Summary
Dit protocol beschrijft een workflow van ex vivo of in vitro celculturen tot transcriptomische gegevensvoorverwerking voor kosteneffectieve transcriptoomgebaseerde geneesmiddelenscreening.
Abstract
Transcriptomics maakt het mogelijk om uitgebreide inzichten te verkrijgen in cellulaire programma's en hun reacties op verstoringen. Ondanks een aanzienlijke daling van de kosten van bibliotheekproductie en -sequencing in het afgelopen decennium, blijft het toepassen van deze technologieën op de schaal die nodig is voor het screenen van geneesmiddelen onbetaalbaar, waardoor het enorme potentieel van deze methoden wordt belemmerd. Onze studie presenteert een kosteneffectief systeem voor transcriptoomgebaseerde screening van geneesmiddelen, waarbij geminiaturiseerde verstoringsculturen worden gecombineerd met mini-bulk transcriptomics. Het geoptimaliseerde mini-bulkprotocol biedt informatieve biologische signalen op kosteneffectieve sequencingdiepte, waardoor uitgebreide screening van bekende geneesmiddelen en nieuwe moleculen mogelijk is. Afhankelijk van de gekozen behandeling en incubatietijd zal dit protocol binnen ongeveer 2 dagen resulteren in sequencing libraries. Door verschillende stoppunten binnen dit protocol kan de bibliotheekvoorbereiding, evenals de sequencing, tijdonafhankelijk worden uitgevoerd. Het gelijktijdig verwerken van een groot aantal monsters is mogelijk; De meting van maximaal 384 monsters werd getest zonder verlies van gegevenskwaliteit. Er zijn ook geen bekende beperkingen aan het aantal aandoeningen en/of geneesmiddelen, ondanks het feit dat rekening wordt gehouden met de variabiliteit in optimale incubatietijden van geneesmiddelen.
Introduction
De ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen is een complex en tijdrovend proces waarbij potentiële geneesmiddelen en hun doelwitten worden geïdentificeerd, kandidaat-geneesmiddelen worden geoptimaliseerd en gesynthetiseerd, en hun werkzaamheid en veiligheid worden getest in preklinische en klinische onderzoeken. Traditionele methoden voor het screenen van geneesmiddelen, d.w.z. de systematische beoordeling van bibliotheken van kandidaat-verbindingen voor therapeutische doeleinden, omvatten het gebruik van diermodellen of celgebaseerde assays om de effecten op specifieke doelen of routes te testen. Hoewel deze methoden succesvol zijn geweest in het identificeren van kandidaat-geneesmiddelen, gaven ze vaak onvoldoende inzicht in de complexe moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de werkzaamheid van geneesmiddelen en ook in de toxiciteit en mechanismen van mogelijke bijwerkingen.
Het beoordelen van genoombrede transcriptietoestanden biedt een krachtige benadering om de huidige beperkingen bij het screenen van geneesmiddelen te overwinnen, omdat het uitgebreide beoordelingen van genexpressie mogelijk maakt als reactie op medicamenteuze behandelingen. Door RNA-transcripten op een genoombrede manier te meten die op een bepaald moment tot expressie worden gebracht, wil transcriptomics een holistisch beeld geven van de transcriptionele veranderingen die optreden als reactie op geneesmiddelen, waaronder veranderingen in genexpressiepatronen, alternatieve splicing en niet-coderende RNA-expressie3. Deze informatie kan worden gebruikt om medicijndoelen te bepalen, de werkzaamheid en toxiciteit van geneesmiddelen te voorspellen en de dosering en behandelingsregimes van geneesmiddelen te optimaliseren.
Een van de belangrijkste voordelen van het combineren van transcriptomics met onbevooroordeelde screening van geneesmiddelen is het potentieel om nieuwe medicijndoelen te identificeren die nog niet eerder zijn overwogen. Conventionele benaderingen voor het screenen van geneesmiddelen zijn vaak gericht op gevestigde doelmoleculen of -routes, waardoor de identificatie van nieuwe doelwitten wordt belemmerd en mogelijk wordt geleid tot geneesmiddelen met onvoorziene bijwerkingen en beperkte effectiviteit. Transcriptomics kan deze beperkingen overwinnen door inzicht te geven in de moleculaire veranderingen die optreden als reactie op medicamenteuze behandeling, waardoor potentiële doelen of routes aan het licht komen die mogelijk niet eerder zijn overwogen2.
Naast de identificatie van nieuwe doelwitten voor geneesmiddelen, kan transcriptomics ook worden gebruikt om de werkzaamheid en toxiciteit van geneesmiddelen te voorspellen. Door de genexpressiepatronen te analyseren die verband houden met geneesmiddelresponsen, kunnen biomarkers worden ontwikkeld die kunnen worden gebruikt om de reactie van een patiënt op een bepaald medicijn of behandelingsregime te voorspellen. Dit kan ook helpen om de dosering van geneesmiddelen te optimaliseren en het risico op nadelige bijwerkingen te verminderen4.
