecido usando tesoura microdissecante em SFB a 1,5%.
- Transfira esses pedaços de tecido para um tubo de centrífuga de 1,5 mL com pontas de 1 mL de diâmetro largo, centrifugando a 400 x g por 5 min a 4 °C para afundar os tecidos até o fundo.
- Eliminar o sobrenadante e ressuspender os tecidos em 500 μL do reagente de dissociação A.
- Colocar o tubo em banho-maria a 37 °C durante 1 h. Pipetar suavemente com uma pipeta de 1 mL a cada 10 min.
- Adicione 500 μL de FBS a 5% no tubo e misture bem com uma pipeta de 1 mL.
- Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células estéreis de 40 μm para um novo tubo de centrífuga de 1,5 ml e centrifugar a 400 x g durante 5 minutos a 4 °C.
- Remover cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 200 μL de reagente de dissociação B.
- Coloque em banho-maria a 37 °C e digerir por mais 5 min. Pipetar suavemente a cada 2 minutos durante a digestão para dissociar totalmente em uma suspensão de célula única.
- Use 200 μL de FBS a 5% para encerrar a reação de digestão e centrifugar a 400 x g por 5 min a 4 °C.
- Descarte o sobrenadante e ressuspenda a pastilha celular em 100 μL de 1x PBS sobre gelo.
5. Exame de suspensão celular e sequenciamento de RNA de célula única
- Adicionar 10 μL de solução AO/PI em 10 μL de suspensão de célula única e misturar suavemente com uma pipeta de 20 μL.
- Pipetar 20 μL da mistura para a câmara deslizar e esperar por 1 min.
- Carregue o slide no instrumento de contador de células automatizado.
- Selecione o ensaio de viabilidade AO/PI e aguarde o relatório de qualidade.
- Use um kit de reagente de célula única de 3' para gerar esferas de gel de célula única na emulsão em um controlador de célula única e amplificar o cDNA com código de barras em um termociclador seguindo o protocolo do fabricante.
NOTA: Aqui, Chromium Single Cell 3ʹReagent Kits v3 foi usado. - Execute o sequenciamento em um sequenciador com uma estratégia de leitura de 150 pb (PE150) emparelhada. Use um aplicativo de software (Cell Ranger) para converter arquivos de chamada base brutos em arquivos fastq usando o pipeline mkfastq . Em seguida, use o Pipeline de Contagem do Cell Ranger para executar alinhamento, filtragem, contagem de código de barras e contagem de identificador molecular exclusivo (UMI) para gerar matrizes de código de barras de recurso13.
- Realize a redução e visualização da dimensionalidade dos dados com o pacote R Seurat14.
- Primeiro, a função Read10X() do Seurat lê na saída do pipeline do Cell Ranger e, em seguida, usa a matriz de contagem para criar um objeto Seurat. Em seguida, filtre as células com expressão de <200 ou >4000 genes ou uma razão gênica mitocondrial que foi superior a 10% pela função subset() de Seurat.
- Use NormalizeData () e FindVariableFeatures() para normalizar os dados e identificar 2000 recursos altamente variáveis, respectivamente.
- Execute a análise de componente principal (PCA) nos dados dimensionados e agrupe as células com dims = 30 e resolução = 0,5. Finalmente, use a função RunUMAP () para visualizar os conjuntos de dados de célula única e FindAllMarkers() para localizar cada biomarcador de cluster.
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Representative Results
Este protocolo descreve um método de digestão celular em duas etapas para o preparo de uma suspensão unicelular das artérias carótidas de camundongos (Figura 1). Este método de digestão celular em duas etapas combina colagenase/DNase com tripsina para dissociar efetivamente a parede vascular carotídea de camundongos para obter suspensões unicelulares de alta qualidade para sequenciamento de célula única. Após a dissociação, a concentração e a viabilidade celular foram calculadas por um contador automático de células. O campo luminoso mostrou a morfologia das células vasculares carotídeas após a digestão, e a coloração de dupla fluorescência AOPI detectou simultaneamente viabilidade celular (Figura 2A,B). Notavelmente, em comparação com o uso isolado do reagente de dissociação A, o tecido da artéria carótida pode ser dissociado mais completamente quando combinado com o reagente de dissociação B. Encontramos ainda uma contagem de células viáveis de nove artérias, e o diâmetro celular médio satisfez os requisitos de sequenciamento unicelular após digestão celular em duas etapas (Figura 2C). Enquanto isso, um total de 176.000 células únicas foi coletado de nove carótidas esquerdas, e a maioria dos vasos vasculares foi dissociada em células únicas com alta viabilidade (Figura 2C).
Após alinhamento, filtragem, contagem de código de barras e contagem UMI, os dados brutos de sequenciamento unicelular foram analisados com o pacote R Seurat. A distribuição dos genes por célula, UMI por célula e leituras mitocondriais por célula são mostradas em gráficos de violino (Figura 3A-C). Notavelmente, uma mediana de ~2500 transcritos por célula foi detectada em cada célula da artéria carótida. Após a remoção das células de baixa qualidade, 14.580 células foram detectadas e usadas para análise de RNA-seq de célula única a jusante. Usando 2000 genes variáveis com perfis semelhantes, o agrupamento não supervisionado baseado em Seurat mostrou quatro tipos celulares principais, incluindo CMLVs (74,0%), fibroblastos (16,5%), CE (6,5%) e Mφ/DCs (3,0%), em artérias carótidas normais de camundongos após a digestão (Figura 3D-F).
