Summary
Burada, Drosophila melanogaster'i ilaçlar ve bitki özleri ile beslemek ve meyve sineklerinin dışkı birikintilerini analiz ederek gastrointestinal sistem üzerindeki etkilerini değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. İlaçla tedavi edilen sinekler, daha fazla araştırma için bir model olarak kullanılabilir.
Abstract
İnsan gastrointestinal fizyolojisini incelemek için, biyomedikal bilim adamları model organizmaların kullanımına güvendiler. Birçok araştırmacı fareleri bağırsak fonksiyonunu incelemek için bir model olarak kullanmış olsa da, sadece birkaç rapor Drosophila melanogaster (D. melanogaster) üzerine odaklanmıştır. Farelerle karşılaştırıldığında, meyve sinekleri kısa bir yaşam döngüsü, uygun maliyetli ve basit bakım ve etik sorun olmaması gibi birçok avantaj sunar. Ayrıca, memeli gastrointestinal fizyolojisi, anatomisi ve sinyal yolları D. melanogaster'de yüksek oranda korunmuştur. Bitki özleri geleneksel olarak ishal ve kabızlığı tedavi etmek için kullanılmıştır. Örneğin, Psidium guajava (P. guajava) tropik bölgelerde en çok bilinen ishal önleyici ajanlardan biridir. Bununla birlikte, ishal önleyici ve müshil ilaçların ve bitki özlerinin D. melanogaster'deki etkisini değerlendiren hiçbir çalışma yoktur ve benzer etkilerin (örneğin, ishal önleyici ilaçlar durumunda daha küçük, daha konsantre ve daha az miktarda dışkı birikintileri) memelilere kıyasla meyve sineklerinde meydana gelip gelemeyeceği bilinmemektedir. Bu çalışmada, ishal fenotipi sunan bir D. melanogaster suşunda P. guajava tarafından indüklenen bir antidiarreal etki gösterilmiştir. Sinekler tarafından üretilen dışkı örneklemesi, boya takviyeli bir gıda kullanılarak izlenir. Bu protokol, ilaçlarla gıda hazırlamak, bu gıda preparatları ile beslenen sineklerin dışkı birikimlerini değerlendirmek ve elde edilen verileri yorumlamak için kullanılan yöntemi ana hatlarıyla belirtir.
Introduction
Sindirim sistemi olarak da adlandırılan gastrointestinal (GI) sistem, besinlerin sindiriminden ve emiliminden ve sindirilmemiş ürünlerin atılımından sorumludur1. Gastrointestinal sistem, rahatsızlığa, ağrıya ve günlük yaşamda aksamalara neden olabilecek bir dizi rahatsızlığa karşı savunmasızdır. Gastrointestinal bozukluklar arasında karın ağrısı ve rahatsızlığı, şişkinlik, mide ekşimesi, hazımsızlık veya hazımsızlık, bulantı, kusma, ishal ve kabızlıkbulunur 2. İshal, GI bozukluğunun en sık görülen semptomudur3 ve 24 saatlik bir süre boyunca en az üç gevşek ve sulu dışkı ile bir hastalık olarak tanımlanır4. İshal, bakteriler, virüsler, parazitler, mantarlar dahil olmak üzere çok çeşitli patojenlerden kaynaklanır ve ayrıca ilaçlardan da kaynaklanabilir 5,6. Dünya çapında ishal, 5 yaşın altındaki çocuklar arasında ikinci önde gelen ölüm nedeni olmaya devam etmektedir7. İshal kendi kendine düzelebilse de, birkaç günden fazla sürerse altta yatan daha ciddi bir duruma da işaret edebilir.
Bağırsak sistemini incelemek için araştırmacılar fareler, sıçanlar ve domuzlar gibi hayvan modellerine yöneliyorlar 8,9. Bununla birlikte, bu hayvanların kullanımı, özel tesisler ve etik hususlar gerektirdiğinden pahalı ve zaman alıcı olabilir. Son çalışmalar, D. melanogaster'in GI yolunu incelemek ve rejeneratif homeostazın sürdürülmesi, immün yaşlanma gelişimi, epitel bariyer fonksiyonunun kaybı ve metabolik homeostazdaki düşüş gibi bazı mekanizmaları araştırmak için bir model olarak kullanılabileceğini göstermiştir10,11. Meyve sineği olarak bilinen D. melanogaster, insanlarla yüksek derecede genetik homolojiyi paylaşır; İnsan hastalığı genlerinin yaklaşık% 75'inin sinek12'de işlevsel bir homologa sahip olduğuna inanılmaktadır. Ayrıca bir ön bağırsak, bir orta bağırsak ve bir arka bağırsaktan oluşan basit bir sindirim sistemine sahiptirler13. D. melanogaster'in laboratuvarda kültürlenmesi kolaydır ve farklı şekillerde genetik olarak değiştirilebilir14. Bu nedenle, in vivo test için D. melanogaster kullanmak, araştırmacıların karmaşık biyolojik süreçleri kontrollü bir ortamda incelemelerine olanak tanıyan güçlü bir araçtır.