Ondanks de potentiële voordelen blijven de kosten van transcriptomics een belangrijke belemmering voor de wijdverbreide toepassing ervan bij het screenen van geneesmiddelen. Transcriptomische analyse vereist gespecialiseerde apparatuur, technische expertise en data-analyse, wat het voor kleinere onderzoeksteams of organisaties met beperkte financiering een uitdaging kan maken om transcriptomics te gebruiken bij het screenen van geneesmiddelen. De kosten van transcriptomics zijn echter gestaag gedaald, waardoor het toegankelijker is geworden voor de onderzoeksgemeenschappen. Bovendien hebben technologische vooruitgang en methoden voor gegevensanalyse transcriptomics efficiënter en kosteneffectiever gemaakt, waardoor de toegankelijkheid verder is toegenomen2.
In dit protocol beschrijven we een hoogdimensionaal en exploratief systeem voor transcriptoom-gebaseerde drug screening, waarbij geminiaturiseerde perturbatieculturen worden gecombineerd met mini-bulk transcriptomics analyse 5,6. Met dit protocol is het mogelijk om de kosten per monster te verlagen tot 1/6evan de huidige kosten van commerciële oplossingen voor mRNA-sequencing van volledige lengte. Het protocol vereist alleen standaard laboratoriumapparatuur, met als enige uitzondering het gebruik van short-read sequencing-technologieën, die kunnen worden uitbesteed als sequencing-instrumenten niet in huis beschikbaar zijn. Het geoptimaliseerde mini-bulkprotocol levert informatierijke biologische signalen op kosteneffectieve sequencingdiepte, waardoor een uitgebreide screening van bekende geneesmiddelen en nieuwe moleculen mogelijk is.
Het doel van het experiment is om te screenen op geneesmiddelactiviteit op PBMC's in verschillende biologische contexten. Dit protocol kan worden toegepast op elke biologische vraag waarbij verschillende geneesmiddelen moeten worden getest met een transcriptomische uitlezing, waardoor een transcriptoombreed beeld wordt gegeven van het cellulaire effect van de behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de richtlijnen van de lokale ethische commissies van de Universiteit van Bonn.
1. Voorbereiding van buffers, oplossingen en apparatuur
- Bereid de oplossingen voor en verzamel de materialen die worden beschreven in de tabel met materialen.
- Verwarm het waterbad tot 37 °C en warm het complete groeimedium op (RPMI-1640 + 10% foetaal kalfsserum (FCS) + 1% penicilline/streptomycine).
- Gebruik voor het oogsten van cellen ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
NOTITIE: Houd een schone omgeving tijdens het werken met cellen om de steriliteit te behouden.
2. Behandeling van cellen
OPMERKING: Een gedetailleerd protocol voor de cryopreservatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) uit menselijk bloed is te vinden in7.
- Cellen ontdooien en tellen
- Haal de cryovials uit vloeibare stikstof en ontdooi ze in een waterbad bij 37 °C gedurende 2 - 3 minuten terwijl ze voorzichtig omkeren.
- Breng de ontdooide cellen over in een conische buis van 50 ml.
- Spoel de cryovial met 1 ml warm compleet groeimedium en voeg deze oplossing druppelsgewijs toe aan de cellen in het buisje (1e verdunningsstap).
- Herhaal de verdunning 1:1 tot een volume van 32 ml (5 verdunningen in totaal met respectievelijk 1, 2, 4, 8 en 16 ml warm compleet groeimedium). Voeg het medium druppelsgewijs toe om celverstoring te verminderen terwijl u de conische buis lichtjes in beweging brengt.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten (300 x g, 20 °C) en verwijder het supernatans door de conische buis voorzichtig in één vloeiende beweging te kantelen.
- Resuspendeer de cellen in 3 ml warm compleet groeimedium en ga verder met het tellen van de cellen.
- Meng voor het tellen 10 μL celsuspensie met Trypan Blue (verdunning van 1:2 tot 1:10 afhankelijk van de dichtheid van de celsuspensie) om tijdens het tellen levende van dode cellen te onderscheiden. Dode of beschadigde cellen zullen blauw lijken door de opname van de kleurstof, terwijl vitale cellen niet gekleurd zijn.
OPMERKING: Trypan Blue is licht cytotoxisch, gekleurde cellen mogen niet langer dan 5 minuten worden bewaard. - Tel de cellen met een geautomatiseerde cellenteller of telkamer met behulp van 10 μL gekleurde celoplossing.
- Wanneer u de door Neubauer verbeterde celkamer gebruikt, telt u alle cellen binnen de vier grote vierkanten op de hoeken en gebruikt u de volgende vergelijking om de concentratie van de celsuspensie te berekenen.
