Summary
该协议提出了一种生理学相关的肿瘤芯片模型，用于执行高通量基础和转化人类癌症研究，推进药物筛选、疾病建模和个性化医疗方法，并描述了加载、维持和评估程序。
Abstract
缺乏经过验证的癌症模型来概括 体外 实体癌的肿瘤微环境仍然是临床前癌症研究和治疗开发的重大瓶颈。为了克服这个问题，我们开发了血管化微肿瘤（VMT）或肿瘤芯片，这是一种微生理系统，可以真实地模拟复杂的人类肿瘤微环境。VMT通过在动态生理流动条件下共培养多种人类细胞类型，在微流控平台 内从头 形成。这种组织工程微肿瘤结构包含一个活的灌注血管网络，该网络支持不断增长的肿瘤块，就像新形成的血管 在体内一样。重要的是，药物和免疫细胞必须穿过内皮层才能到达肿瘤， 从而 模拟体内治疗递送和疗效的生理障碍。由于VMT平台是光学透明的，因此可以通过直接可视化组织内荧光标记的细胞来实现免疫细胞外渗和转移等动态过程的高分辨率成像。此外，VMT保留了 体内 肿瘤异质性、基因表达特征和药物反应。几乎任何肿瘤类型都可以适应该平台，来自新鲜手术组织的原代细胞在VMT中生长并对药物治疗做出反应，为真正的个性化医疗铺平了道路。本文概述了建立VMT并将其用于肿瘤学研究的方法。这种创新方法为研究肿瘤和药物反应开辟了新的可能性，为研究人员提供了推进癌症研究的有力工具。
Introduction
癌症仍然是全球主要的健康问题，也是美国的第二大死因。仅在 2023 年，美国国家卫生统计中心就预计美国将有超过 190 万例新发癌症病例和超过 600,000 例癌症死亡1，这凸显了对有效治疗方法的迫切需要。然而，目前，只有5.1%的进入临床试验的抗癌疗法最终获得了FDA的批准。有希望的候选药物未能成功通过临床试验可部分归因于在临床前药物开发过程中使用了非生理模型系统，例如 2D 和球状培养物 2。这些经典癌症模型缺乏肿瘤微环境的基本组成部分，例如基质生态位、相关免疫细胞和灌注脉管系统，这些都是治疗耐药性和疾病进展的关键决定因素。因此，为了改善临床前发现的临床转化，需要一种更好地模拟人类 体内 肿瘤微环境的新模型系统。
组织工程领域正在迅速发展，为在实验室环境中研究人类疾病提供了改进的方法。一个重要的发展是微生理系统（MPS）的出现，也称为器官芯片或组织芯片，它们是功能性的小型化人体器官，能够复制健康或疾病条件3,4,5。在此背景下，肿瘤芯片是基于三维微流控的体外人类肿瘤模型，已被开发用于肿瘤学研究2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 .这些先进的模型在动态肿瘤微环境中结合了生物化学和生物物理线索，使研究人员能够在更相关的生理环境中研究肿瘤行为和对治疗的反应。然而，尽管有这些进步，但很少有小组成功地整合了活的、功能性的脉管系统，特别是响应生理流动的自我模式的脉管系统3,4,5,6。功能性血管网络的加入至关重要，因为它允许对影响药物或细胞递送的物理屏障、细胞归巢到不同微环境以及肿瘤、基质和免疫细胞的跨内皮迁移进行建模。通过包含这一特征，肿瘤芯片可以更好地表示在体内肿瘤微环境中观察到的复杂性。
为了满足这一未满足的需求，我们开发了一种新型药物筛选平台，使微流控装置8,9,10,11,12,13,14,15,16形成微血管网络。这种基础器官芯片平台被称为血管化微器官 （VMO），几乎可以适应任何器官系统，以复制原始组织生理学，用于疾病建模、药物筛选和个性化医疗应用。VMO 是通过共培养内皮集落形成细胞来源的内皮细胞 （ECFC-EC）、HUVEC 或 iPSC-EC（以下简称 EC）和腔室中的多个基质细胞（包括重塑基质的正常人肺成纤维细胞 （NHLF）和包裹和稳定血管的周细胞）来建立的。VMO也可以通过将肿瘤细胞与相关基质共培养来建立为癌症模型系统，以创建血管化微肿瘤（VMT）8,9,10,11,12,13或肿瘤芯片模型。通过在动态流动环境中共培养多种细胞类型，灌注的微血管网络在装置的组织室中从头形成，其中血管生成受到间质流速的密切调节14,15。培养基由静水压力头驱动通过设备的微流体通道，静水压力头仅通过微血管为组织室的周围细胞提供营养，渗透系数为 1.2 x 10-7 cm/s，类似于体内毛细血管的可见值 8。
将自组织微血管纳入VMT模型代表了一项重大突破，因为它：1）模拟体内血管化肿瘤肿块的结构和功能;2）可以模拟转移的关键步骤，包括肿瘤-内皮细胞和基质细胞相互作用;3）建立营养和药物递送的生理选择性屏障，改善药物筛选;4）允许直接评估具有抗血管生成和抗转移能力的药物。通过在复杂的 3D 微环境中复制营养物质、药物和免疫细胞的体内递送，VMO/VMT 平台是一种生理相关模型，可用于进行药物筛选和研究癌症、血管或器官特异性生物学。重要的是，VMT 支持各种类型肿瘤的生长，包括结肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、胶质母细胞瘤、肺癌、腹膜癌、卵巢癌和胰腺癌 8,9,10,11,12,13。除了成本低、易于建立和排列用于高通量实验外，微流控平台还完全光学兼容，可用于肿瘤-基质相互作用和对刺激或治疗的反应的实时图像分析。系统中的每种细胞类型都用不同的荧光标记物标记，以便在整个实验过程中直接可视化和跟踪细胞行为，从而为动态肿瘤微环境创造一个窗口。我们之前已经表明，与标准培养模式相比，VMT 更忠实地模拟体内肿瘤生长、结构、异质性、基因表达特征和药物反应10。重要的是，VMT支持患者来源细胞（包括癌细胞）的生长和研究，与标准球状体培养物相比，它更好地模拟了母体肿瘤的病理学，并进一步推进了个性化医疗工作11。这份手稿概述了建立VMT的方法，展示了其在研究人类癌症方面的效用。
