Summary
Bu protokol, uygun maliyetli transkriptom tabanlı ilaç taraması için ex vivo veya in vitro hücre kültürlerinden transkriptomik veri ön işlemeye kadar bir iş akışını açıklar.
Abstract
Transkriptomik, hücresel programlar ve bunların bozulmalara verdiği yanıtlar hakkında kapsamlı bilgiler elde etmeyi sağlar. Son on yılda kütüphane üretim ve sıralama maliyetlerinde önemli bir düşüşe rağmen, bu teknolojilerin uyuşturucu taraması için gerekli ölçekte uygulanması aşırı derecede pahalı olmaya devam etmekte ve bu yöntemlerin muazzam potansiyelini engellemektedir. Çalışmamız, minyatür pertürbasyon kültürlerini mini-toplu transkriptomik ile birleştiren, transkriptom bazlı ilaç taraması için uygun maliyetli bir sistem sunmaktadır. Optimize edilmiş mini-bulk protokolü, uygun maliyetli dizileme derinliğinde bilgilendirici biyolojik sinyaller sağlayarak bilinen ilaçların ve yeni moleküllerin kapsamlı bir şekilde taranmasını sağlar. Seçilen tedavi ve inkübasyon süresine bağlı olarak, bu protokol yaklaşık 2 gün içinde kütüphanelerin dizilenmesiyle sonuçlanacaktır. Bu protokoldeki birkaç duraklama noktası nedeniyle, kütüphane hazırlığı ve sıralaması zamandan bağımsız olarak gerçekleştirilebilir. Aynı anda çok sayıda numunenin işlenmesi mümkündür; 384 numuneye kadar ölçüm, veri kalitesinde kayıp olmadan test edilmiştir. Optimal ilaç inkübasyon sürelerindeki değişkenlik göz önüne alınmasına rağmen, koşulların ve/veya ilaçların sayısında bilinen bir sınırlama da yoktur.
Introduction
Yeni ilaçların geliştirilmesi, potansiyel ilaçların ve hedeflerinin belirlenmesini, ilaç adaylarının optimize edilmesini ve sentezlenmesini ve klinik öncesi ve klinik çalışmalarda etkinliklerinin ve güvenliklerinin test edilmesini içeren karmaşık ve zaman alıcı bir süreçtir1. İlaç taraması için geleneksel yöntemler, yani terapötik amaçlar için aday bileşiklerin kütüphanelerinin sistematik olarak değerlendirilmesi, belirli hedefler veya yollar üzerindeki etkileri test etmek için hayvan modellerinin veya hücre bazlı tahlillerin kullanılmasını içerir. Bu yöntemler ilaç adaylarının belirlenmesinde başarılı olmakla birlikte, genellikle ilaç etkinliğinin altında yatan karmaşık moleküler mekanizmalar ve ayrıca toksisite ve potansiyel yan etki mekanizmaları hakkında yeterli bilgi sağlamamıştır.
Genom çapında transkripsiyonel durumların değerlendirilmesi, ilaç tedavilerine yanıt olarak gen ekspresyonunun kapsamlı değerlendirmelerini mümkün kıldığından, ilaç taramasındaki mevcut sınırlamaların üstesinden gelmek için güçlü bir yaklaşım sunmaktadır2. Transkriptomik, RNA transkriptlerini belirli bir zamanda ifade edilen genom çapında bir şekilde ölçerek, gen ekspresyon modellerindeki değişiklikler, alternatif ekleme ve kodlamayan RNA ekspresyonu dahil olmak üzere ilaçlara yanıt olarak meydana gelen transkripsiyonel değişikliklerin bütünsel bir görünümünü sağlamayı amaçlamaktadır3. Bu bilgiler, ilaç hedeflerini belirlemek, ilaç etkinliğini ve toksisitesini tahmin etmek ve ilaç dozlama ve tedavi rejimlerini optimize etmek için kullanılabilir.
Transkriptomiklerin tarafsız ilaç taraması ile birleştirilmesinin en önemli faydalarından biri, daha önce dikkate alınmamış yeni ilaç hedeflerini belirleme potansiyelidir. Konvansiyonel ilaç tarama yaklaşımları genellikle yeni hedeflerin belirlenmesini engelleyen ve potansiyel olarak öngörülemeyen yan etkilere ve sınırlı etkinliğe sahip ilaçlarla sonuçlanan belirlenmiş hedef moleküllere veya yollara odaklanmaktadır. Transkriptomikler, ilaç tedavisine yanıt olarak meydana gelen moleküler değişiklikler hakkında bilgi sağlayarak, daha önce düşünülmemiş olabilecek potansiyel hedefleri veya yolları ortaya çıkararak bu sınırlamaların üstesinden gelebilir2.