- Wanneer u de door Neubauer verbeterde celkamer gebruikt, telt u alle cellen binnen de vier grote vierkanten op de hoeken en gebruikt u de volgende vergelijking om de concentratie van de celsuspensie te berekenen.
- Verdun de cellen tot een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/ml met warm compleet groeimedium. Centrifugeer alleen als het vereiste volume lager is dan 3 ml en resuspendeer de celpellet tot het juiste volume.
- Celzaaien en behandelen
- Zaad 100 μL celsuspensie per putje in een celkweekplaat met 96 putjes (1 x 105 cellen / putje).
OPMERKING: Het celnummer voor seeding is geoptimaliseerd voor PBMC-culturen. Hoewel lage celconcentraties niet voldoende RNA opleveren voor sequencing, zal een te groot aantal cellen het risico op suboptimale cellyse en remming van de reverse transcriptiereactie verhogen. - Bereid geneesmiddelverdunningen in een concentratie die twee keer zo hoog is als die welke voor de behandeling wordt gebruikt (2x). Kies het oplosmiddel op basis van de oplosbaarheid van de verbinding, bij voorkeur een volledig groeimedium.
OPMERKING: PBS of dimethylsulfoxide (DMSO) kan worden gebruikt als anders niet voldoende oplosbaarheid kan worden bereikt. De maximale concentratie DMSO in het resulterende incubatievolume mag niet hoger zijn dan 0,5 % om cytotoxiciteit door het oplosmiddel te voorkomen. - Voeg 100 μL van de 2x geneesmiddelverdunning toe (eindconcentratie in putje 1X) en incubeer bij 37 °C gedurende de gedefinieerde tijd.
OPMERKING: Er moet aanvullend onderzoek worden uitgevoerd om de optimale incubatietijd van geneesmiddelen vast te stellen en mogelijke mechanismen van cytotoxiciteit uit te sluiten.
- Zaad 100 μL celsuspensie per putje in een celkweekplaat met 96 putjes (1 x 105 cellen / putje).
- Celoogst en lysis
- Centrifugeer de celkweekplaat gedurende 10 minuten (300 x g, 20 °C). Verwijder het supernatans voorzichtig met een vacuümpomp en houd de plaat in een hoek (30°-45°) terwijl u de punt op de lage hoek van de put richt om zo min mogelijk cellen te verwijderen.
- Was de cellen door 200 μL ijskoud PBS aan elk putje toe te voegen en centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten (300 x g, 4 °C). Verwijder het supernatans met een vacuümpomp, nogmaals, en houd de plaat in een scherpe hoek om zoveel mogelijk PBS te verwijderen.
- Bereid de lysisbuffer voor zoals beschreven in tabel 1 voor het aantal reacties (rxn) dat nodig is, met toevoeging van 10% overschrijding.
- Voeg 15 μL lysisbuffer toe aan elk putje en sluit de plaat af met zelfklevende afdichtingsfolie om de monsters te beschermen tegen verontreiniging. Draai de plaat voor het centrifugeren gedurende 1 min (1000 x g, 4 °C) en incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
- Verzamel 6 μL gelyseerde celoplossing in een PCR-plaat en vries het cellysaat kort in bij -80 °C om een optimale cellyse te garanderen. Zorg ervoor dat u meerdere bevriezingscycli van de platen vermijdt.
OPMERKING: STOPPUNT: Als de cDNA-productie vervolgens niet wordt uitgevoerd, kan het cellysaat tot enkele maanden bij -80 °C worden opgeslagen zonder dat de RNA-kwaliteit aanzienlijk afneemt.
3. Bibliotheekvoorbereiding voor sequencing
- Reverse transcriptase (RT) reactie
OPMERKING: Wanneer u met RNA werkt, plaats dan alle monsters op ijs en zorg ervoor dat u nucleasevrije apparatuur (steriel, wegwerpplastic) en water gebruikt.- Bereid het RT-reactiemengsel zoals beschreven in tabel 2 voor op het aantal benodigde reacties, waarbij 10% overschrijding wordt toegevoegd. Draai het mengsel kort in een draaikolk en draai het kort naar beneden. Bewaar het mengsel op ijs tot gebruik.
- Ontdooi het cellysaat bij kamertemperatuur (RT) en draai het kort naar beneden om al het cellysaat op de bodem van de plaat op te vangen.
- Voer mRNA-denaturatie uit op een thermocycler volgens tabel 3.
- Haal de plaat uit de thermocycler en draai hem kort naar beneden om eventueel condensaat op te vangen. Voeg 6 μL RT-reactiemengsel toe aan elk putje voor een eindvolume van 12 μL. Sluit de plaat af om de plaat te beschermen en om verdamping, draaikolk en draai naar beneden te voorkomen.