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Protocol
1. 设计与制造
- 设备设计
- 对于微流控器件制造，使用200μm的SU-8旋涂层在Si晶圆上（RCA-1清洁和2%氟化氢（HF）处理）创建SU-8模具，然后进行如前所述的单个掩模光刻步骤8,9。
- 从 SU-8 模具中铸造一个 4 毫米厚的聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 复制品，以生成用于下游制造步骤的耐用聚氨酯模具。可以使用各种设计迭代8、9、10、11、12、13、14、15。
- 在当前的迭代中，将微流控装置设计为定制为标准的 96 孔板格式，并由 2 mm 厚的 PDMS 特征层和 12 个微流体装置单元组成，底部由薄（1/16 英寸）透明聚合物膜层包围（图 1A）。
- 确保单个组织单元由一个组织室组成，其两侧是凝胶加载入口 （L1） 和出口 （L2）、压力调节器 （PR）16 和连接到每侧 2 个培养基入口和出口的解耦微流体通道（M1-M2、M3-M4; 图1B）。
- 将每个入口和出口放置在单个孔中，该孔用作介质储层，以在微流体通道上建立静水压力（10 mm H2O）。为了允许血管网络与外部通道吻合，通过 50 μm 宽的通信孔（顶部 6 个，底部 6 个）将微流体通道连接到组织室。
注意：微流体电阻器在组织室中产生 5 mm H2O 间质压力梯度，一旦血管网络完全形成，该梯度就会变成腔内压力梯度 8,10。后续程序从完全组装的高通量板开始。
图 1.微流控平台设计。 （A） 平台组件的示意图显示了 PDMS 特征层，其中 12 个器件单元粘合到无底 96 孔板上，并用薄的透明聚合物膜密封。每个设备单元在板上占据一列孔。以红色勾勒出的单个设备单元显示在 （B） 中，详细信息显示在 （B） 中。（B） 一个设备单元的示意图显示，位于 96 孔板的一个孔内的单个组织室和两个带有入口和出口 （L1-L2） 孔的加载端口，以允许引入细胞基质混合物。介质入口和出口（M1-M2、M3-M4）是打孔的，并位于用作介质储层的井内。不同体积的培养基通过解耦的微流体通道在组织室中建立静水压力梯度。压力调节器 （PR） 装置用作凝胶爆破阀，以增加装载的便利性。请注意，该设备的深度为 200 μm，组织室为 2 mm x 6 mm。 请 点击这里查看此图的较大版本.
2. 装货前的准备工作
- 细胞培养
- 根据制造商的建议将细胞保存在加湿的37°C和5%CO2 培养箱中。
- 在上样前 3-4 天，以制造商和用户方案告知的密度，将转导的 EC、NHLF 或其他成纤维细胞/基质细胞和所需癌细胞的板 T75 烧瓶。对于该方案，每种细胞类型每个烧瓶板 1 x 106 个细胞。在内皮生长培养基 2 （EGM2） 完全培养基中培养 EC，在含有 10% FBS 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中培养 NHLF，根据细胞类型在适当的培养基中培养癌细胞。
- 每 2-3 天用相应的培养基喂养一次来维持细胞，并通过在荧光显微镜下观察细胞来重新确认转导或标记效率。在加载当天，确保 EC 为 80%-100% 汇合，而 NHLF 为 70%-80%。
- 纤维蛋白原的制备
- 将纤维蛋白原溶液制备至所需浓度（通常，5-8 mg/mL 支持强大的血管网络形成），占纤维蛋白原凝血的百分比。用以下公式计算所需的纤维蛋白原量：
纤维蛋白原 （mg） = （体积 （mL）） x （浓度 （mg/mL））/（凝血 %） - 通过轻弹管（不要涡旋），将纤维蛋白原溶解在适当体积的内皮基础培养基2（EBM2）中，加热至37°C。将纤维蛋白原在37°C水浴中孵育，使其完全进入溶液中。重要的是，不要使用完整的介质。
- 无菌过滤器纤维蛋白原溶液，含 0.22 μm 过滤器和等分试样至所需体积，通常每个微量离心管 400 μL。
注意：其他基质蛋白（例如胶原蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白）可以加标到纤维蛋白原混合物中。
- 将纤维蛋白原溶液制备至所需浓度（通常，5-8 mg/mL 支持强大的血管网络形成），占纤维蛋白原凝血的百分比。用以下公式计算所需的纤维蛋白原量：
3. 样品的加载
注意：加载是时间敏感的，应在大约 1.5-1.75 小时内从开始（细胞提升）到完成（将培养基添加到设备中）完成，以确保最佳结果。每个步骤都附有建议的计时器，以帮助用户保持正轨。
- 准备材料（装货日）
- 将以下物质置于37°C水浴中10-15分钟：用于洗涤细胞的Hank平衡盐溶液（HBSS）或磷酸盐缓冲盐水（PBS），细胞解离试剂，培养基（例如EGM2，DMEM）
- 将以下试剂保存在4°C冰箱中，直到准备使用：凝血酶，层粘连蛋白（在4°C下解冻过夜）。
- 在室温下解冻纤维蛋白原等分试样。将 1.5 μL 等分试样凝血酶制备到 500 μL 微量离心管中，每个设备单位一个管。确保凝血酶等分试样位于每个试管的底部，以方便加载。
- 在加载之前，将紫外线灭菌的高通量板放入干燥器中至少30分钟，以去除微流体中滞留的空气。