Yeni ilaç hedeflerinin belirlenmesine ek olarak, transkriptomikler ilaç etkinliğini ve toksisitesini tahmin etmek için de kullanılabilir. İlaç yanıtları ile ilişkili gen ekspresyon modellerini analiz ederek, bir hastanın belirli bir ilaca veya tedavi rejimine yanıtını tahmin etmek için kullanılabilecek biyobelirteçler geliştirilebilir. Bu aynı zamanda ilaç dozunu optimize etmeye ve olumsuz yan etki riskini azaltmaya yardımcı olabilir4.
Potansiyel faydalarına rağmen, transkriptomiklerin maliyeti, ilaç taramasında yaygın olarak uygulanmasının önünde önemli bir engel olmaya devam etmektedir. Transkriptomik analiz, özel ekipman, teknik uzmanlık ve veri analizi gerektirir, bu da daha küçük araştırma ekiplerinin veya sınırlı finansmana sahip kuruluşların ilaç taramasında transkriptomik kullanmasını zorlaştırabilir. Bununla birlikte, transkriptomiklerin maliyeti istikrarlı bir şekilde düşmekte ve bu da onu araştırma toplulukları için daha erişilebilir hale getirmektedir. Ek olarak, teknoloji ve veri analizi yöntemlerindeki gelişmeler, transkriptomikleri daha verimli ve uygun maliyetli hale getirerek erişilebilirliğini daha da artırmıştır2.
Bu protokolde, minyatür pertürbasyon kültürlerini mini-toplu transkriptomik analiz 5,6 ile birleştiren, transkriptom tabanlı ilaç taraması için yüksek boyutlu ve keşifsel bir sistem tanımlıyoruz. Bu protokol ile numune başına maliyeti, tam uzunlukta mRNA dizilimi için mevcut ticari çözümmaliyetinin 1/6'sına düşürmek mümkündür. Protokol yalnızca standart laboratuvar ekipmanı gerektirir, tek istisna, dizileme cihazlarının kurum içinde bulunmaması durumunda dış kaynaklı olabilen kısa okuma dizileme teknolojilerinin kullanılmasıdır. Optimize edilmiş mini-bulk protokolü, uygun maliyetli dizileme derinliğinde bilgi açısından zengin biyolojik sinyaller sağlayarak bilinen ilaçların ve yeni moleküllerin kapsamlı bir şekilde taranmasını sağlar.
Deneyin amacı, farklı biyolojik bağlamlarda PBMC'ler üzerindeki ilaç aktivitesini taramaktır. Bu protokol, birkaç ilacın transkriptomik bir okuma ile test edilmesi gereken herhangi bir biyolojik soruya uygulanabilir ve tedavinin hücresel etkisinin transkriptom çapında bir görünümünü verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Bonn Üniversitesi'nin yerel etik kurullarının yönergelerini takip eder.
1. Tamponların, çözeltilerin ve ekipmanların hazırlanması
- Çözeltileri hazırlayın ve Malzeme Tablosunda açıklanan malzemeleri toplayın.
- Su banyosunu 37 °C'ye ısıtın ve tüm büyüme ortamını ısıtın (RPMI-1640 +% 10 fetal buzağı serumu (FCS) +% 1 penisilin / streptomisin).
- Hücre hasadı için buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) kullanın.
NOT: Steriliteyi korumak için hücrelerle çalışırken temiz bir ortam sağlayın.
2. Hücre işleme
NOT: İnsan kanından periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) dondurularak saklanması için ayrıntılı bir protokol7'de bulunabilir.
- Hücre çözme ve sayım
- Kriyoviyalleri sıvı nitrojenden çıkarın ve hafifçe ters çevirirken 37 °C'de 2 - 3 dakika su banyosunda çözdürün.
- Çözülmüş hücreleri 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
- Kriyoviyal 1 mL ılık tam büyüme ortamı ile durulayın ve bu çözeltiyi tüpteki hücrelere damla damla ekleyin (1. seyreltme adımı).