Dünya Sağlık Örgütü'ne (WHO) göre, gelişmekte olan ülkelerde yaşayan insanların yaklaşık %80'i temel sağlık ihtiyaçları için geleneksel tıbbı kullanmaktadır15. Şifalı bitkilerin yüksek kullanımı, kolay bulunabilmeleri, ucuz olmaları ve az yan etkiye sahip olmaları ile açıklanabilir16. Bitkisel tedavide kullanılan ana bitki kısımları arasında yapraklar, ağaç kabuğu, kökler, tohumlar17 bulunurken, ana hazırlama yöntemleri infüzyon, kaynatma ve maserasyondur18. Bu bitkisel ilaçlar, insan vücudu üzerinde terapötik etkileri olan alkaloidler, terpenoidler, flavonoidler, steroidler, tanenler vekarbonhidratlar 19 gibi fitokimyasal maddeler içerir. İnsanlar ishal, karın ağrısı ve dizanteri gibi GI bozukluklarını tedavi etmek için çeşitli şifalı bitkiler kullanırlar20. Örneğin, Psidium guajava, dünyada ishali tedavi etmek için en yaygın kullanılan bitkilerden biridir. Çeşitli farmakolojik ve klinik testler güvenliğini zaten göstermiştir, bu da onu21,22'yi incelemek için iyi bir ishal önleyici aday yapar. Bununla birlikte, bitkisel ilaçların başlıca sınırlamaları, etkinlik ve güvenlik değerlendirmesinin eksikliğinin yanı sıra, kullanılan bitki özlerinin bileşimi hakkında kesin ve eksiksiz bilgi eksikliğidir23. Bitkisel ilaçların etkinliğini ve güvenliğini doğrulamak için, deneysel ve klinik doğrulamayı içeren sistematik bir yaklaşım gereklidir ve yaklaşım, in vivo ve in vitro çalışmalardan elde edilen yeterli veri ile desteklenmelidir.
İshal tedavisinde geleneksel ilaçları etkinlikleri açısından değerlendirmek için, fare ve sıçanların kullanımı son yıllarda baskın olmuştur24,25. Daha önce bahsedilen temel avantajlar, yani sinekler ve memeliler arasında kullanım kolaylığı, uygun fiyatlı, tekrarlanabilir, korunmuş emici ve sindirim fonksiyonları nedeniyle, bitkilerin ishal önleyici aktivitesini değerlendirmek için bir model olarak D. melanogaster'i kullanmayı öneriyoruz. D. melanogaster'deki ishal fenotipi, artan dışkı birikintileri, daha büyük tortu boyutları, daha açık bir renklenme (daha az konsantre) ve daha yüksek dışkı materyali26 dahil olmak üzere çeşitli özelliklerle karakterize edilebilir. Bu fenotip, çeşitli parametreler kullanılarak ölçülebilir: dışkı birikintilerinin sayısı, toplam birikinti alanı, ortalama hafiflik ve toplam entegre optik yoğunluk (IOD). Toplam IOD, tortunun toplam boya içeriği olarak tanımlanır, yani atılan toplam dışkı materyali27 anlamına gelir. Daha önce, D. melanogaster 27,28'in dışkı birikintilerini analiz etmek için bir test geliştirilmiştir. Bu tahlilde, dışkı birikintilerinin sayısını, boyutunu ve hafifliğini kontrol etmeyi ve böylece meyve sineklerinin bağırsak fizyolojisini izlemeyi sağlayan bir dışkı analiz aracı olarak nihai gübre okuyucusu (T.U.R.D.) kullanılmıştır. Ancak bu yöntem sineklerde ishal fenotipini değerlendirmek için hiçbir zaman uygulanmamıştır. İyon Taşıma Peptit (ITP) geni, susuzluk ve atılımın önemli bir endokrin düzenleyicisidir ve su homeostazını D. melanogaster'de beslenme ile birleştirir. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, gastrointestinal sistem boyunca gıda geçiş hızının ve dışkılama olaylarının sıklığının ITP aşırı ekspresyonu ile azaldığı ve ITP yıkımı ile arttığı gösterilmiştir. İkinci fenotip, bu çalışmanın yazarları tarafından ishal olarak tanımlanmıştır29.
Bu protokolde, bir ishal önleyici ajanın (yani guava yaprağı ekstresi) D . melanogaster'in gastrointestinal sistemi üzerindeki etkisini değerlendirmek için dışkı birikinti testinin değiştirilmiş bir versiyonu kullanılır. Bu yöntemin genel amacı: 1) ilaçların ve bitki ekstraktlarının antidiarreal etkisini değerlendirmek için kolay ve güvenilir bir yöntem sağlamak ve 2) biyoaktivite güdümlü bir yaklaşım uygulayarak bitki ekstraktlarında ishal önleyici etkiden sorumlu biyoaktif bileşiklerin keşfine izin vermektir.
Protocol
1. Bitki ekstraktının hazırlanması
- Yetişkin bir ağaçtan30 Psidium guajava L. yaprağı toplayın ve şu şekilde işleyin: yaprakları 6 gün boyunca 40 °C'de bir fırında kurutun, ardından 6 gün boyunca havada kurutun, ardından 40 °C'de 4 gün boyunca fırında tekrar kurutun ve son olarak kuru yaprakları bir öğütme değirmeninde veya bir kahve değirmeninde öğüterek yaprak tozu hazırlayın.
- 100 g kurutulmuş tozu 1 L% 96 etanol içinde 24 saat boyunca bir çalkalayıcı kullanarak sürekli karıştırarak yumuşatın. Bitki kalıntısını bir kez daha aynı işleme tabi tutun ve elde edilen süzüntüleri 40 °C'de düşük basınç (175 mbar) altında vakumlu bir döner buharlaştırıcı kullanarak kuruyana kadar buharlaştırın.
- İstenilen konsantrasyonu elde etmek için bitki ekstraktını etanol içinde çözün. Bir dizi konsantrasyonu test ederek optimal konsantrasyonu (burada açıklanan protokolü kullanarak) belirleyin.
- Bitki özleri için 100 μg/mL, 1 mg/mL, 10 mg/mL, 100 mg/mL konsantrasyon aralığını test edin ve sineklerin hayatta kalma oranını etkilemeyenleri kullanın. Saf bileşikler için aşağıdaki konsantrasyon aralığını test edin: 0.05, 0.5, 5 ve 50 mM12.
2. Gıda ortamının hazırlanması
- 100 mL damıtılmış su ölçün ve 4 g şeker ve 0.8 g agar ile behere dökün (Malzeme Tablosuna bakınız). 100 °C'ye ısıtın (karıştırırken) ve 10 dakika bekleyin.
- Sıcaklığı 80 °C'ye düşürün, karıştırırken 7,4 g un ve 2,8 g maya ekleyin. En az 20 dakika ısıtın, yine de karıştırın ve 80 °C civarında olması gereken sıcaklığı kontrol edin.