- Plaats de plaat op de thermocycler en start het RT-reactieprogramma volgens tabel 3.
- Voorversterking
- Ontdooi de high-fidelity DNA-polymerase en in-situ PCR (ISPCR) primer bij kamertemperatuur.
- Bereid de voorversterkingsmix voor volgens tabel 4 voor het aantal benodigde reacties, waarbij 10% overschrijding wordt toegevoegd. Draai het mengsel kort in een draaikolk en draai het naar beneden.
LET OP: De enzymmix is urenlang stabiel bij kamertemperatuur. - Draai de PCR-plaat naar beneden, voeg 15 μL van het vooramplificatiemengsel toe aan elk putje en sluit de plaat af.
- Plaats het op de thermocycler en start de voorversterkingsreactie volgens tabel 5.
- Pas het aantal cycli aan vanwege het RNA-gehalte. Begin met een lager getal en verhoog als de cDNA-opbrengst niet voldoende is.
OPMERKING: Onze ervaring is dat voor elk celtype een optimaal aantal cycli moet worden vastgesteld, de experimentele toestand en behandeling hebben geen invloed op het optimale aantal cycli. We raden daarom aan om het optimale aantal cycli experimenteel vast te stellen bij het opstellen van dit protocol voor een nieuw celtype. Over het algemeen hebben primaire cellen een hoger aantal cycli nodig in vergelijking met cellijnen. STOPPUNT: Het voorversterkingsproduct kan bij - 20 °C worden bewaard.
- Pas het aantal cycli aan vanwege het RNA-gehalte. Begin met een lager getal en verhoog als de cDNA-opbrengst niet voldoende is.
- cDNA opruiming en kwaliteitscontrole (QC)
OPMERKING: Het opschonen van het monster kan voor elke plaat achtereenvolgens worden uitgevoerd, aangezien de monsters in dit stadium vrij stabiel zijn. Het verhogen van het aantal monsters zal leiden tot een langere duur van het protocol, maar zal het aantal monsters dat tegelijkertijd kan worden verwerkt niet beperken.- Breng voordat u begint de magnetische zuiveringskralen gedurende 1 minuut op kamertemperatuur en draai op hoge snelheid om de kralen volledig te resuspenderen.
- Voeg 0,8x v/v (20 μL) magnetische zuiveringsparels toe aan elk putje en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de PCR-plaat gedurende 5 minuten op een magnetisch rek totdat de kralen volledig zijn gescheiden. Verwijder het supernatans voorzichtig.
- Houd de plaat op het magnetische rek en voeg voorzichtig 100 μL vers bereide 80% ethanol toe om de kralen te wassen en gedurende 30 s te incuberen. Gebruik een pipet met een klein volume om het supernatant te verwijderen. Herhaal dit voor een extra wasstap. Zorg ervoor dat u zoveel mogelijk ethanol verwijdert.
- Laat de kralen maximaal 5 minuten aan de lucht drogen op het magnetische rek bij kamertemperatuur totdat de ethanol volledig is verdampt en de kralen er niet meer glanzend uitzien.
- Haal de plaat van het magnetische rek, resuspendeer de kralen in 20 μL nucleasevrij water en incubeer gedurende 2 minuten.
- Plaats de plaat weer op het magneetrek totdat de kralen gescheiden zijn.
- Herstel het eluaat in een nieuwe PCR-plaat voor cDNA QC en tagmentatie.
- Voer een TapeStation- of FragmentAnalyser-test uit om de grootteverdeling en concentratie van de cDNA-bibliotheek te evalueren (aanbevolen: TapeStation D5000-test). Zie de instructies van de fabrikant voor meer informatie. Een typische opbrengst van 20 ng is te verwachten.
- Tagmentatie met kit
OPMERKING: Andere tagmentatieprotocollen kunnen worden gebruikt als deze al zijn vastgesteld.- Verdun het cDNA tot een eindconcentratie van 150 - 300 pg/μL met nucleasevrij water.
- Programmeer de thermocycler voor volgens tabel 6 om een onmiddellijke start van de tagmentatiereactie te garanderen na toevoeging van het cDNA aan de enzymmix.
- Bereid de tagmentatiemix volgens tabel 7 voor op het aantal benodigde reacties, waarbij 10% overschrijding wordt toegevoegd.
- Doseer 3 μL van het tagmentatiemengsel per reactie op een nieuwe PCR-plaat en voeg 1 μL cDNA toe aan elke reactie.
- Start de tagmentatiereactie onmiddellijk na het toevoegen van het cDNA.
- Inactiveer de reactie door 1 μL neutraliserende tagmentbuffer toe te voegen (NT; als alternatief kan 0,2% natriumdodecylsulfaat (SDS) worden gebruikt).