- 细胞制备（定时器开始 = 从 0 分钟开始）
- 在显微镜下以 4 倍放大倍率检查细胞，以确认汇合度和转导效率。
- 用 5 mL HBSS 洗涤每个 T75 细胞瓶 2 次并完全抽吸。向每个烧瓶中加入 1 mL 解离试剂，并在 37 °C、5% CO2 下孵育 1-2 分钟。
- 用手掌轻轻敲击板，检查所有细胞是否都已抬起。
- 用 9 mL 适当的培养基洗涤培养瓶中的细胞，并将它们收集到 15 mL 锥形中。立即取出一小等分试样进行细胞计数。
- 在4°C下以300× g 离心细胞3-5分钟。 离心细胞时，计数细胞。EC 或 NHLF 的汇合 T75 烧瓶应产生至少 2 x 106 个细胞。
- 离心后，吸出培养基并将沉淀重悬于浓度为 1 x 106 个细胞/mL 的适当培养基中。将细胞保持在冰上。
- 细胞和纤维蛋白原混合物的制备（计时器=从20分钟开始）
- 确定将加载多少个设备，添加 1-2 个以考虑移液损失，然后乘以每个设备所需的细胞/纤维蛋白原混合物的体积。这取决于器件配置，但对于本文介绍的器件设计，每个器件需要 6 μL。
- 每种细胞类型的浓度应通过实验确定。作为起点，以大约 7 x 106 个细胞/mL 的浓度加载 EC，以 3.5 x 106 个细胞/mL 的浓度加载 NHLF。癌细胞的浓度可能因生长速率而有很大差异，但通常在 0.5-2 x 106 个细胞/mL 的范围内。使用此公式计算所需的单元格数：
所需细胞数 =（纤维蛋白体积 （μL））/1000 μL x（细胞浓度） - 以 1 x 106 个细胞/mL 的浓度重悬细胞，并使用以下公式确定所需细胞的体积：
所需细胞体积 （μL） =（所需细胞数）/1000 - 将各自体积的EC，NHLF和癌细胞（仅用于VMT）混合在锥形管中，并在4°C下以300× g 离心3-5分钟。
- 旋转后，小心地吸出培养基，并用移液吸走沉淀附近的任何残留培养基。轻轻但彻底地将沉淀重悬到计算的纤维蛋白原体积中，格外注意不要引入气泡。保持在冰上。
- 将灭菌的平板和凝血酶等分试样带入组织培养罩中。
- 加载设备（计时器 = 从 30-35 分钟开始）
- 使用 P20 移液器，从细胞/纤维蛋白混合物中移取 6 μL 体积。确保将混合物上下移液至少 5 次，以确保细胞悬浮均匀。将混合物放在冰上以减缓凝固。
- 将移液管吸头直接放入管底部的凝血酶等分试样中，轻轻地将细胞/纤维蛋白混合到一管凝血酶中。立即上下移液至少 2 次，注意不要引入气泡。一旦与凝血酶混合，纤维蛋白就会开始凝结，因此请快速但有意识地完成步骤 3.4.3。和 3.4.4.在移液器吸头中的纤维蛋白凝胶之前（~3 s）。
- 以一定角度抬起高通量板，然后将移液器吸头快速插入其中一个设备加载端口（L1 或 L2）。原理图见 图2A 。
- 以平稳、流畅的运动将移液器柱塞向下推到第一个停止点，将细胞/纤维蛋白混合物注入组织室。观察凝胶是否完全穿过腔室。
注意：在此步骤中施加过大的压力会导致凝胶爆裂到组织室顶部和/或底部的微流体通道中。 - 轻轻地将板平放回组织培养罩中，不要取下移液器吸头、松开移液器柱塞或干扰移液器。用手拧动移液器吸头，将其从P20上取下，然后将其留在装载端口孔中。请勿使用弹出按钮卸下尖端，因为这会导致压力过大。
- 对其余设备继续执行步骤 3.4.1-3.4.5。
- 加载完成后，让板在组织培养罩中不受干扰地静置 2 分钟。
- 轻轻扭转移液器吸头并将其从装载端口中拉出，取出移液器吸头。盖上盘子上的盖子。
- 将整个板在37°C培养箱中孵育15-20分钟，使凝胶完全聚合。
- 孵育后，在显微镜下检查每个设备单元。检查细胞均匀分布在整个腔室中，没有任何气泡，并且组织室和微流体通道之间是否存在清晰可见的凝胶界面，如图2B-C所示。
- 层粘连蛋白通道涂层（计时器=从45-50分钟开始）
- 凝胶完全固态后，将层粘连蛋白引入微流体通道以促进血管吻合。
- 使用 P20，将 4 μL 层粘连蛋白引入设备的每个微流体通道（顶部和底部）。将移液管吸头插入 M1 或 M3 并缓慢排出层粘连蛋白，观察以确保层粘连蛋白覆盖整个顶部通道，然后重复 M2 或 M4 以覆盖整个底部通道。
- 通过从压力调节器对面的一侧移液层粘连蛋白来确定方向，以允许足够的压力将其推过。但是，如果层粘连蛋白不容易从一侧移动，请从一侧取下尖端并从另一侧推动层粘连蛋白。可能需要进入移液器的第二个停止点（即，将柱塞一直向下推）以产生足够的压力以推动层粘连蛋白通过整个通道。
- 轻轻地从介质入口/出口中取出吸头。请勿使用 P20 上的弹出按钮。
- 对每个装置重复步骤3.5.1-3.5.4，并将板在37°C，5%CO2 下孵育10分钟。
- 介质添加（计时器 = 大约从大约 1 小时 10 分钟开始）
- 将 275 μL EGM2 完全培养基加入 A 行和 B 行或 G 行和 H 行孔的无偶联培养基储层中。这将是高侧，方向应通过使压力调节器对面的井开始高容量来确定。介质将被重力从高处推开。
- 使用 P200 移液器，将 75 μL 培养基引入含有 275 μL EGM2 的孔的培养基入口/出口中。将吸头插入介质入口孔并缓慢排出介质，观察介质通过通道并在另一侧冒泡。
- 取出移液器吸头，将吸头中的剩余培养基推入培养基储液器中，使高压侧的总体积为350μL。
- 对每个设备单元、顶部和底部通道重复步骤 3.6.1-3.6.3。