- Moldex-propiyonik asit çözeltisini ekleyin (1 mL moldex ve 0.3 g propiyonik asit iyice karıştırın). Sıcaklığın yaklaşık 50 °C'ye düşmesini bekleyin, bitki özü çözeltisini (1 mg/mL) ve 0,5 g bromofenol mavisi tozunu ekleyin.
NOT: Test edilecek diğer konsantrasyonlar hakkında daha fazla ayrıntı için lütfen bölüm 1.3.1'e bakın. - Yiyeceği Petri kaplarına dökün ve Petri kabı dolduğunda durun (Şekil 1A). Petri kaplarını oda sıcaklığına (yaklaşık 3 saat) soğumaya bırakın, ardından kapağı kapatın ve buzdolabında 4 °C'de saklayın.
NOT: Suyun buharlaşmasını önlemek için Petri kapları buzdolabında 2 haftadan fazla saklanmamalıdır.
Şekil 1: Dışkı depozitasyon testi için deneysel sürecin gösterilmesi. (A) Gıda ortamıyla dolu Petri kaplarını gösteren resim. Petri kabında yeterli yiyecek bulunduğundan emin olun, böylece hiçbir boşluk sinekleri hapsetmez ve hareket etmelerini engeller. Bununla birlikte, yüzeyin eşit şekilde kaplanabilmesi için Petri kabını yiyecekle aşırı yüklemeyin. (B) Protokolde açıklandığı gibi spatulanın görüntüsü. (C) Protokolde açıklandığı gibi dışkı depozit testinin görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Sineklerin hazırlanması
- CO2 tanklarını, iğneli CO2 üfleme tabancasını, sinekliği, boya fırçasını ve mikroskobu hazırlayın. Sinek istasyonu, hem sinek pedine hem de üfleme tabancasına CO2 sağlar. Sinek pedi sinekleri ayırmak için kullanılırken, CO2 üfleme tabancası şişelerde, şişelerde ve Petri kaplarında sinekleri uyuşturmak için kullanılır.
- Pupa (en az 10) içeren şişeleri seçerek sineklerin yaşını standartlaştırın ve aşağıdaki yöntemi kullanarak yetişkin sinekleri tüpten atın. Şişeleri birer birer ters çevirin ve iğneyi pamuk tapası ile şişenin yan duvarı arasına sokun. Yetişkin sinekleri, tüm sinekler pamuk tıkacı üzerinde uyuyana kadar CO2 üfleme tabancasıyla uyuşturun (onları uyuşturmak için birkaç saniye gerekir ve anestezik etki, üfleme tabancasını bıraktıktan sonra birkaç saniye sürecektir). Şişeyi% 70 etanol içeren bir cam şişenin üzerinde açın ve sinekleri içine bırakın. Şişeyi pamuk tapa ile kapatın ve 25 °C'de% 60 nem ile bir inkübatörde saklayın. İnkübatörün ışık döngüsünü 12 saat aydınlığa/12 saat karanlığa ayarlayın.
- Kuluçkadan sonra (en fazla 8 saat), mikroskop altında bakire dişiler ve erkekler olarak ayırın ve sırt üstü çevirerek ve cinsel organlarına bakarak sinek pedi.
- Kadın cinsel organı, kırmızımsı renkli erkek cinsel organlarına kıyasla soluktur. Erkekler ayrıca ön bacaklarında seks tarağı adı verilen koyu renkli kılların varlığıyla da tanımlanabilir. Sinekleri iki taze tüpe bölün (biri erkekler ve diğeri dişiler için) ve 25 °C'de 6-8 gün inkübe edin.
NOT: 25 °C'de dişiler yumurtadan çıktıktan sonra yaklaşık 8 saat bakire kalır.
- Kadın cinsel organı, kırmızımsı renkli erkek cinsel organlarına kıyasla soluktur. Erkekler ayrıca ön bacaklarında seks tarağı adı verilen koyu renkli kılların varlığıyla da tanımlanabilir. Sinekleri iki taze tüpe bölün (biri erkekler ve diğeri dişiler için) ve 25 °C'de 6-8 gün inkübe edin.
4. Dışkı birikinti testi
- Petri kapları arasında karışıklığı önlemek için Petri kaplarını ilgili suş, cinsiyet ve ilaçla etiketleyin. Petri kaplarını üst üste koyun.
- Boyalı yiyecekleri içeren Petri kaplarını alın ve fazla sıvıyı emmek için kurutma kağıdına ters çevirin. Bir spatula kullanarak (Şekil 1B), yiyeceği 12 eşit parçaya bölün ve ardından spatulayı kullanarak bir dilimi boş bir Petri kabına koyun.
NOT: Çoğaltma sayısına bağlı olarak, kesilecek dilim sayısı Petri kabı başına 20'ye kadar artırılabilir. Her dilim aynı boyutta olmalıdır. - Tüm sinekler pamuk tıkacı üzerinde uyuyana kadar sinekleri CO2 ile uyuşturun. Her Petri kabına altı sağlıklı sinek aktarın (Şekil 1C) ve kapağı hemen kapatın, ardından inkübatöre yerleştirin (25°C, %60 nem, 12 saat aydınlık/12 saat karanlık).
- Deney sırasında sineklerin Petri kabından kaçmamasını sağlamak için, Petri kabının üst ve alt kapaklarını bir bantla tutturun. Her test grubu için altı kopya Petri kabı hazırlayın (en azından).
- Sineklerin 24 saat boyunca geri dönmesine izin verdikten sonra, onları uyuşturmak için CO2 kullanın, sinekleri% 70 etanol ile dolu bir kaba aktarın ve kalan yiyecekleri atın.
- Petri kaplarını saklayın ve 5. adıma geçin.
5. Petri kaplarının miktarının belirlenmesi
- Bilgisayarda bir klasör ayarlayın ve deney suşunun adını, sineklerin cinsiyetini ve kullanılan ilaçların türünü ekleyerek yeniden adlandırın. Bu klasör içinde Original, Cut ve Analysis adlı alt klasörler oluşturun.