- Verrijking PCR
- Bereid de verrijkings-PCR-mix voor Tabel 7 voor het aantal reacties, waarbij 10% overschrijding wordt toegevoegd. (Aanbevolen: Nextera UDI ingesteld om indexhopping op flowcellen met een patroon te voorkomen (bijv. Illumina NovaSeq 6000)).
- Voeg 9 μL van de verrijkings-PCR-mix toe aan elke reactie voor een totaal volume van 14 μL.
- Voer het verrijkings-PCR-programma uit volgens tabel 8.
OPMERKING: Voor de verrijkings-PCR zijn 16 cycli standaard. Als de cDNA-kwaliteit slecht is, kunnen extra cycli worden toegevoegd.
- Opruimen en QC
- Voordat u begint, brengt u magnetische zuiveringskralen gedurende 1 minuut op kamertemperatuur en draai op hoge snelheid om de kralen volledig te resuspenderen.
- Voeg 1,0x v/v (14 μL) magnetische zuiveringsparels toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de plaat op een magnetisch rek en wacht 5 minuten tot de kralen volledig gescheiden zijn. Verwijder het supernatans voorzichtig.
- Houd de plaat op het magnetische rek en voeg voorzichtig 100 μL vers bereide 80% ethanol toe om de kralen te wassen en gedurende 30 s te incuberen. Gebruik een pipet met een klein volume om het supernatant te verwijderen. Herhaal dit voor een extra wasstap. Zorg ervoor dat u zoveel mogelijk ethanol verwijdert.
- Laat de kralen 3 minuten aan de lucht drogen op kamertemperatuur of totdat ze er niet meer glanzend uitzien.
- Haal de plaat van het magnetische rek, resuspendeer de kralen in 20 μL nucleasevrij water en incubeer gedurende 2 minuten.
- Plaats de plaat opnieuw op het magnetische rek totdat de kralen scheiden en herstel het eluaat in een nieuwe PCR-plaat voor bibliotheek QC.
- Voer een TapeStation- of Fragment Analyzer-test uit om de grootteverdeling en concentratie van de cDNA-bibliotheek te evalueren (aanbevolen: TapeStation D1000 high-sensitivity assay). Zie de instructies van de fabrikant voor meer informatie. Gemiddeld is een opbrengst van 10 ng te verwachten.
OPMERKING: STOPPUNT: Het PCR-product kan worden bewaard bij - 20 °C.
4. Sequencing en voorbewerking van gegevens
- Sequencing
OPMERKING: De volgende richtlijn is van toepassing op alle Illumina-instrumenten voor short-read sequencing. Als de instrumentatie niet beschikbaar is, kan de sequencing worden uitgevoerd door een externe sequencingfaciliteit. Er kunnen ook andere sequencingbenaderingen worden gebruikt. Voor de eenvoud hebben we ervoor gekozen om alleen te rapporteren over de meest gebruikte sequencing-technologie.
OPMERKING: De volgende stappen met betrekking tot softwaregebruik beschrijven de procedure op een Illumina NovaSeq6000 sequencer.- Bundel uniek geïndexeerde bibliotheken in een equimolaire verhouding volgens de resultaten verkregen in stap 3.6.8.
- Meet de concentratie van het uiteindelijke zwembad met een zeer gevoelige test om de molariteit van het monster als volgt te berekenen:
- Laad de flowcel volgens de specificatie van het instrument en volgens experimentele optimalisatie. Voorbeelden van laadconcentraties van gemeenschappelijke instrumenten zijn weergegeven in tabel 9.
- Door het scherm aan te raken, selecteert u Sequentie om de run-instelling te starten.
- Volg de instructies op het scherm en de loadflowcel, sequentie-voor-synthese-cartridge, clusteringcartridge, buffercartridge en zorg ervoor dat de afvalcontainers leeg zijn.
- Zodra alle reagentia door het instrument zijn herkend, klikt u op Run Setup. Definieer hier de naam van de uitvoering en de uitvoermap om de gegevens op te slaan.
- Definieer de sequentiedetails als paired-end met beide lezingen van 51 bp. Twee indexmetingen worden ook gesequenced met elk 8 bp.
- Druk op Bekijken en nadat u hebt gecontroleerd of alle volgordedetails correct zijn, drukt u op Start Run.
NOTITIE: De aanbevolen sequentiediepte is 5 x 106 lezingen/monster, met een minimum van 1 x 106 lezingen/monster.
- Voorbewerking van gegevens
- Transformeer onbewerkte sequencinggegevens naar FASTQ-indeling en demultiplex volgens de steekproefindexen met de tool Bcl2Fastq2. Voer demultiplexing uit met standaardinstellingen. Voor gedetailleerde instructies over Bcl2Fastq2, zie de referentiehandleiding.