- 加入 50 μL 培养基以完全覆盖低侧，即 A 和 B 行或 G 和 H 行中的孔，具体取决于上述方向。确保有一层均匀的介质覆盖在井底。有关储层中介质体积的示意图，请参阅 图2D 。
- 去除气泡（装载后）
注意： 去除气泡是确保每个设备正常流动的关键步骤。到第2天，内皮细胞和成纤维细胞将开始响应流动而伸展（图2E）。- 加入所有培养基后，在37°C，5%CO2 培养箱中孵育板1-2小时，然后检查通道或培养基入口/出口中的气泡。
- 在显微镜上观察培养基通道中的气泡，并通过将 75 μL 培养基重新引入通道中以将气泡推出来排出。
- 通过肉眼观察介质入口/出口中的气泡。使用 P200 移液器通过向下推动柱塞，将吸头引入孔中，然后通过抬起柱塞施加负压并吸出气泡来拉出气泡，从而去除滞留在介质入口和出口处的气泡。
图2.设备加载示意图。 （A） 使用 P20 移液器，通过其中一个加载端口将细胞/纤维蛋白混合物引入每个设备单元的组织室。（B） 明场显微照片显示微流控装置加载 EC、成纤维细胞和癌细胞以形成 VMT。比例尺 = 500 μm。 （C） B中设备的荧光显微照片，显示红色的EC，青色的肿瘤和蓝色的成纤维细胞。（D） 示意图显示了在储液罐中加入介质，高压侧 350 μL，低压侧 50 μL 以产生静水压头。（E） VMT 培养的第 2 天显示成纤维细胞和 EC 开始伸展以形成血管网络。比例尺 = 200 μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
4. 设备维护和实验应用
- 维持和药物治疗
注意：为了保持系统中的流量，必须每天通过将介质体积从低侧移液回高侧来重新建立静水压力，反之亦然，确保高压侧的总体积保持在 350 μL。 在 VMO 或 VMT 建立的第 2 天后，每天切换流向。下面提供了其他维护和治疗细节。- 每隔一天更换一次培养基，完成 EGM2，直到脉管系统完全建立（第 5-6 天）。完全吸出旧介质并更换高压孔 （350 μL） 和低压孔 （50 μL）。
注：可以对其他细胞类型进行优化培养基配方的实验测定，通常涉及 50：50 混合或将特定组分添加到 EGM2 中。 - 一旦血管网络形成并且组织完全发育（第 4-7 天），在使用设备进行实验之前进行葡聚糖灌注试验（步骤 4.2.1.）。仅使用充分灌注到组织室的设备。
- 对于使用治疗剂的实验，在治疗开始的当天，在每个设备的所有荧光通道中拍摄图像。这将作为基线。
- 通过用含有所需浓度的稀释药物的新鲜培养基替换培养基，用所需的治疗剂处理设备。确保根据制造商的建议在适当的载体中稀释药物，但培养基中的DMSO含量不超过0.01%。
- 将设备暴露于药物所需的时间（通常为48小时，但可以通过药代动力学告知）。
- 以所需的时间间隔对每个设备的每个通道进行成像，以监测治疗反应。在实验期间按照步骤4.1.1中的指示保持板。
- 实验完成后，漂白板并放入生物危害容器中，用4%PFA固定用于免疫荧光染色（步骤4.3），或收获用于活细胞或RNA分离（步骤4.4）。
- 每隔一天更换一次培养基，完成 EGM2，直到脉管系统完全建立（第 5-6 天）。完全吸出旧介质并更换高压孔 （350 μL） 和低压孔 （50 μL）。
- 灌注试验
- 右旋糖酐灌注
注意：血管通透性/通畅性可以通过用不同分子量（40 kD、70 kD 或 150 kD）的荧光标记葡聚糖灌注血管网络来确定。根据 EC 的荧光标记，可以使用 FITC 或罗丹明-葡聚糖。- 在灌注之前，通过在空装置的流体通道或腔室中加入几μL葡聚糖来确定FITC或罗丹明通道的适当暴露。通过使用显微镜软件将曝光时间设置为略低于饱和度水平，以显示像素强度的直方图，确保以均匀分布的像素为特征的动态范围，而不会出现任何明显集中的高强度值。
- 拍摄感兴趣通道中所有设备的显微照片，包括荧光葡聚糖通道中所有设备的背景图像，以针对背景进行校准。使用与上述相同的曝光，并将组织室对齐在图像框的中心，以确保用于定量的图像一致。
- 在 1x DPBS 中制备浓度为 5 mg/mL 的 FITC-葡聚糖或罗丹明-葡聚糖的主要储备液。该储备液可以保存在4°C。
- 要制备工作原液，请在 EGM2 中将 5 mg/mL 原液稀释至终浓度为 50 μg/mL。
- 用稀释的葡聚糖溶液替换储液中的培养基，作为最大体积的一半（175μL进入一个孔中，以及组织室顶部或底部通道上的高侧）。更换其他孔中的培养基，使未偶联的高侧获得 175 μL 不含葡聚糖的新鲜 EGM2，而低侧的孔中每个孔中只有 50 μL。
注意：葡聚糖只能添加到微流体通道的一侧（顶部或底部），以允许可视化染料通过高压侧，进入血管床，并从低压侧流出。 - 在显微镜下，观察荧光葡聚糖是否流过血管网络。这通常会在将染料添加到培养基储液器后大约 2 分钟内发生。
- 开始对荧光葡聚糖通道（和其他通道，如果需要）进行成像。这是 T = 0 时间点。在多个时间点（通常每 10 分钟）拍摄其他图像或单个端点图像。
- 细胞灌注
注意：根据研究设计，可以通过脉管系统灌注各种细胞类型，包括用于癌症免疫学研究的淋巴细胞或巨噬细胞，以及用于转移研究的癌细胞。细胞必须进行荧光标记，以便于随时间推移进行跟踪。- 在灌注细胞前至少2小时，如上所述在所有设备上进行葡聚糖灌注。此步骤对于在添加细胞之前确定血管通畅性很重要。
- 确定要灌注的细胞的适当相机曝光。取一小块细胞样本在显微镜下观察，并设置该荧光标记物的曝光时间。将曝光时间设置在饱和度以下。