- 32 mL'lik bir hacme ulaşana kadar seyreltmeyi 1: 1 tekrarlayın (sırasıyla 1, 2, 4, 8 ve 16 mL ılık tam büyüme ortamı ile toplam 5 seyreltme). Konik tüpü hafifçe çalkalarken hücre rahatsızlığını azaltmak için ortamı damla damla ekleyin.
- Hücre süspansiyonunu 5 dakika (300 x g, 20 °C) santrifüjleyin ve konik boruyu tek bir akıcı hareketle hafifçe eğerek süpernatanı çıkarın.
- Hücreleri 3 mL sıcak tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin ve hücre sayımına devam edin.
- Sayma için, sayım sırasında canlıları ölü hücrelerden ayırt etmek için 10 μL hücre süspansiyonunu Tripan Mavisi (hücre süspansiyonunun yoğunluğuna bağlı olarak 1:2 ila 1:10 seyreltme) ile karıştırın. Ölü veya hasarlı hücreler, boyanın alınması nedeniyle mavi görünürken, hayati hücreler lekelenmez.
NOT: Tripan Mavisi hafif sitotoksiktir, lekeli hücreler 5 dakikadan fazla saklanmamalıdır. - 10 μL lekeli hücre çözeltisi kullanarak hücreleri otomatik bir hücre sayacı veya sayma odası ile sayın.
- Neubauer ile geliştirilmiş hücre odasını kullanırken, köşelerde bulunan dört büyük kare içindeki tüm hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın.
- Neubauer ile geliştirilmiş hücre odasını kullanırken, köşelerde bulunan dört büyük kare içindeki tüm hücreleri sayın ve hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın.
- Hücreleri, ılık tam büyüme ortamı ile 1 x 106 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Sadece gerekli hacim 3 mL'den düşükse santrifüjleyin ve hücre peletini doğru hacme yeniden süspanse edin.
- Hücre tohumlama ve tedavisi
- 96 oyuklu bir hücre kültürü plakasında (1 x 105 hücre / oyuk) oyuk başına 100 μL hücre süspansiyonu tohumlayın.
NOT: Tohumlama için hücre sayısı PBMC kültürleri için optimize edilmiştir. Düşük hücre konsantrasyonları dizileme için yeterli miktarda RNA vermeyecek olsa da, aşırı sayıda hücre, optimal olmayan hücre lizisi ve ters transkripsiyon reaksiyonunun inhibisyonu riskini artıracaktır. - İlaç dilüsyonlarını tedavi için kullanılanın iki katı konsantrasyonda hazırlayın (2x). Çözücüyü, bileşiğin çözünürlüğüne, tercihen tam büyüme ortamına göre seçin.
NOT: Aksi takdirde yeterli çözünürlüğe ulaşılamazsa PBS veya dimetil sülfoksit (DMSO) kullanılabilir. Çözücü tarafından indüklenen sitotoksisiteyi önlemek için elde edilen inkübasyon hacmindeki maksimum DMSO konsantrasyonu %0,5'i geçmemelidir. - 100 μL 2x ilaç seyreltmesi ekleyin (kuyu 1X'teki son konsantrasyon) ve tanımlanan süre boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: Optimal ilaç inkübasyon süresini belirlemek ve potansiyel sitotoksisite mekanizmalarını dışlamak için tamamlayıcı araştırmalar yapılmalıdır.
- 96 oyuklu bir hücre kültürü plakasında (1 x 105 hücre / oyuk) oyuk başına 100 μL hücre süspansiyonu tohumlayın.
- Hücre toplama ve parçalanma
- Hücre kültürü plakasını 10 dakika (300 x g, 20 °C) santrifüjleyin. Mümkün olduğunca az hücreyi çıkarmak için ucu kuyunun alt köşesine doğrularken, plakayı bir açıda (30 ° -45 °) tutarak süpernatanı bir vakum pompasıyla nazikçe çıkarın.
- Her bir oyuğa 200 μL buz gibi soğuk PBS ekleyerek hücreleri yıkayın ve plakayı 5 dakika (300 x g, 4 °C) santrifüjleyin. Süpernatanı bir vakum pompasıyla çıkarın, mümkün olduğunca fazla PBS'yi çıkarmak için plakayı keskin bir açıda tutun.
- Lizis tamponunu, gerekli reaksiyon sayısı (rxn) için Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın ve% 10 fazlalık ekleyin.