- İnç başına 6.400 piksel (ppi) optik çözünürlüğe sahip yüksek çözünürlüklü bir tarayıcı kullanarak Petri kaplarını tarayın. Her Petri kabının üst ve alt kapaklarını, tarayıcı alanının ortasına ayrı ayrı yerleştirerek tarayın.
- Bilgisayarda yüklü olan uygulamayı açın. Bilgisayar ekranında tüm genel ayarların bulunduğu bir karşılama penceresi açılacaktır (Şekil 2A).
NOT: Gelişmiş ayarları değiştirmeyin. Bu adım, yalnızca Malzeme Tablosunda önerilenle aynı tarayıcıya sahip kullanıcılar için geçerlidir. Başka bir yazılım kullanıyorsanız lütfen yönergelere bakın.- Uygulamadaki Petri kabını sıra numarası, üst veya alt kapak, cinsiyet ve kullanılan yiyecek türünü ekleyerek adlandırın. Adım 5.1'de orijinal alt klasör kümesini seçin.
- Petri kabını önizleyin. Pencerenin altındaki Önizleme'ye tıklayın, tarayıcının ön tarama yapması için birkaç saniye bekleyin, ardından bilgisayar ekranında bir pencere belirir. Petri kabını çevrelemek için ekranda görüntülenen kareyi hareket ettirin.
- Bilgisayar ekranındaki pencerenin sağ alt kısmındaki Tara'ya tıklayın, tarama otomatik olarak seçilen klasöre bir görüntü olarak kaydedilir.
- Görüntüyü bir uygulama (örneğin, açık kaynaklı Fiji uygulaması) kullanarak kırpın, böylece hiçbir artefakt ve yiyecek kalıntısı tortu olarak kabul edilmez.
NOT: Aşağıdaki adımlar yalnızca Fiji uygulamasına sahip kullanıcılar için geçerlidir. Başka bir yazılım kullanıyorsanız lütfen yönergelere bakın.- Fiji uygulamasını açın, ekranda bir araç çubuğu görünene kadar birkaç saniye bekleyin.
- Kırpılacak görüntüyü araç çubuğuna sürükleyin. Araç çubuğundaki 3. simge Çokgen seçimlerini seçin, pasta grafiğin etrafında bir açı işaretlemek için ekrana tıklayarak fotoğrafın istenmeyen kısmını (renkli pasta grafiği) kırpın (Şekil 2B-1,2).
NOT: Bir görüntüdeki kırpma bölgesini tanımlarken, seçilen karelerin uçtan uca sorunsuz bir şekilde bağlanması zorunludur. - Çubuğun sol üst köşesindeki Düzenle'ye ve ardından Dışarıda Doldur/Temizle'ye tıklayın (Şekil 2B-3).
- Fotoğrafı kaydetmek için çubuğun sol üst köşesindeki Dosya'ya , ardından Farklı Kaydet'e ve son olarak Tiff'e tıklayın. Adım 5.1'de ayarlanan Cut alt klasörünü seçin.
NOT: Kırpılan görüntüyü kaydederken, dosya adında özel karakterler (ör. !, &, $, #, _,-,...) veya çok fazla karakter bulunmadığından emin olun.
Şekil 2: Dışkı depozit testinden elde edilen verileri analiz etme sürecindeki temel adımlar. (A) Tarama uygulamasının ayar bilgilerini gösteren ekran görüntüsü. (B) Fiji uygulaması kullanılarak kırpılan görüntüler. Hiçbir eser ve yiyecek kalıntısının tortu olarak kabul edilmediğinden emin olun. (C) Excel_merge-v4 uygulamasını açarken nasıl göründüğünü gösteren ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
6. Dışkı birikintilerinin tanımlanması, gübre açık kaynaklı yazılımın nihai okuyucusunu kullanarak
NOT: Gübre yazılımının nihai okuyucusunun tanıtımı ve kullanımı Ek Dosya 1'de bulunabilir.
- İlk olarak, T.U.R.D. yazılımını açın (Ek Şekil 1). Yeni bir deneme oluşturun ve belgeye bir ad verin, ardından bunu adım 5.1'de ayarlanan Analiz alt klasörüne kaydedin.
- Plakalar'a ve ardından Plaka ekle'ye tıklayın. İşlenecek Petri kabını seçin. Seçilen plakaların adlarını ve yeni parametreleri içeren yeni bir pencere açılır. Blok boyutunu, ofseti, minimum boyutu ve maksimum boyutu ayarlayın (Ek Şekil 2).
- Tespit edilen dışkı birikintilerinin doğru olanlar olduğunu doğrulamak için Plakalar'a tıklayın, ardından Seçilen Plakaları İncele'ye, ardından Grafikler'e ve Açıklamalı görüntüleri görüntüleyin (Ek Şekil 3). Yakınlaştırın ve sayılara bakın. Analize dahil edilmemesi gereken yalnızca birkaç mevduat varsa, hariç tutulacak mevduatların seçimini kaldırın (Ek Şekil 4).
- İşlenecek her yeni görüntü için 6.3 adımından itibaren yeniden başlatın.
- T.U.R.D. yazılımı ile plakaları analiz ettikten sonra Hayır'a tıklayarak sinek sayısını değiştirin . Sinekler (Ek Şekil 5).
- Plakalar > Grupları düzenle > Ekle'ye tıklayarak grup adını değiştirin ve ardından Grup sütununda grup adını seçin.
- Açıklayıcı İstatistikleri Analiz Et'>e tıklayarak farklı çoğaltma verilerini ayrı ayrı dışa aktarın > Grubu Seçin (Ek Şekil 6). Tüm e-tablo dosyalarını (.csv) aynı klasörde tutun.