OPMERKING: FASTQ-conversie en demultiplexing worden meestal uitgevoerd door de sequencing-faciliteit als sequencing niet intern wordt uitgevoerd. Sequencing-faciliteiten leveren meestal gedemultiplexte FASTQ voor verdere verwerking. - Er zijn verschillende opties beschikbaar voor het uitlijnen van gegevens en het kwantificeren van de abundantie van sequencing-lezingen (aanbevolen: nf-core RNA-seq-pijplijn (https://nf-co.re/rnaseq)). De pijplijn biedt verschillende opties, gebruik de standaardinstelling met STAR8 als uitgelijnd en Salmon9 om de transcriptieovervloed te kwantificeren.
- OPMERKING: Voor verdere bioinformatica-analyse zijn verschillende methoden beschikbaar. Het valt niet binnen het toepassingsgebied van dit protocol om alle (aanbevolen: DEseq2 pijpleiding10) te bestrijken. Een standaard script op basis van de door ons ontwikkelde DEseq2 workflow is te vinden op GitHub (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).
- Transformeer onbewerkte sequencinggegevens naar FASTQ-indeling en demultiplex volgens de steekproefindexen met de tool Bcl2Fastq2. Voer demultiplexing uit met standaardinstellingen. Voor gedetailleerde instructies over Bcl2Fastq2, zie de referentiehandleiding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het gerapporteerde protocol werden menselijke PBMC's gezaaid, behandeld met verschillende immunomodulerende geneesmiddelen en, na verschillende incubatietijden, geoogst voor bulktranscriptomische analyse met behulp van het sequencingprotocol (Figuur 1).
Ideale geneesmiddelconcentraties en incubatietijden voor testverbindingen moeten stroomopwaarts van dit protocol worden vastgesteld met behulp van aanvullende experimentele strategieën en op basis van de specifieke wetenschappelijke vraag. In de meeste gevallen zou een incubatietijd van 2 - 4 uur en 24 uur een weergave moeten geven van vroege en late transcriptiereacties op de behandeling.
De belangrijkste resultaten om de juiste uitvoering van het protocol te evalueren zijn de cDNA en library QC's (Figuur 2 en Figuur 3). cDNA-profiel moet een brede verspreiding hebben met een gemiddelde grootte van > 1000 bp (Figuur 2), een lagere gemiddelde grootte of accumulatie van moleculen met een laag molecuulgewicht (Figuur 4) kan wijzen op een lage RNA-input of RNA-afbraak.
Het opstellen van een goede sequencing library is ook een belangrijke stap in het protocol; post-tagmentatiebibliotheken zouden een vrij smalle verdeling van ongeveer 250 bp moeten hebben (Figuur 3); langere fragmenten zullen slecht presteren tijdens sequencing (Figuur 5).
Na sequencing worden onbewerkte FASTQ-bestanden uitgelijnd met het juiste referentiegenoom (bijv. mens of muis) en wordt de transcriptiedichtheid voor elk monster gekwantificeerd (zie nf-core RNA-seq-pijplijn (https://nf-co.re/rnaseq)). Er zal nu een verkennende gegevensanalyse worden uitgevoerd om de algehele kwaliteit van de gegevens te controleren. Uitgelijnde gegevens zouden een groot aantal eiwitcoderende genen moeten vastleggen, aangezien alleen poly-geadenyleerd RNA met dit protocol zal worden vastgelegd (Figuur 6A). In menselijke monsters verwachten we tussen de 15000 en 20000 transcripten vast te leggen (deze waarde is gebaseerd op de GENCODE 27-referentieannotatie van het menselijk genoom11). Verdere verkennende gegevensanalyse kan de analyse van de belangrijkste componenten (PCA) omvatten. Hier kan de onderliggende structuur van de gegevens worden gevisualiseerd in een tweedimensionale plot. In figuur 6B tonen we een voorbeeldige PCA-plot; Stippen zijn hier gekleurd door de behandeling, met drie verschillende clusters van experimentele omstandigheden die leiden tot vergelijkbare transcriptomische profielen. Hier is ook te zien dat biologische replicaten (stippen met dezelfde kleur) transcriptioneel vergelijkbaar zijn, wat een goede robuustheid van het protocol aantoont. De resultaten die in deze afbeelding worden weergegeven, zijn gegenereerd met pijplijn die beschikbaar is op GitHub op basis van de DESeq2-werkstroom (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).