- Her oyuğa 15 μL lizis tamponu ekleyin ve numuneleri kontaminasyona karşı korumak için plakayı yapışkan sızdırmazlık filmi ile kapatın. Santrifüjlemeden önce plakayı 1 dakika (1000 x g, 4 °C) vorteksleyin ve buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
- Bir PCR plakasında 6 μL parçalanmış hücre çözeltisi toplayın ve optimum hücre lizizini sağlamak için hücre lizatını -80 ° C'de kısa bir süre dondurun. Plakaların birden fazla donma döngüsünden kaçındığınızdan emin olun.
NOT: DURMA NOKTASI: CDNA ÜRETIMI DAHA SONRA GERÇEKLEŞTIRILMEZSE, HÜCRE LIZATı, RNA KALITESINDE ÖNEMLI BIR AZALMA OLMADAN -80 ° C'de birkaç aya kadar saklanabilir.
3. Sıralama için kütüphane hazırlığı
- Ters transkriptaz (RT) reaksiyonu
NOT: RNA ile çalışırken, tüm numuneleri buz üzerine yerleştirin ve nükleaz içermeyen ekipman (steril, tek kullanımlık plastik eşyalar) ve su kullandığınızdan emin olun.- RT reaksiyon karışımını, gerekli reaksiyon sayısı için Tablo 2'de açıklandığı gibi hazırlayın ve% 10 fazlalık ekleyin. Karışımı kısaca vorteksleyin ve kısaca döndürün. Karışımı kullanana kadar buz üzerinde tutun.
- Hücre lizatını oda sıcaklığında (RT) çözün ve plakanın altındaki tüm hücre lizatını toplamak için kısaca döndürün.
- Tablo 3'e göre bir termosiklatör üzerinde mRNA denatürasyonu gerçekleştirin.
- Plakayı termocycler'dan çıkarın ve potansiyel yoğuşmayı toplamak için kısa bir süre aşağı döndürün. 12 μL'lik bir son hacim için her bir oyuğa 6 μL RT reaksiyon karışımı ekleyin. Plakayı korumak ve buharlaşmayı, girdabı önlemek ve döndürmek için plakayı kapatın.
- Plakayı termodöngüleyiciye yerleştirin ve Tablo 3'e göre RT reaksiyon programını başlatın.
- Ön amplifikasyon
- Yüksek kaliteli DNA polimeraz ve yerinde PCR (ISPCR) primerini oda sıcaklığında çözdürün.
- İhtiyaç duyulan reaksiyon sayısı için ön amplifikasyon karışımını Tablo 4'e göre hazırlayın ve %10 fazlalık ekleyin. Karışımı kısaca vorteksleyin ve döndürün.
NOT: Enzim karışımı oda sıcaklığında saatlerce stabildir. - PCR plakasını aşağı doğru döndürün, her bir oyuğa 15 μL ön amplifikasyon karışımı ekleyin ve plakayı kapatın.
- Termodöngüleyiciye yerleştirin ve Tablo 5'e göre ön amplifikasyon reaksiyonunu başlatın.
- RNA içeriğine bağlı döngü sayısını ayarlayın. Daha düşük bir sayı ile başlayın ve cDNA verimi yeterli değilse artırın.
NOT: Deneyimlerimize göre, her hücre tipi için optimal döngü sayısı belirlenmelidir, deneysel durum ve tedavi optimal döngü sayısını etkilemeyecektir. Bu nedenle, yeni bir hücre tipi için bu protokolü oluştururken deneysel olarak en uygun döngü sayısını belirlemenizi öneririz. Genel olarak, birincil hücreler, hücre hatlarına kıyasla daha fazla sayıda döngü gerektirecektir. DURMA NOKTASI: Ön amplifikasyon ürünü - 20 °C'de saklanabilir.
- RNA içeriğine bağlı döngü sayısını ayarlayın. Daha düşük bir sayı ile başlayın ve cDNA verimi yeterli değilse artırın.
- cDNA temizleme ve kalite kontrol (QC)
NOT: Numuneler bu aşamada oldukça stabil olduğundan, numune temizleme her plaka için sırayla gerçekleştirilebilir. Numune sayısının arttırılması, protokolün daha uzun sürmesine yol açacak, ancak aynı anda işlenebilecek numune sayısını sınırlamayacaktır.- Başlamadan önce, manyetik arıtma boncuklarını oda sıcaklığına getirin ve boncukları tamamen yeniden süspanse etmek için 1 dakika boyunca yüksek hızda girdap yapın.