- Tüm dosyaları (adım 6.7'de elde edilen) benzersiz bir elektronik tabloda toplamak için, Excel_merge-v4 (Ek Kodlama Dosyası 1) uygulamasını açın, aşağıdaki cümle görünene kadar bekleyin Klasörün yolunu seçin (.csv dosyalarla):, ve ardından yukarıdaki klasör adresini yapıştırın. Örneğin, yol C:\Experiment\Fecal deposit test\ olabilir ve ardından klavyede iki kez Enter tuşuna basılabilir (Şekil 2C). Bundan sonra, aynı klasörde yeni bir elektronik tablo dosyası oluşturulur. Yeni e-tablo dosyası, dışa aktarılan tüm dosyaları farklı sayfalarda içerir.
- Önceki elektronik tablo dosyasında, tüm çoğaltmaların her parametresinin ortalamasını toplamak için başka bir sayfa ekleyin (verileri işlemek için DÜŞEYARA işlevini kullanın). Ek Tablo 1'de bir örnek verilmiştir.
- P değerini analiz edin.
Representative Results
Burada sunulan çalışma, D. melanogaster'de ishal ölçümünün dışkı birikintisi testi kullanılarak elde edilebileceğini göstermektedir. Fenotipler (ishal olsun ya da olmasın) arasındaki önemli farklılıklar, dışkı birikintilerinin sayısı, toplam birikinti alanı, ortalama tortu alanı, ortalama hafiflik ve toplam entegre optik yoğunluk (IOD) dahil olmak üzere çeşitli parametreler analiz edilerek belirlenebilir.
Sineklerde ITP geninin yıkılması, artan dışkılama sıklığı ile karakterize bir ishal fenotipini indükleyebilir ve bu da onları ishali incelemek için uygun bir model haline getirir29. Bu deney bağlamında, ITPi suşu (w1118; kızsız-GeneSwitch, UAS-ITPi /(CyO)) standart bir ortamda kullanıldı ve yetiştirildi. Psidium guajava yaprakları ekstresi, bu bitkinin tropikal bölgelerde ishali yönetmek için yaygın kullanımı göz önüne alındığında, ishal önleyici müdahale olarak seçildi. Bir antidiarreal ajan olan Crofelemer, ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından antiretroviral tedavi gören HIV/AIDS'li yetişkin hastalarda enfeksiyöz olmayan ishal için semptomatik rahatlama sağlamak üzere onaylanmıştır31. Crofelemer, Croton lechleri Müll.Arg'ın lateksinden elde edilen bir ekstrakttır. Kök kabuğu32. Loperamide, ishali tedavi etmek için dünya çapında kullanılan sentetik bir ilaçtır33. Hem Crofelemer hem de Loperamide potansiyel pozitif kontroller olarak kullanıldı.
Hipotez, sinekleri P. guajava özü, Crofelemer ve Loperamide ile beslemenin, normal gıda ile beslenenlere kıyasla ishal fenotipini azaltacağı yönündeydi. Bu hipotezi incelemek için, normal gıda ile beslenen sinekler ile P. guajava özü (1 g/100 mL), Crofelemer (1 g/100 mL) ve Loperamid (10 mM) ile beslenen sinekler arasındaki çeşitli parametreler karşılaştırılarak D. melanogaster'de dışkı birikintilerinin ölçümü yapılmıştır. Deney düzeneği için 6-7 günlük bakire dişi veya erkekler kullanıldı. Her Petri kabı altı sinek içeriyordu ve altı kopya gerçekleştirildi. Sinekler 24 saat boyunca yetiştirildi ve daha sonra her grup analiz edildi. Deney grubu arasındaki anlamlı farklılığı karşılaştırmak için öğrenci t-testi kullanıldı. Sonuçlar, dışkı birikintilerinin sayısının (Şekil 3A), toplam birikinti alanının (Şekil 3B) ve toplam Gİİ'nin (Şekil 3C) normal gıda grubunda P. guajava özü (1 g / 100 mL) grubuna kıyasla hem bakire kadınlarda hem de erkeklerde önemli ölçüde daha yüksek değerler sergilediğini göstermektedir. Ne yazık ki, Loperamid her iki cinsiyette de herhangi bir etki göstermedi (ancak D. melanogaster'de antispazmodik bir ajan olarak hareket ettiği zaten gösterildi)34 Crofelemer'in sadece kadınlar üzerinde bir etkisi vardı.
Şekil 3: ITPi gerinim analizi. ITPi suşu dört koşul altında analiz edildi: normal gıda ile beslenme, 1 g / 100 mL P. guajava özü, 1 g / 100 mL Crofelemer ve 10 mM Loperamid ile takviye edilmiş gıda. Veriler, hem kadınlarda hem de erkeklerde her bir koşulun ortalama ± SD'si olarak sunulur (bir Petri kabının iki tarafının altı kopyası için). İstatistiksel analiz, iki grubu karşılaştıran bir öğrencinin t-testi kullanılarak yapıldı. p değerleri aşağıdaki gibi gösterilir: *: p < 0.05; **: p < 0.01; : p < 0.001, ****: p < 0.0001. (A) 1 g/100 mL Crofelemer, 10 mM Loperamide, 1 g/100 mL P. guajava özü ile takviye edilmiş gıdalarla beslenen sineklerde ve normal gıda ile beslenen sineklerde ITPi suşunun dışkı birikintilerinin sayısı karşılaştırıldı. Ek olarak, bakire dişiler ve erkekler arasındaki dışkı birikintilerinin sayısındaki fark da analiz edildi. Her iki grupta da normal gıda ile beslenen sineklerde dışkı birikimi sayısı 1 g/100 mL P. guajava ekstresi ile beslenenlere göre anlamlı olarak daha yüksekti. (B) Normal gıda ile beslenen sineklerde ve 1 g/100 mL P. guajava özü, 1 g/100 mL Crofelemer ve 10 mM Loperamid ile takviye edilmiş gıda ile beslenen sineklerde ITPi suşunun toplam dışkı birikintileri alanı karşılaştırıldı. Erkeklerde ve kadınlarda, normal gıda ile beslenen sineklerde toplam dışkı birikintisi alanı, 1 g / 100 mL P. guajava özü ile beslenenlere göre anlamlı olarak daha yüksekti. (C) Normal gıda ile beslenen sinekler ile 1 g / 100 mL P. guajava özü, 1 g / 100 mL Crofelemer ve 10 mM Loperamid ile takviye edilmiş gıda ile beslenen sinekler arasında ITPi suşunun toplam IOD'sindeki fark analiz edildi. Erkeklerde ve kadınlarda, normal gıda ile beslenen sineklerde toplam GİB, 1 g / 100 mL P. guajava özü ile beslenenlere göre anlamlı olarak daha yüksekti. Kısaltmalar: F = Kadın; M = Erkek; Crofe = Crofelemer; Lop = Loperamide; Ne de yemek = Normal yiyecek; P. gua ext = Psidium guajava özü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
P. guajava özü grubunda gözlenen azalmış atılımın, özütün inhibitör etkisinden kaynaklandığını ve gıda tüketiminin azalmasından kaynaklanmadığını göstermek için, katı gıda tüketiminin doğrudan alım tahmini ve takibi (DİYETLER) yöntemini gerçekleştirdik35. Sonuçlar, sineklerin normalden daha az yiyecek tüketmesine neden olan erkeklerde Loperamid dışında, ilaç verilen gruplar ile ilaç kullanmayanlar arasında gıda tüketiminde önemli bir fark olmadığını göstermiştir (Şekil 4).