Figuur 1: Tijdsschattingen en workflow. (A) Tijdschattingen van dit protocol voor een run met 96 monsters. (B) Diagram van elke stap binnen het protocol vanaf het ontdooien van de cellen tot de voorbewerking van de gegevens. Het diagram moet van boven naar beneden worden gelezen volgens de pijlen. Omcirkelde pijlen beschrijven een herhaling van de stap. Rode stippen staan voor stoppunten die verder in het protocol worden beschreven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeeldresultaten voor cDNA-bibliotheken. Resultaten van een geminiaturiseerde elektroforese die de grootteverdeling van een voorbeeldige cDNA-bibliotheek aantoont. Bovenste en onderste signalen vertegenwoordigen markeringen die worden gebruikt om het monster uit te lijnen. Blauwe lijnen geven de gemiddelde fragmentgroottes aan (blauwe haakjes). Het cDNA-profiel laat een brede verspreiding zien met een gemiddelde grootte van > 1000 bp. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Voorbeeldresultaten voor sequencingbibliotheken. Resultaten van een geminiaturiseerde elektroforese die de grootteverdeling laat zien van succesvol geprepareerde sequencingbibliotheken met een smalle verdeling en een gemiddelde grootte van ongeveer 250 bp. Bovenste en onderste signalen vertegenwoordigen markeringen die worden gebruikt om het monster uit te lijnen. Blauwe lijnen geven de gemiddelde fragmentgroottes aan (blauwe haakjes). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorbeeldige suboptimale resultaten voor cDNA-bibliotheken. Resultaten van een geminiaturiseerde elektroforese die de grootteverdeling van een suboptimale cDNA-bibliotheek met een gemiddelde grootte van < 200 bp aantoont. Bovenste en onderste signalen vertegenwoordigen markeringen die worden gebruikt om het monster uit te lijnen. Blauwe lijnen geven de gemiddelde fragmentgroottes aan (blauwe haakjes). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Voorbeelden van suboptimale resultaten voor sequencingbibliotheken. Resultaten van een geminiaturiseerde elektroforese die de grootteverdeling laat zien van een suboptimale sequencingbibliotheek met langere fragmenten van 200 - 1000 bp. Bovenste en onderste signalen vertegenwoordigen markeringen die worden gebruikt om het monster uit te lijnen. Blauwe lijnen geven de gemiddelde fragmentgroottes aan (blauwe haakjes). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Verkennende data-analyse. Representatieve resultaten van verkennende gegevensanalyse die het effect van geselecteerde immunomodulerende geneesmiddelen op PBMC's aantonen. (A) Staafdiagram van het aantal gedetecteerde genen (Y-assen) gescheiden door gentype (X-assen). (B) PCA van alle genen in de dataset gekleurd door de verschillende medicamenteuze behandelingen. Stippen met dezelfde kleur zijn biologische replica's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Reagens | Concentratie | Volume [μL] /rxn |
| Guanidine hydrochloride | 80 mM | 7.50 |
| Deoxynucleotidetrifosfaten (dNTP's) | 10 mM per stuk | 6.52 |
| SMART dT30VN primer | 100 μM | 0.33 |
| Nucleasevrij water | 0.65 | |
| Totaal volume | 15.00 |
Tabel 1: Lysisbuffer.
| Reagens | Volume [μL] /rxn |
| SSRT II buffer (5x) | 2.00 |
| DTT (100 mM) | 0.50 |
| Betaïne (5 miljoen) | 2.00 |
| MgCl2 (1 m) | 0.14 |
| SSRT II (200 E/μL) | 0.25 |
| RNAse-remmer (40 E/μL) | 0.25 |
| TSO-LNA (100 μM) | 0.20 |
| Nucleasevrij water | 0.66 |
| Totaal volume | 6.00 |
Tabel 2: Reverse transcriptase (RT) reactiemix.
| mRNA-denaturatie | ||
| Stap | Temperatuur | Duur |
| mRNA-denaturatie | 95 °C | 2 min |
| op ijs | 2 min | |
| Omgekeerde transcriptie | ||
| Stap | Temperatuur | Duur |
| Omgekeerde transcriptie | 42 °C | 90 minuten |
| Enzym inactivatie | 70 °C | 15 min |
| 4 °C | houden | |
Tabel 3: Thermocycler-programma voor mRNA-denaturatie en reverse transcriptase (RT).
| Reagens | Volume [μL] /rxn |
| High-fidelity DNA-polymerase | 12.50 |
| ISPCR primer (10 μM) | 0.15 |
| Nucleasevrij water | 2.35 |
| Totaal volume | 15.00 |
Tabel 4: Pre-amplificatiemix.
| Stappen | Temperatuur | Duur | |
| Initiële denaturatie | 98 °C | 3 min | |
| Denaturatie | 98 °C | 20 seconden | 16 – 18 cycli |
| Annealing | 67 °C | 20 seconden | |
| Extensie | 72 °C | 6 min | |
| 4 °C | houden |
Tabel 5: Pre-amplificatie thermocycler programma.
| Stappen | Temperatuur | Duur |
| Tagmentatie | 55 °C | 8 min |
| 4 °C | houden |
Tabel 6: Tagmentatie thermocycler programma.