- Her oyuğa 0,8x v/v (20 μL) manyetik saflaştırma boncukları ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- PCR plakasını boncuklar tamamen ayrılana kadar 5 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın.
- Plakayı manyetik rafta tutarak, boncukları yıkamak ve 30 saniye inkübe etmek için yavaşça 100 μL taze hazırlanmış% 80 etanol ekleyin. Süpernatanı çıkarmak için küçük hacimli bir pipet kullanın. Ek bir yıkama adımı için tekrarlayın. Mümkün olduğunca fazla etanol çıkardığınızdan emin olun.
- Etanol tamamen buharlaşana ve boncuklar artık parlak görünmeyene kadar manyetik raftaki boncukları oda sıcaklığında 5 dakikaya kadar havayla kurutun.
- Plakayı manyetik raftan çıkarın, boncukları 20 μL nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin ve 2 dakika inkübe edin.
- Boncuklar ayrılana kadar plakayı tekrar manyetik rafa yerleştirin.
- cDNA QC ve etiketleme için yeni bir PCR plakasında elüatı geri kazanın.
- cDNA kitaplığının boyut dağılımını ve konsantrasyonunu değerlendirmek için bir TapeStation veya FragmentAnalyzer testi gerçekleştirin (Önerilen: TapeStation D5000 testi). Ayrıntılar için üretici talimatlarına bakın. 20 ng'lik tipik bir verim beklenebilir.
- Kit ile etiketleme
NOT: Önceden kurulmuşsa diğer Etiketleme protokolleri kullanılabilir.- Nükleaz içermeyen su kullanarak cDNA'yı 150 - 300 pg/μL'lik nihai konsantrasyona seyreltin.
- cDNA'yı enzim karışımına ekledikten sonra etiketleme reaksiyonunun hemen başlamasını sağlamak için termodöngüleyiciyi Tablo 6'ya göre önceden programlayın.
- İhtiyaç duyulan reaksiyon sayısı için etiketleme karışımını Tablo 7'ye göre hazırlayın ve %10 fazlalık ekleyin.
- Reaksiyon başına 3 μL etiketleme karışımını yeni bir PCR plakasına dağıtın ve her reaksiyona 1 μL cDNA ekleyin.
- cDNA'yı ekledikten hemen sonra etiketleme reaksiyonunu başlatın.
- 1 μL nötralize etiketleme tamponu ekleyerek reaksiyonu etkisiz hale getirin (NT; alternatif olarak,% 0.2 sodyum dodesil sülfat (SDS) kullanılabilir).
- Zenginleştirme PCR
- Reaksiyon sayısı için zenginleştirme PCR karışımı Tablo 7'yi hazırlayın ve% 10 fazlalık ekleyin. (Önerilen: Nextera UDI, desenli akış hücrelerinde indeks atlamasını önleyecek şekilde ayarlanmıştır (örneğin, Illumina NovaSeq 6000)).
- Toplam 14 μL hacim için her reaksiyona 9 μL zenginleştirme PCR karışımı ekleyin.
- Zenginleştirme PCR programını Tablo 8'e göre çalıştırın.
NOT: Zenginleştirme PCR için 16 döngü standarttır. cDNA kalitesi düşükse, ek döngüler eklenebilir.
- Temizleme ve Kalite Kontrol
- Başlamadan önce, manyetik arıtma boncuklarını oda sıcaklığına getirin ve boncukları tamamen yeniden süspanse etmek için 1 dakika boyunca yüksek hızda girdap yapın.
- 1.0x v/v (14 μL) manyetik saflaştırma boncukları ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- Plakayı manyetik bir rafa yerleştirin ve boncuklar tamamen ayrılana kadar 5 dakika bekleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın.
- Plakayı manyetik rafta tutarak, boncukları yıkamak ve 30 saniye inkübe etmek için yavaşça 100 μL taze hazırlanmış% 80 etanol ekleyin. Süpernatanı çıkarmak için küçük hacimli bir pipet kullanın. Ek bir yıkama adımı için tekrarlayın. Mümkün olduğunca fazla etanol çıkardığınızdan emin olun.
- Boncukları oda sıcaklığında 3 dakika veya artık parlak görünmeyene kadar havayla kurutun.
- Plakayı manyetik raftan çıkarın, boncukları 20 μL nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin ve 2 dakika inkübe edin.