Şekil 4: Beslenme deneyi. Beslenme testi, sineklerde katı gıda tüketimini ölçtü. Sinekler dört farklı besiyeri ile beslendi: 1 g/100 mL P. guajava ekstresi, 1 g/100 mL Crofelemer, 10 mM Loperamid ve normal mama. Her grup, beş kopya ile 20 sinekten oluşuyordu. Veriler hem kadınlarda hem de erkeklerde her bir durumun ortalama ± SD olarak sunulmuştur. İstatistiksel analiz, iki grubu karşılaştıran bir öğrencinin t-testi kullanılarak yapıldı. p değerleri aşağıdaki gibi gösterilir: *: p < 0.05; **: p < 0.01; : p < 0.001, ****: p < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Dışkı birikintileri ve beslenme tahlili sonuçları, P. guajava ekstraktının meyve sineklerinde ishali tedavi etmek için güvenilir bir tıbbi bitki olduğunu göstermiştir.
Ek Şekil 1: T.U.R.D. açılan pencere. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Ayarlanacak ayarların bulunduğu T.UR.D. penceresi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: Açıklamalı bir görüntüye sahip T.U.R.D. penceresi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 4: Halihazırda işlenmiş bir görüntüden tespit edilen her noktayı gösteren T.U.R.D. penceresi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 5: İşlenen her görüntüyü gösteren T.U.R.D. penceresi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 6: T.U.R.D. her grup için verileri dışa aktarma sürecini gösteren pencere. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: T.U.R.D. yazılımını kullanmak için hızlı kılavuz. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Analize hazır son elektronik tablo örneği. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Kodlama Dosyası 1: Elektronik tabloları birleştirme uygulaması. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
D. melanogaster , D. melanogaster ve insanlar arasındaki genlerdeki benzerlik nedeniyle çeşitli biyolojik süreçler için bir model olarak yaygın olarak kabul edilmiştir36. Bağırsak sistemini incelemek için bir model olarak D. melanogaster'in kullanımı yaygındır ve T.U.R.D. dışkı birikintilerinin sayısını, alanını ve miktarını tahmin etmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, meyve sineklerinde ishali değerlendirmek için fenotipik tespit yöntemi kullanılmamıştır. Bu nedenle, bu protokol, dışkı birikintilerini tespit ederek ishal varlığını kabaca değerlendirmek için yeni bir yöntem sunar.
Dışkı birikintileri, bağırsak sistemi fonksiyonunun ve sağlığının önemli bir göstergesidir37. Bu bağlamda, dışkı birikintilerinin çeşitli parametrelerini araştırmak için D. melanogaster'in ilaç içeren besiyerinde yetiştirilmesi için bir yöntem önerilmiştir. Birikinti sayısını izleyerek, dışkılama sıklığını belirlemek ve bir ilacın bağırsak geçişi üzerinde herhangi bir etkisi olup olmadığını değerlendirmek mümkündür. Bağırsak sisteminin genel sağlığını belirlemede önemli bir faktör olan dışkı maddesinin konsantrasyonunu ve seyreltilmesini değerlendirmek için birikintilerin toplam alanı ölçülebilir. Ek olarak, toplam entegre optik yoğunluk (IOD), tortularda bulunan toplam dışkı materyali miktarını tespit etmek için kullanılabilir. Bu protokol, bağırsak sistemini etkileyen bitki özlerinin yanı sıra ilaçların taranması ve değerlendirilmesi için etkili bir yöntem sağlar. D. melanogaster bir model organizma olarak kullanıldığında, ilaç keşif sürecini hızlandırmaya yardımcı olabilecek potansiyel ilaçların etkinliğini değerlendirmek mümkündür. Bu yöntemi bitki özleri üzerinde uygulayarak, araştırmacılar ishal önleyici ajanlar olarak kullanımlarını doğrulamaya yardımcı olabilirler.