- 拍摄感兴趣通道中所有设备的显微照片，包括荧光葡聚糖通道中所有设备的背景图像，以针对背景进行校准。使用与步骤4.2.2.1中确定的相同的曝光。
- 在收获细胞进行灌注之前，确认葡聚糖已完全扩散出组织室。收获并计数感兴趣的细胞。
- 将适当密度的细胞重悬于EGM2中。例如，通常以大约 1 x 106 个细胞/mL 的速度添加 T 细胞以模拟血液中的浓度。
注意：EC 对培养基成分敏感，但可以容忍与大多数其他培养基混合高达 50%。事先测试。 - 将 175 μL 细胞悬液加入到每个装置高侧的一个孔中，并将 175 μL EGM2 完全加入到另一个孔中。在低端，向两个孔中加入 50 μL EGM2 完全培养基。
- 在显微镜下，观察荧光细胞流过血管网络。这通常会在将细胞添加到培养基储液库后大约 2 分钟内发生。
- 建立细胞流后，开始对荧光细胞通道（以及其他通道，如果需要）进行成像。这是 T = 0 时间点。根据研究设计，在多个时间点或单个终点图像拍摄其他图像。例如，每 10 分钟成像一次将产生高分辨率时间过程或每 6-12 小时一次以跟踪周期性细胞运动。
- 右旋糖酐灌注
- 免疫荧光 （IF） 染色
- 从孔中吸出介质。向每个设备单元的高端的两个孔中加入 200 μL 4% PFA，向低端加入 50 μL。让PFA在室温过腔室15分钟，或在4°C过30分钟。
- 在孵育期间，制备一个 24 孔板，每孔含有 500 μL 1x PBS。计算对每个设备进行染色需要多少个孔。
- 从孔中完全除去PFA。将板倒置并小心地取下膜上的塑料背衬。
注意：IF染色也可以在不去除膜和设备的情况下 原位 进行。为此，通过VMO/VMT灌注试剂来执行染色步骤，并将每个孵育步骤的持续时间增加约6倍。 - 非常轻柔和小心地从设备的特征层上剥离底膜层，通过抓住两个角并以缓慢而平稳的动作向下拉来暴露组织室。大部分组织应保留在组织室中。请参阅 图 3A。
- 使用剃须刀片或手术刀施加足够的力以完全切开特征图层，并在每个单独的设备单元周围切一个小矩形，如 图 3B 所示。
- 在特征层和孔板之间楔入刮刀。在特征层下方施加轻轻的压力，小心地从孔板上取下包含组织室的整个特征层。
- 将每个包含组织的矩形PDMS特征层片面朝下放入含有PBS的单个孔中。
- 一旦所有装置都在孔中，通过将板放在温和的摇杆上5分钟，从孔中吸出PBS，并用500μL新鲜PBS代替PBS，用PBS洗涤。重复总共 3 次洗涤。
- 从每个孔中吸出PBS，并用500μL0.5%Triton-X的PBS溶液透化组织，在温和的摇杆上每次2次10分钟。去除透化溶液。
- 在室温下，在0.1%Triton-X中的500μL10%血清中封闭1小时，轻轻摇晃。
- 将 3% 血清中的 0.1% Triton-X 中的一抗稀释至所需浓度和体积。除去封闭溶液并加入足够的一抗溶液以完全覆盖每个孔的底部并允许设备组织自由移动（~200μL）。用透明薄膜覆盖板。
- 将板在4°C下摇动过夜孵育。 第二天，将装有设备组织的板带回室温（~15分钟）。
- 从每个孔中抽吸一抗溶液，并用 500 μL PBS 洗涤室，每次 3 次，每次 5 分钟，在温和的摇杆上。
- 在所需浓度的 0.1% Triton-X 的 3% 血清中加入 200 μL 二抗。在室温下在黑暗中轻轻摇晃孵育板1小时。
- 吸出二抗溶液并用 PBS 洗涤，每次 3 次，每次 5 分钟，轻轻摇晃。在黑暗中摇摆时，在0.1%Triton-X中加入1x DAPI溶液10分钟。
- 使用镊子从板上取下含有染色组织的矩形设备切口，并将纸巾面朝上放在纸巾上。
- 将几μL（~10μL）抗淬灭溶液直接移液在每个腔室和盖玻片上，注意不要引入气泡。让抗淬灭剂在室温下在黑暗中固化过夜，然后进行成像。
- 用于分子检测的组织和细胞分离
注意：每个高通量板将包含大约 1-2 x 105 个细胞，具体取决于收获的时间点。调整实验重复次数，以考虑总细胞数以及收获过程中的潜在损失。- 单细胞分析
- 从每个孔中抽吸培养基并反转高通量板，使器件层朝上。
- 取下膜上的塑料背衬。非常轻柔和小心地将 PDMS 底膜从设备的特征层上剥离，通过抓住两个角并以缓慢而平稳的动作向下拉来暴露组织室。
- 即使通过适当的粘合，膜也可以去除。去除膜后，大部分组织应留在组织室中;但是，如果任何部分粘在膜上，请按照膜本身的以下步骤操作。
- 用 500 μL HBSS 或 PBS 洗涤每个设备单元。向每个设备单元中加入 100 μL 解离试剂，并使其以液滴形式放置在设备顶部。将板放回37°C培养箱中5分钟。
- 消化后，使用 P200 移液器在组织室中上下移液，并在解离试剂中收集组织。在每个装置上来回移动移液器吸头以确保完全去除组织，并用 500 μL EGM2 收集到 15 mL 锥形中以中和解离试剂。
- 为了从组织室中完全去除剩余的细胞，向每个设备单元中加入 500 μL EGM 2 并用 P200 移液管洗涤。
- 在4°C下以300× g 离心含有脱落组织的消化溶液5分钟，以沉淀单个细胞和整个组织。
- 小心吸出培养基，并向组织中加入 500 μL 1 mg/mL （200 U/mL） IV 型胶原酶、0.1 mg/mL V 型透明质酸酶和 200 U/mL HBSS IV 型 DNA 酶。
- 轻轻重悬后，让溶液在室温下静置2分钟，然后再次轻轻移液以解离凝胶。
- 用10mL EGM 2洗涤消化混合物，并在4°C下以300× g 离心5分钟。 将细胞重悬于含有1%BSA或HSA的1x DPBS中，并通过以200× g 旋转1分钟通过预润湿的70μm过滤器。