- Boncuklar ayrılana kadar plakayı tekrar manyetik rafa yerleştirin ve elüatı kütüphane QC için yeni bir PCR plakasında geri kazanın.
- cDNA kitaplığının boyut dağılımını ve konsantrasyonunu değerlendirmek için bir TapeStation veya Fragment Analyzer testi gerçekleştirin (Önerilen: TapeStation D1000 yüksek hassasiyetli test). Ayrıntılar için üretici talimatlarına bakın. Ortalama olarak, 10 ng'lik bir verim beklenir.
NOT: DURMA NOKTASI: PCR ürünü - 20 °C'de saklanabilir.
4. Sıralama ve veri ön işleme
- Sıralama
NOT: Aşağıdaki kılavuz, kısa okuma sıralaması için tüm Illumina cihazlarına uygulanacaktır. Enstrümantasyon mevcut değilse, sıralama harici bir sıralama tesisi tarafından gerçekleştirilebilir. Diğer sıralama yaklaşımları da kullanılabilir. Kolaylık olması için, yalnızca en yaygın kullanılan sıralama teknolojisini raporlamayı seçtik.
NOT: Yazılım kullanımıyla ilgili aşağıdaki adımlar, bir Illumina NovaSeq6000 sıralayıcıdaki prosedürü açıklar.- Benzersiz indekslenmiş kütüphaneleri adım 3.6.8'de elde edilen sonuçlara göre eşmolar bir oranda havuzlayın.
- Numune molaritesini aşağıdaki gibi hesaplamak için son havuzun konsantrasyonunu yüksek hassasiyetli bir tahlil ile ölçün:
- Akış hücresini cihazın özelliklerine ve deneysel optimizasyona göre yükleyin. Yaygın aletlerin yükleme konsantrasyonları için örnekler Tablo 9'da gösterilmektedir.
- Ekrana dokunarak, çalıştırma kurulumunu başlatmak için Sıra'yı seçin.
- Ekrandaki talimatları izleyin ve akış hücresi, senteze göre sıralı kartuş, kümeleme kartuşu, tampon kartuşu yükleyin ve atık kaplarının boş olduğundan emin olun.
- Tüm reaktifler cihaz tarafından tanındıktan sonra Kurulumu Çalıştır'a tıklayın. Burada verileri depolamak için çalıştırma adını ve çıktı klasörünü tanımlayın.
- Sıralama ayrıntılarını, her ikisi de 51 bp'lik okumalarla eşleştirilmiş uç olarak tanımlayın. İki indeks okuması da her biri 8 bp ile sıralanır.
- İnceleme'ye basın ve tüm sıralama ayrıntılarının doğru olup olmadığını kontrol ettikten sonra Çalıştırmayı Başlat'a basın.
NOT: Önerilen sıralama derinliği 5 x 106 okuma/örnek, minimum 1 x 106 okuma/örnektir.
- Veri ön işleme
- Ham sıralama verilerini FASTQ formatına dönüştürün ve Bcl2Fastq2 aracıyla örnek dizinlere göre çoğullamayı çözün. Varsayılan ayarlarla çoğullama çözme gerçekleştirin. Bcl2Fastq2 ile ilgili ayrıntılı talimatlar için referans kılavuzuna bakın.
NOT: FASTQ dönüştürme ve çoğullama çözme, sıralama şirket içinde gerçekleştirilmiyorsa, genellikle sıralama tesisi tarafından gerçekleştirilir. Sıralama tesisleri genellikle daha sonraki işlemler için çoğullamadan arındırılmış FASTQ sağlayacaktır. - Sıralama okumalarının veri hizalaması ve bolluk ölçümü için çeşitli seçenekler mevcuttur (Önerilen: nf-core RNA-seq ardışık düzeni (https://nf-co.re/rnaseq)). İşlem hattı çeşitli seçenekler sunar, transkript bolluğunu ölçmek için hizalanmış olarak STAR8 ve Somon9 ile varsayılan ayarı kullanın.
- NOT: Daha fazla biyoinformatik analiz için çeşitli yöntemler mevcuttur. Tümünü kapsayacak şekilde bu protokolün kapsamında değildir (Önerilen: DEseq2 boru hattı10). Tarafımızca geliştirilen DEseq2 iş akışına dayalı standart bir komut dosyası GitHub'da (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2) bulunabilir.