D. melanogaster'deki dışkı birikintilerini incelemek için bu protokolü kullanırken göz önünde bulundurulması gereken birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, ortamda ilacın istenen konsantrasyonunu elde etmek için gereken kütleyi hesaplamak önemlidir. Ayrıca, yüksek sıcaklıklar ilacı bozabileceğinden ve gücünü etkileyebileceğinden, ilacı ortama eklerken iyi bir hazırlık koşulu sağlamak önemlidir. İkincisi, bu protokolde dişi sineklerin seçimi önemlidir. Bakire ve çiftleşmiş dişiler arasındaki dışkı çıkışındaki farklılıkları önlemek için bakire dişi sineklerin kullanılması önemlidir. Örneğin, bakire dişiler tarafından üretilen lekeler çiftleşmiş dişilerden daha daireseldir ve çiftleşmiş dişiler, bakire dişilerden daha fazla dışkı maddesi salgılama eğilimindedir27,28. Bu nedenle, toplanan tüm dişilerin bakire olduğundan emin olmak için 8 saatlik eklosiyondan önce sineklerin toplanması önerilir. Ek olarak, test edilen sinekler, sağlıkları gıda alımını ve dışkı çıkışını etkileyebileceğinden güçlü ve sağlıklı olmalıdır. Örneğin, anormal bir kanat şekline sahip sinekler yiyeceği almakta zorluk çekebilirler. Son olarak, T.U.R.D.'yi başarılı bir şekilde kullanmak için blok boyutu (piksel) ve ofset ayarları çok önemlidir. Görüntülerin ışık kontrastındaki farklılık nedeniyle, dışkı birikintilerinin mümkün olan en iyi şekilde tanımlanmasını sağlamak için farklı ayarların denenmesi gerekebilir.
Sunulan yöntem etkili olsa da, birkaç sınırlama vardır. Birincisi, ortamdaki ilaç konsantrasyonunun doğruluğudur. Hazırlama sırasında ortam ısıtıldığında, bir miktar su buharlaşabilir ve bu da ilacın konsantrasyonunu etkileyebilir. Diğer bir sınırlama, Petri kaplarının taranmasıdır. Petri kaplarının bazı kısımları (yani kenarları) taranmaz ve bu, toplam dışkı birikintilerinin yanlış hesaplanmasına neden olabilir. Ek olarak, sinekler Petri kaplarının üst ve alt kapaklarında aynı miktarda dışkı birikintisi üretmez. Alt kapakta daha fazla tortu üretme eğiliminde olduklarından, üst ve alt kapak arasındaki analizin standart sapması yüksek olabilir ve bu da sonuçların doğruluğunu etkileyebilir.
Bu protokolü kullanarak, araştırmacılar D. melanogaster'deki ishali inceleyebilirler. İlaç içeren ortamı değiştirerek, bu yöntem, ilaç keşfine yeni bir yaklaşım sağlayan ishal önleyici bitkileri taramak için kullanılabilir. Geleneksel tıp ve doğal ürünler, gastrointestinal bozukluklar da dahil olmak üzere farklı hastalıkları tedavi etmek için yüzyıllardır kullanılmaktadır. Bitki özlerinin dışkı birikintileri üzerindeki etkinliğini değerlendirmek için bu protokolü kullanarak, bağırsak sistemi bozuklukları için potansiyel yeni tedaviler tanımlanabilir ve ishal önleyici ajanlar olarak kullanımları için bilimsel bir gerekçe sağlanabilir. Bu yaklaşım, ilaç keşfi ve etnofarmakoloji alanına değerli bir katkı sağlayabilir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bize Drosophila suşlarını sağladığı için Dr. Martina Gáliková'ya teşekkür ederiz. Çalışmamız hakkında geri bildirimde bulundukları ve modelimizi geliştirmemize yardımcı oldukları için Michelle Crozatier-Borde ve Marc Haenlin ekibine minnettarız. Bize Crofelemer ilacını sağladığı için Napo İlaç Şirketi'ne teşekkür ederiz. Yazarlar ayrıca konuk editör Dr. Hugues Petitjean'a bize bu protokolü yayınlama fırsatı verdiği için teşekkür eder. Bu çalışma, ANR-22-CE03-0001-01 projesi kapsamında Agence Nationale de la Recherche (ANR) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical & Food medium | |||
| Agar | Sigma Aldrich | A7002 | 5 Kg bucket |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
| Corn flour | Nature et Cie | *910007 | 25 Kg bag |
| Crofelemer | Napo pharmaceuticals | - | - |
| Ethanol 96% | - | - | - |
| Loperamide | Sigma Aldrich | L4762 | 5 grams |
| Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 Kg bag |
| Propionic acid | Dutscher | 409553-CER | 1 Liter bottle |
| Sugar | Pomona EpiSaveurs | 52705 | 1 Kg bag |
| Yeast | Dutscher | 789195 | 10 Kg bag |
| Materials | |||
| Beaker | DWK LIFE SCIENCE | - | 250 mL |
| Centrifugation tube | Eppendorf | 30119401 | Eppendorf tubes 5.0 mL |
| CO2 tank | - | - | - |
| Erlen Meyer flask | - | - | 500 mL (for extraction) |
| Filter paper grade | Whatman | - | 3 mm chr. |
| Flowbuddy socle | Genesis | - | - |
| Flugs Narrow Plastic vials | Genesis | 49-102 | - |
| Flystuff Blow gun | Genesis | - | - |
| Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | - | - |
| Flystuff Foot pedal | Genesis | - | - |
| Forceps | Dumostar | 11295-51 | - |
| Graduated cylinder | - | - | 100 mL |
| Inox spatula | - | - | - |
| Micropipette | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Reference 2 |
| Micropipette tip | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. Standard |
| Narrow Drosophila vials | Genesis | 32-120 | - |
| Paintbrush | - | - | - |
| Petri dish | Greiner | 628162 | Size: 60 x 15mm |
| Round-bottom flask | - | - | 500 mL (for evaporation) |
| Thermometer | Avantor | 620-0916 | |
| Whisk | - | - | - |
| Equipments | |||
| Chiller | HUBER | Minichiller | - |
| Heating bath | BÜCHI | B-490 | - |
| Heating plate | BIOBLOCK SCIENTIFIC | - | Magnetic stirrer hot plate |
| Incubator | Memmert | - | HPP110eco |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R-200 | - |
| Scanner | Epson | V850 pro | - |
| Shaker | Edmund Bühle | KS 10 | - |
| Stereomicroscope binocular | Zeiss | Stemi 305 | - |
| Vacuum pump | VACUUBRAND | PC500 series | - |
| Vortex mixer | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE vortex mixers |
| Weighing scale | OHAUS Scout | SKX622 | - |
References
- Cheng, L. K., et al.