- 计数细胞并调整体积，使最终浓度为 1000 个细胞/μL。 然后可以对细胞悬浮液进行 FACS、流式细胞术或单细胞 RNA 测序。
- 从整个组织中分离 RNA
- 按照上述步骤 4.4.1.1 和 4.4.1.2 操作。
- 将大约 10 μL RNA 裂解缓冲液添加到每个暴露的组织室中，确保缓冲液直接聚集在组织顶部。总共不要使用超过 100 μL 的 RNA 裂解缓冲液。
- 在室温下孵育3分钟。使用 P20 在每个设备单元上上下移液，必要时使用移液器吸头刮除组织室中的任何残留材料。
- 将尽可能多的裂解缓冲液转移到 1.5 mL 微量离心管中。重复步骤4.4.2.2.-4.4.2.3。对于剩余的器械，并将样品混合到 1.5 mL 管中。
- 按照制造商的说明分离 RNA，具体取决于试剂盒或试剂。
- 单细胞分析
图3.用于免疫染色的准备平台。 （A） 顶部有膜层的全组装设备平台示意图。要去除膜，请小心地以稳定、轻柔的动作向下拉外层的每个角。（B） 完全去除膜层后，使用刀片、手术刀或小刀在每个设备单元的组织室周围切割矩形，注意不要切入组织本身。然后，可以在每个矩形下楔入刮刀，将其从板上移开，并将每个单元放入带有 PBS 的 24 孔板的单个孔中进行染色。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Representative Results
按照此处概述的方案，使用商业购买的 EC、NHLF 以及用于 VMT 的三阴性乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 建立 VMO 和 VMT。已建立的 VMO 也灌注癌细胞以模拟转移。在每个模型中，在共培养的第 5 天，血管网络响应重力驱动的流经组织室而自组装，作为 体内 营养物质、治疗药物、癌症或免疫细胞输送到基质生态位的管道（图 4）。首先通过将 mCherry 标记的 EC 引入组织室来建立 VMO，如 图 4A （培养的第 0 天）所示，细胞分布均匀。在VMO培养的第2天，EC开始伸展和流明化（图4B），到第4天，EC已经与外部微流体通道吻合并形成连续的血管网络（图4C）。在脉管系统形成吻合口并衬里外通道后，用 70 kD FITC-葡聚糖灌注 VMO 组织以确认血管通畅（图 4D）。FITC-葡聚糖被引入具有最高静水压力的介质储液器中，并允许通过从高压侧到低压侧的微血管灌注整个组织室，如箭头所示。在 VMO 中，FITC-葡聚糖在 15 分钟内完全灌注微血管网络，血管渗漏极少，证实了紧密的血管屏障功能（图 4E）。然后将MDA-MB-231细胞灌注到VMO中，其中细胞粘附在内皮衬里（图4F）并在灌注后24小时内外渗到血管外空间，在组织室内形成多个微转移（图4G）。每 50 毫秒在倒置共聚焦显微镜上用 4 倍和 10 倍空气物镜拍摄延时显微荧光图像，以实时观察癌细胞通过微血管系统灌注的情况（补充视频 1、补充视频 2）。
在 VMO 中，可以看到 T 细胞在 45 分钟内外渗到细胞外空间（图 4H-I）。在共聚焦显微镜上拍摄延时荧光显微照片，每 15 分钟采集 150 μm 深度的 z 堆栈，以实时观察 T 细胞外渗（补充视频 3）。如图4J所示，MDA-MB-231 VMT具有完全形成的，无渗漏的血管灌注T细胞（黄色），其中许多细胞迅速粘附在血管壁上（箭头;图 4K、补充视频 4、补充视频 5）。除了先前的研究8,9,10,11,12,13,14,15之外，这些结果分别证明了VMO和VMT平台在免疫学和免疫肿瘤学研究中的实用性。
图4.MDA-MB-231、VMT 和 VMO 的代表性结果。 （A） 将细胞加载到组织室后第 0 天立即进行 VMO。EC 以红色显示。比例尺 = 500 μm。 （B） 在 VMO 培养的第 2 天，EC 开始响应流动而拉伸。（C） VMO 第 4 天显示血管网络与外部微流体通道吻合，血管接近成熟。（D） VMO 网络在培养的第 5 天完全灌注并获得专利。容器显示为红色，70 kD FITC-葡聚糖绿色。流向用箭头表示。比例尺 = 500 μm。 （E） 灌注 VMO 的缩放视图。比例尺 = 100 μm。 （F） MDA-MB-231（青色）通过 E 所示的相同 VMO 网络灌注，并且在时间 0 时，癌细胞粘附在内皮血管内壁（箭头）上。比例尺 = 100 μm。 （G） 到 24 小时，MDA-MB-231 细胞外渗到细胞外空间，在血管壁龛内建立多个微转移。比例尺 = 100 μm。 （H） 延时共聚焦荧光显微镜显示 T 细胞在 45 分钟内通过 VMO （I） 内的微血管外渗。箭头表示外渗区域。比例尺 = 50 μm。 （J） 在 VMT 中建立三阴性乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 并在第 5 天灌注。比例尺 = 500 μm。血管网络在灌注后 15 分钟显示最小渗漏（插图，比例尺 = 100 μm）。（K） MDA-MB-231 VMT（与 B 相同）灌注 T 细胞（黄色），具有多个区域的 T 细胞粘附到血管壁（箭头）。比例尺 = 500 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充视频 1.VMO中卵巢癌细胞的灌注。 通过血管网络（红色）灌注的 COV362 细胞（青色）的延时荧光显微镜，每 50 毫秒以 4 倍物镜成像，持续 1 分钟。 请按此下载此影片。