- Ham sıralama verilerini FASTQ formatına dönüştürün ve Bcl2Fastq2 aracıyla örnek dizinlere göre çoğullamayı çözün. Varsayılan ayarlarla çoğullama çözme gerçekleştirin. Bcl2Fastq2 ile ilgili ayrıntılı talimatlar için referans kılavuzuna bakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bildirilen protokolü takiben, insan PBMC'leri tohumlandı, farklı immünomodülatör ilaçlarla muamele edildi ve farklı inkübasyon sürelerinden sonra, dizileme protokolü kullanılarak toplu transkriptomik analiz için hasat edildi (Şekil 1).
Test bileşikleri için ideal ilaç konsantrasyonları ve inkübasyon süreleri, tamamlayıcı deneysel stratejiler yardımıyla ve spesifik bilimsel soruya dayalı olarak bu protokolün yukarısında tanımlanmalıdır. Çoğu durumda, 2-4 saat ve 24 saat inkübasyon, tedaviye erken ve geç transkripsiyonel yanıtların bir temsilini sağlamalıdır.
Protokolün doğru yürütülmesini değerlendirmek için en önemli sonuçlar cDNA ve kütüphane QC'leridir (Şekil 2 ve Şekil 3). cDNA profili, ortalama boyutu > 1000 bp olan geniş bir dağılıma sahip olmalıdır (Şekil 2), daha düşük bir ortalama boyut veya düşük moleküler ağırlıkta molekül birikimi (Şekil 4), düşük bir RNA girdisini veya RNA bozulmasını gösterebilir.
İyi bir sıralama kütüphanesinin hazırlanması da protokolde önemli bir adımdır; etiketleme sonrası kütüphaneler yaklaşık 250 bp'lik oldukça dar bir dağılıma sahip olmalıdır (Şekil 3); daha uzun parçalar dizileme sırasında düşük performans gösterecektir (Şekil 5).
Dizilemeyi takiben, ham FASTQ dosyaları uygun referans genomuna (örneğin, insan veya fare) göre hizalanır ve transkript bolluğu her numune için ölçülür (bkz. nf-core RNA-seq ardışık düzeni (https://nf-co.re/rnaseq)). Verilerin genel kalitesini kontrol etmek için artık keşifsel veri analizi gerçekleştirilecektir. Bu protokolle sadece poli adenillenmiş RNA yakalanacağından, hizalanmış veriler çok sayıda protein kodlayan geni yakalamalıdır (Şekil 6A). İnsan örneklerinde 15000 ila 20000 transkript yakalamayı bekliyoruz (bu değer GENCODE 27 referans insan genomu açıklaması11'e dayanmaktadır). Daha fazla keşifsel veri analizi, temel bileşen analizini (PCA) içerebilir. Burada, verilerin temel yapısı iki boyutlu bir grafikte görselleştirilebilir. Şekil 6B'de örnek bir PCA grafiği gösteriyoruz; Buradaki noktalar, benzer transkriptomik profillere yol açan üç farklı deneysel koşul kümesini gösteren tedavi ile renklendirilmiştir. Burada biyolojik kopyaların (aynı renge sahip noktalar) transkripsiyonel olarak benzer olduğu ve protokolün iyi bir sağlamlığını gösterdiği de görülebilir. Bu şekilde gösterilen sonuçlar, DESeq2 iş akışına (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2) dayalı olarak GitHub'da bulunan işlem hattı ile oluşturulmuştur.