- Greenwood-Van Meerveld, B., Johnson, A. C., Grundy, D.
- Doyle, L. A., et al. A clinicopathologic study of 24 cases of systemic mastocytosis involving the gastrointestinal tract and assessment of mucosal mast cell density in irritable bowel syndrome and asymptomatic patients. Am J Surg Pathol. 38 (6), 832-843 (2014).
- Levine, G. A., Walson, J. L., Atlas, H. E., Lamberti, L. M., Pavlinac, P. B. Defining pediatric diarrhea in low-resource settings. J Pediatric Infect Dis Soc. 6 (3), 289-293 (2017).
- Abraham, B., Sellin, J. H.
- Badry, A. H. H., Jameel, A. Y., Mero, W. M. S. Pathogenic microorganisms associated with arrhea in infants and children in Duhok Province, Kurdistan Region / Iraq. Sci J Uni Zakho. 2 (2), 266-275 (2014).
- Manetu, W. M., M'masi, S., Recha, C. W. Diarrhea disease among children under 5 years of age: A global systematic review. Open J Epidemiol. 11 (3), 207-221 (2021).
- Fu, J., et al. Aquatic animals promote antibiotic resistance gene dissemination in water via conjugation: Role of different regions within the zebra fish intestinal tract, and impact on fish intestinal microbiota. Mol Ecol. 26 (19), 5318-5333 (2017).
- Zhang, Q., Widmer, G., Tzipori, S. A pig model of the human gastrointestinal tract. Gut Microbes. 4 (3), 193-200 (2013).
- Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
- Jasper, H. Exploring the physiology and pathology of aging in the intestine of Drosophila melanogaster. Invertebr Reprod Dev. 59, 51-58 (2015).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Jennings, B. H. Drosophila- a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Kumar, V. S., Navaratnam, V. Neem (Azadirachta indica): Prehistory to contemporary medicinal uses to humankind. Asian Pac J Trop Biomed. 3 (7), 505-514 (2013).
- Shrestha, P., Adhikari, S., Lamichhane, B., Shrestha, B. G. Phytochemical screening of the medicinal plants of Nepal. J Environ Sci Tech Food Tech. 1 (6), 11-17 (2015).
- Perveen, S., Al-Taweel, A.
- Noumi, E., Yomi, A. Medicinal plants used for intestinal diseases in Mbalmayo Region, Central Province, Cameroon. Fitoterapia. 72 (3), 246-254 (2001).
- Njoku, V. O., Obi, C., Onyema, O. M. Phytochemical constituents of some selected medicinal plants. African J Biotechnol. 10 (66), (2011).
- Rokaya, M. B., et al. Traditional uses of medicinal plants in gastrointestinal disorders in. Nepal. J Ethnopharmacol. 158, 221-229 (2014).
- Birdi, T., Krishnan, G. G., Kataria, S., Gholkar, M., Daswani, P. A randomized open label efficacy clinical trial of oral guava leaf decoction in patients with acute infectious diarrhoea). J Ayurveda Integr Med. 11 (2), 163-172 (2020).
- van Vuuren, S. F., Nkwanyana, M. N., de Wet, H. Antimicrobial evaluation of plants used for the treatment of diarrhoea in a rural community in northern Maputaland, KwaZulu-Natal, South Africa. BMC Complement Altern Med. 15, 53 (2015).
- Firenzuoli, F., Gori, L. Herbal medicine today: Clinical and research issues. Evid Based Complement Alternat Med. 4, 37-40 (2007).
- Rawat, P., Singh, P. K., Kumar, V. Evidence based traditional anti-diarrheal medicinal plants and their phytocompounds. Biomed Pharmacother. 96, 1453-1464 (2017).
- Palombo, E. A. Phytochemicals from traditional medicinal plants used in the treatment of diarrhoea: modes of action and effects on intestinal function. Phytother Res. 20 (9), 717-724 (2006).
- Koyama, T., et al. A nutrient-responsive hormonal circuit mediates an inter-tissue program regulating metabolic homeostasis in adult Drosophila. Nat Commun. 12 (1), 5178 (2021).
- Wayland, M. T., et al. Spotting the differences: Probing host/microbiota interactions with a dedicated software tool for the analysis of faecal outputs in Drosophila. J Insect Physiol. 69, 126-135 (2014).
- Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis. Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).
- Gáliková, M., Dircksen, H., Nässel, D. R. The thirsty fly: Ion transport peptide (ITP) is a novel endocrine regulator of water homeostasis in Drosophila. PLoS Genet. 14 (8), 1007618 (2018).
- Chassagne, F., Quave, C. L. Collection, extraction, and in vitro antibacterial evaluation of plants used in traditional medicine. Methods Mol Biol. 2296, 19-41 (2021).
- Patel, T. S., Crutchley, R. D., Tucker, A. M., Cottreau, J., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of chronic diarrhea in patients living with HIV/AIDS. HIVAIDS. 5, 153-162 (2013).
- Cottreau, J., Tucker, A., Crutchley, R., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of secretory diarrhea. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 17-23 (2012).
- Wu, P. E., Juurlink, D. N. Loperamide cardiac toxicity: Pathophysiology, presentation, and management. Can J Cardiol. 38 (9), 1378-1383 (2022).
- Benguettat, O., et al. The DH31/CGRP enteroendocrine peptide triggers intestinal contractions favoring the elimination of opportunistic bacteria. PLoS Pathog. 14 (9), 1007279 (2018).
- Thakare, M. R., et al. Direct intake estimation and longitudinal tracking of solid-food consumption (DIETS) in Drosophila. bioRxiv. , 543033 (2023).
- Miller, J., et al. Drosophila melanogaster as an emerging translational model of human nephrolithiasis. J Urol. 190 (5), 1648-1656 (2013).
- Zierer, J., et al. The fecal metabolome as a functional readout of the gut microbiome. Nat Genet. 50 (6), 790-795 (2018).