Figura 1: Diagrama esquemático da digestão da artéria carótida de camundongos. Após o isolamento e corte da artéria carótida de camundongos, 500 μL do reagente de dissociação A foram adicionados para dissociar a artéria carótida de camundongos. Quando a suspensão celular foi filtrada e centrifugada, 200 μL do reagente de dissociação B foram adicionados para posterior dissociação para obter uma suspensão de célula única. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Preparação da suspensão unicelular da artéria carótida de camundongo. (A) A morfologia celular e a viabilidade celular das células da artéria carótida após 1 h de digestão com o reagente de dissociação A são mostradas na visão de campo brilhante e na coloração AOPI. As células nucleadas coradas com fluorescência verde são células vivas, enquanto aquelas coradas com fluorescência vermelha são células mortas. Barra de escala = 100 μm. (B) A morfologia celular e a viabilidade celular das células da artéria carótida após digestão celular em duas etapas são mostradas na visão de campo claro e na coloração AOPI. As células nucleadas coradas com fluorescência verde são células vivas, enquanto aquelas coradas com fluorescência vermelha são células mortas. Barra de escala = 100 μm. (C) A viabilidade celular, a contagem total de células, a contagem de células viáveis e o diâmetro celular médio foram medidos após digestão celular em duas etapas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Métricas de controle de qualidade padrão (QC) para scRNA-seq e a paisagem celular da artéria carótida . (A) Gráficos de violino mostrando a distribuição de genes por célula (nFeature RNA), (B) UMI por célula (nCount_RNA) e (C) leituras mitocondriais por célula (porcentagem mt) para os dados scRNA-seq. (D) Gráfico de aproximação e projeção de variedades uniformes (UMAP) mostrando os quatro tipos celulares identificados da artéria carótida. (E) Gráfico de pontos mostrando os marcadores que definem cada tipo de cluster de células no painel D. O tamanho de cada círculo denota a proporção de células dentro do grupo que expressa cada transcrito. Os pontos azuis indicam genes altamente expressos e os pontos cinzas indicam genes com baixa expressão. (F) Gráfico de barras empilhadas exibindo a abundância relativa dos quatro tipos celulares detectados por scRNA-seq de camundongos selvagens (WT). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade da artéria carótida de camundongos selvagens, no qual um método de digestão em duas etapas integrando o processo de digestão de colagenase/DNase e tripsina foi construído. Após a verificação de qualidade da suspensão de célula única, verificamos que ela satisfazia os requisitos para sequenciamento de célula única, com viabilidade de células acima de 85% e alta concentração celular. Além disso, uma variedade de tipos celulares na artéria carótida, incluindo CMLVs, fibroblastos, CE e Mφ/DCs, foram detectadas com sucesso após processamento de dados de célula única.
Os métodos atuais de preparo de suspensões unicelulares carotídeas ainda são escassos. Depuydt e col. obtiveram uma suspensão unicelular de placas carotídeas humanas combinando colagenase, DNase, Albumina Humana Fração V e Flavopiridol a 37 °C por 30 min15. Após a classificação celular ativada por fluorescência, eles identificaram 14 populações celulares distintas, incluindo células endoteliais, células musculares lisas, mastócitos, células B, células mieloides e célulasT15. Além disso, os pesquisadores digeriram artérias carótidas comuns de ratos usando 0,25% de tripsina-EDTA e 0,1% de colagenase a 37 °C e realizaram com sucesso o sequenciamento de RNA de célula única16. Cinco tipos celulares, incluindo CMLVs, fibroblastos, CE, células transicionais e macrófagos, foram identificados em artérias carótidas normais e experimentais16. Além disso, um protocolo para a obtenção de preparações unicelulares enriquecidas com CE da artéria carótida também foi estabelecido17. Após completar a digestão enzimática luminal, o flushing carotídeo obterá pastilhas unicelulares suficientes para scRNAseq e scATACseq17. Para controlar de forma flexível o tempo de digestão, desenvolvemos um método de digestão em duas etapas para as artérias carótidas de camundongos, separando as etapas de dissociação tecidual e preparação da suspensão unicelular. O processo inicia-se com 125 CDU/mL de colagenase II e 60 U/mL de DNase I por 1 h, seguido de tripsina livre de EDTA por 5 min. Significativamente, podemos modificar adequadamente qualquer etapa do método para a digestão de outros tecidos dos vasos sanguíneos com base nas características dos vasos sanguíneos.
Existem algumas limitações do método descrito. Primeiro, não sabemos se este método pode ser usado para cultura primária de células in vitro. Como a parede da artéria carótida é mais fina e tem menos células, como cultivar e expandir in vitro é um desafio. Em segundo lugar, ao contrário de outros métodos de digestão, este protocolo requer pipetagem suave para dissociar as células durante a digestão. Um banho de água agitada também pode resultar em uma suspensão de célula única de boa qualidade. Em terceiro lugar, uma vez que nosso método é aplicável às artérias carótidas normais, ainda precisa ser estudado se ele é adequado para a digestão da placa carotídea.
Em conclusão, projetamos um método de digestão em duas etapas para obter uma suspensão unicelular de alta qualidade da artéria carótida de camundongos selvagens. Este protocolo pode ser usado para preparar suspensões unicelulares para outros vasos com pequenas modificações, tornando-o muito útil na pesquisa cardiovascular.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsas da Natural Science Foundation of China (82070450 para C.T. e 82170466 para L.Z.) e pela bolsa da China Postdoctoral Science Foundation (7121102223 para F.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
References
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