| Tagmentatie mix | |
| Reagens | Volume [μL] /rxn |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | 1.0 |
| Tagment DNA-buffer (TD) | 2.0 |
| Totaal volume | 3.0 |
| Verrijking PCR mix | |
| Reagens | Volume [μL] /rxn |
| High-fidelity DNA-polymerase | 7.0 |
| Nextera-compatibele indexeerprimer | 2.0 |
| Totaal volume | 9.0 |
Tabel 7: Tagmentatiemix en verrijkings-PCR-mix.
| Stappen | Temperatuur | Duur | |
| Hete start | 72 °C | 5 min | |
| Initiële denaturatie | 98 °C | jaren '30 seconden | |
| Denaturatie | 98 °C | 10 seconden | 16 cycli |
| Annealing | 60 °C | jaren '30 seconden | |
| Extensie | 72 °C | 1 minuut | |
| Laatste verlenging | 72 °C | 5 min | |
| 4 °C | houden |
Tabel 8: Verrijking PCR thermocycler programma.
| Instrument | Concentratie laden |
| MiSeq v2 | 22 uur |
| VolgendeSeq 500/550 | 1.4 uur |
| NovaSeq 6000 | 1250 pM |
Tabel 9: Voorbeelden van laadconcentraties van gangbare sequentie-instrumenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het ontdekken en ontwikkelen van geneesmiddelen kan veel baat hebben bij de holistische kijk op cellulaire processen die bulktranscriptomics kan bieden. Desalniettemin wordt deze aanpak vaak beperkt door de hoge kosten van het experiment met het standaard bulk RNA-seq-protocol, waardoor de toepassing ervan in academische omgevingen en het potentieel voor industriële schaalbaarheid worden verhinderd.
De meest kritische stappen van het protocol zijn het ontdooien van de cellen en de eerste stappen van de voorbereiding van de bibliotheek. Het waarborgen van een hoge levensvatbaarheid van de cellen na ontdooien is van cruciaal belang voor succesvolle behandelingen en transcriptomische analyse. De eerste stappen van het oogsten van cellen en de voorbereiding van de bibliotheek tot cDNA-synthese zijn van cruciaal belang voor het behoud van de integriteit van het RNA. Het is in dit stadium van cruciaal belang om het cellysaat te allen tijde op ijs te houden en de monsters zo snel mogelijk te verwerken. Als overmatige RNA-afbraak wordt waargenomen, moeten laboratoriumoppervlakken en -apparatuur worden gereinigd met specifieke producten om RNase-activiteit te remmen.
Het hier beschreven protocol is momenteel geoptimaliseerd voor medicamenteuze behandeling op PBMC's van gezonde donoren gedurende maximaal 24 uur. Om het experiment uit te voeren met een ander celtype of voor een langere incubatietijd, moeten de celaantallen voor zaai- en kweekomstandigheden mogelijk dienovereenkomstig worden geoptimaliseerd.
Met dit protocol bieden we een workflow voor transcriptomische analyse bij medicamenteuze behandeling op PBMC's met behulp van standaard laboratoriumapparatuur en zonder dat er commerciële kits nodig zijn. Met deze aanpak en het vermijden van de stap van RNA-zuivering, hebben we de kosten aanzienlijk verlaagd, waardoor parallelle analyse van een groot aantal verbindingen mogelijk is.
Omdat dit protocol gebaseerd is op een in vitro test, is de belangrijkste beperking dat het geen metabole verwerking van de geneesmiddelen kan evalueren die tot verschillende bioactiviteit zou kunnen leiden. Bovendien zal het aantal vastgelegde transcripten en de sequentiediepte lager zijn dan bij standaard bulktranscriptomics-methoden van volledige lengte, waardoor het gebruik van deze gegevens voor toepassingen die een hogere informatie-inhoud vereisen, zoals differentiële splitsing of kwantificering van polymorfismen met één nucleotide, wordt voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.
Acknowledgments
J.L.S. wordt ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting (DFG) in het kader van de Duitse excellentiestrategie (EXC2151-390873048) en in het kader van SCHU 950/8-1; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammatie, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, het door BMBF gefinancierde excellentieproject Diet-Body-Brain (DietBB); en het EU-project SYSCID onder subsidienummer 733100. M.B. wordt ondersteund door DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. wordt ondersteund door DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 - Projectnummer 513977171) en de Duitse Excellence Strategy (EXC2151-390873048). Afbeeldingen gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
| Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
| Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
| Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
| Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
| Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
| SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
| Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
| Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
References
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L.
- Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery. Front Genet. 11, 19 (2020).
- Bonaguro, L., et al. A guide to systems-level immunomics. Nat Immunol. 23 (10), 1412-1423 (2022).
- Carraro, C., et al. Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state. ELife. 11, 78012 (2022).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- De Domenico, E., et al. Optimized workflow for single-cell transcriptomics on infectious diseases including COVID-19. STAR Protoc. 1 (3), 100233 (2020).
- Dobin, A., et al.
- Patro, R., et al. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Frankish, A., et al. GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).