补充视频 2.在 VMO 中灌注三阴性乳腺癌细胞。 MDA-MB-231细胞（青色）通过血管网络（红色）灌注的延时荧光显微镜，每50毫秒以10倍物镜成像，持续30秒。 请按此下载此影片。
补充视频 3.VMO的T细胞灌注。 延时共聚焦荧光显微镜在 45 分钟内通过 VMO 内的微血管捕获 T 细胞外渗的过程。每 15 分钟获得一次 Z 堆栈图像，步长为 2 μm，深度为 150 μm。血管是红色的，T细胞是黄色的。 请按此下载此影片。
补充视频 4.VMT的T细胞灌注。 通过 MDA-MB-231 VMT 灌注的 T 细胞的延时荧光显微镜，4 倍物镜。每 50 毫秒采集一次图像，持续 30 秒，T 细胞以黄色显示，MDA-MB-231 以青色显示，血管/EC 以红色显示。 请按此下载此影片。
补充视频 5.T 细胞-VMT 灌注的缩放视图。 灌注 T 细胞的 MDA-MB-231 VMT 的 10 倍放大视图（来自 补充视频 4）。每 50 毫秒采集一次图像，持续 30 秒，T 细胞以黄色显示，MDA-MB-231 以青色显示，血管/EC 以红色显示。 请按此下载此影片。
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Discussion
身体中几乎每个组织都通过脉管系统获得营养和氧气，使其成为现实疾病建模和 体外药物筛选的关键组成部分。此外，几种恶性肿瘤和疾病状态由血管内皮功能障碍和高通透性定义 3。值得注意的是，在癌症中，肿瘤相关的脉管系统通常灌注不良、破坏和渗漏，从而成为治疗和免疫细胞递送至肿瘤的障碍。此外，脉管系统可作为癌细胞转移以播种远处组织的管道，并促进细胞间通讯，从而抑制免疫反应，同时进一步促进癌细胞的生长和扩散。这些现象凸显了血管生态位在治疗耐药性和癌症进展中发挥的关键作用，以及在临床前研究期间准确模拟肿瘤微环境的必要性。然而，标准的 体外 模型系统未能包括适当的基质和血管成分或纳入动态流动条件。为了解决当前模型系统中的这些缺点，提出了建立表征良好的微生理系统的方法，该系统支持用于生理肿瘤学研究的活体灌注人类微肿瘤 （VMT） 的形成。重要的是，VMT 模拟了异常肿瘤相关血管和肿瘤-基质相互作用的关键特征，使其成为仿生疾病建模和治疗效果测试的理想选择10。
为了便于使用，该平台不需要任何外部泵或阀门，并且由于采用 96 孔板形式，可以适应标准培养设备和工作流程。此外，已经验证了解决不同生物学问题的不同设备迭代以及已建立的组织和患者特异性区室 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 .虽然该平台可以通过整合各种细胞类型来适应几乎任何器官或组织特异性用途，但必须首先在不同细胞浓度下测试VMO/VMT内的细胞生长和血管生成能力，以确定最佳接种密度和共培养条件。为了建立脉管系统，可以通过选择CD31+细胞从脐带血中购买人内皮集落形成细胞来源的内皮细胞（ECFC-EC）。人脐静脉内皮细胞 （HUVEC） 也可用于在 VMO/VMT 内建立脉管系统，既可以商业购买，也可以从脐带中新鲜分离。此外，诱导多能干细胞衍生的内皮细胞（iPSC-EC）已在该平台中成功测试，开启了完全自体系统的可能性18。商业来源的成纤维细胞（标准的、正常的人肺成纤维细胞，因其血管生成潜力）在 VMO/VMT 中工作良好，一些原代来源的基质细胞群也可以被掺入或替代。原发性肿瘤可以作为单细胞、球状体、类器官或肿瘤块引入 VMT。基质组成可以根据实验需要进行修改，包括用胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白甚至脱细胞组织基质进行加标19。
该协议包括几个关键步骤，在这些步骤中，必须特别注意以避免常见问题（图 5）。在上样过程中，通过小心移液和平稳地引入组织室，确保细胞/纤维蛋白浆液的均匀混合（图5A）。施加适当的压力将凝胶完全排出到腔室中，以防止部分加载（图5B）。观察横穿整个组织室的细胞/纤维蛋白浆液对于确保完整的组织室填充是必要的，并且可以通过将戴手套的手指放在设备单元后面来促进。避免用力按压微量移液器柱塞，以防止细胞/纤维蛋白混合物爆裂到微流体通道中（图5C）。在移液过程中必须注意不要引入气泡，以防止干扰组织发育和下游应用（图5D）。适当的混合和上样速度对于避免凝血不一致的区域至关重要（图5E），而过早取出移液器吸头也可能破坏腔室中的凝胶（图5F）。建议进行练习加载，以使用户熟悉程序的定时元素和加载步骤。此外，将层粘连蛋白正确地引入微流体通道对于 EC 迁移、与外部通道的吻合以及形成连续的、可灌注的营养输送网络至关重要。通道内衬不完整或缺失将导致灌注结果不佳和无法使用的 VMO/VMT。
图5.加载时的常见错误。 （A）微流控装置单元正确加载，无缺陷。（B） 细胞/纤维蛋白混合物未完全引入腔室，导致部分加载。（C）加载过程中施加的压力过大，导致凝胶爆裂进入微流控通道，阻塞流动。（D） 移液时将气泡引入腔室内的细胞/纤维蛋白混合物中。（E） 细胞/纤维蛋白混合物混合不当或加载缓慢导致凝血不一致。（F） 在凝胶充分凝固之前从上样口取出移液器吸头将导致组织室中的细胞/纤维蛋白混合物中断。 请点击这里查看此图的较大版本.
稳健且标准化的分析工作流程在 VMO/VMT 研究中至关重要，因为它们会产生大量成像数据。VMO/VMT的图像处理和分析方法在前面已经描述过8,9,10,11,12,13。对于肿瘤定量分析，使用ImageJ/Fiji（美国国立卫生研究院）20或CellProfiler（Broad Institute）21等开源软件测量代表肿瘤细胞的颜色通道中的荧光强度。设置肿瘤显微成像图像的阈值以选择荧光肿瘤区域，并在该区域内测量平均荧光强度。肿瘤的总荧光强度计算为荧光区域与其平均强度的乘积，归一化为基线值（治疗前），以获得实验期间每个设备肿瘤生长的倍数变化。关于血管定量分析，AngioTool（美国国家癌症研究所）22、ImageJ/Fiji 宏脚本或 MATLAB 软件（如 REAVER23）可用于量化血管总长度、终点数、连接点数、平均血管长度、血管直径、平均腔隙率和血管百分比面积。机器学习算法可以集成到工作流程中，用于自动分析血管图像，以识别有效破坏脉管系统的化合物24。通过测量细胞外空间区域内荧光强度的变化并计算渗透系数10来分析灌注图像。可以使用 COMSOL Multiphysics25 对微血管网络内腔内流动进行有限元仿真。标准化分析方法的实施对于从VMT研究中产生的大量数据中提取有意义的见解至关重要。
此处概述的方案将允许用户利用 VMO/VMT 平台研究肿瘤生物学的许多方面，包括肿瘤生长/进展、肿瘤转移、肿瘤内 T 细胞动力学以及肿瘤对化疗和抗血管生成治疗的反应。为了进行生理相关的免疫肿瘤学研究，证明了新鲜分离的 T 细胞如何灌注通过微血管系统，外渗穿过内皮细胞屏障，并迁移到组织结构中。延时显微共聚焦成像作为一种工具，用于观察空间随机、时间快速事件，包括 T 细胞外渗，这些事件不容易用其他模型系统可视化。此外，我们之前在VMT中测试了多种类型的抗肿瘤药物，包括化疗药物、小分子/酪氨酸激酶抑制剂、单克隆抗体（如抗PD1和贝伐珠单抗）、抗血管生成化合物和血管稳定剂，强调了该平台如何用于测试针对肿瘤和相关基质的不同类别的药物8， 9,10,11,12,13.可以从平台收集流出物，并分析各种细胞因子和外泌体。在未来的研究中，VMT平台可用于评估肿瘤细胞在个体患者水平上对T细胞介导的攻击的敏感性。总之，VMT是一个灵活而强大的平台，是研究肿瘤生物学的理想选择，其中血管和基质成分的重塑是肿瘤进展的关键。
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Disclosures
CCWH拥有Aracari Biosciences， Inc.的股权，该公司正在将本文所述技术的一个版本商业化。该安排的条款已由加州大学欧文分校根据其利益冲突政策进行审查和批准。没有其他利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢Christopher Hughes博士实验室的成员对所述程序的宝贵投入，以及Abraham Lee博士实验室的合作者在平台设计和制造方面的帮助。这项工作得到了以下资助：UG3/UH3 TR002137、R61/R33 HL154307、1R01CA244571、1R01 HL149748、U54 CA217378 （CCWH） 和 TL1 TR001415 和 W81XWH2110393 （SJH）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabrication | |||
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
| Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
| MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
| Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
| Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
| SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
| Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
| Cell culture/Loading | |||
| BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
| CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
| Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
| Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
| Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
| Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
| PBMCs - Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |
References
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