Şekil 1: Zaman tahminleri ve iş akışı. (A) 96 örnekli bir çalışma için bu protokolün zaman tahminleri. (B) Hücrelerin çözülmesinden veri ön işlemesine kadar protokol içindeki her adımın şeması. Diyagram okları takip ederek yukarıdan aşağıya doğru okunmalıdır. Daire içine alınmış oklar, adımın tekrarını tanımlar. Kırmızı noktalar, protokolde daha ayrıntılı olarak açıklanan durma noktalarını temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: cDNA kütüphaneleri için örnek sonuçlar. Örnek cDNA kütüphanesinin boyut dağılımını gösteren minyatür bir elektroforezin sonuçları. Üst ve alt sinyaller, numuneyi hizalamak için kullanılan işaretçileri temsil eder. Mavi çizgiler ortalama parça boyutlarını gösterir (mavi parantezler). cDNA profili, ortalama 1000 bp> büyüklüğünde geniş bir dağılım gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sıralama kitaplıkları için örnek sonuçlar. Dar bir dağılıma ve ortalama 250 bp civarında bir boyuta sahip, başarıyla hazırlanmış dizileme kitaplıklarının boyut dağılımını gösteren minyatür bir elektroforezin sonuçları. Üst ve alt sinyaller, numuneyi hizalamak için kullanılan işaretçileri temsil eder. Mavi çizgiler ortalama parça boyutlarını gösterir (mavi parantezler). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: cDNA kütüphaneleri için örnek suboptimal sonuçlar. Ortalama boyutu 200 bp'< olan optimal olmayan bir cDNA kütüphanesinin boyut dağılımını gösteren minyatür bir elektroforezin sonuçları. Üst ve alt sinyaller, numuneyi hizalamak için kullanılan işaretçileri temsil eder. Mavi çizgiler ortalama parça boyutlarını gösterir (mavi parantezler). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Sıralama kitaplıkları için örnek yetersiz sonuçlar. 200 - 1000 bp'lik daha uzun parçalar içeren optimal olmayan bir dizileme kütüphanesinin boyut dağılımını gösteren minyatür bir elektroforezin sonuçları. Üst ve alt sinyaller, numuneyi hizalamak için kullanılan işaretçileri temsil eder. Mavi çizgiler ortalama parça boyutlarını gösterir (mavi parantezler). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Keşifsel veri analizi. Seçilen immünomodülatör ilaçların PBMC'ler üzerindeki etkisini gösteren keşifsel veri analizinin temsili sonuçları. (A) Gen tipine (X eksenleri) göre ayrılmış tespit edilen genlerin (Y eksenleri) sayısının çubuk grafiği. (B) Farklı ilaç tedavileri ile renklendirilen veri setindeki tüm genlerin PCA'sı. Aynı renkteki noktalar biyolojik kopyalardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Reaktif | Konsantrasyon | Hacim [μL] /rxn |
| Guanidin hidroklorür | 80 milyon | 7.50 |
| Deoksinükleotid trifosfatlar (dNTP'ler) | Her biri 10 mM | 6.52 |
| SMART dT30VN astar | 100 μM | 0.33 |
| Nükleaz içermeyen su | 0.65 | |
| Toplam hacim | 15.00 |
Tablo 1: Lizis tamponu.
| Reaktif | Hacim [μL] /rxn |
| SSRT II arabelleği (5x) | 2.00 |
| DTT (100 mM) | 0.50 |
| Betain (5 M) | 2.00 |
| MgCl2 (1 m) | 0.14 |
| SSRT II (200 U/μL) | 0.25 |
| RNAse inhibitörü (40 U/μL) | 0.25 |
| TSO-LNA (100 μM) | 0.20 |
| Nükleaz içermeyen su | 0.66 |
| Toplam hacim | 6.00 |
Tablo 2: Ters transkriptaz (RT) reaksiyon karışımı.
| mRNA denatürasyonu | ||
| Adım | Sıcaklık | Süre |
| mRNA denatürasyonu | 95 °C | 2 dk |
| buz üzerinde | 2 dk | |
| Ters transkripsiyon | ||
| Adım | Sıcaklık | Süre |
| Ters transkripsiyon | 42 °C | 90 dk |
| Enzim inaktivasyonu | 70 °C | 15 dk |
| 4 °C | tutmak | |
Tablo 3: mRNA denatürasyonu ve ters transkriptaz (RT) için termosikler programı.
| Reaktif | Hacim [μL] /rxn |
| Yüksek kaliteli DNA polimeraz | 12.50 |
| ISPCR astar (10 μM) | 0.15 |
| Nükleaz içermeyen su | 2.35 |
| Toplam hacim | 15.00 |
Tablo 4: Ön amplifikasyon karışımı.
| Adım -ları | Sıcaklık | Süre | |
| İlk denatürasyon | 98 °C | 3 dk | |
| Denatürasyon | 98 °C | 20 saniye | 16 – 18 Döngü |
| Tavlama | 67 °C | 20 saniye | |
| Uzantı | 72 °C | 6 dk | |
| 4 °C | tutmak |
Tablo 5: Ön amplifikasyon termodöngüleyici programı.
| Adım -ları | Sıcaklık | Süre |
| Etiketleme | 55 °C | 8 dk |
| 4 °C | tutmak |
Tablo 6: Etiketleme termosiklatör programı.
| Etiketleme karışımı | |
| Reaktif | Hacim [μL] /rxn |
| Amplikon Etiketleme Karışımı (ATM) | 1.0 |
| Tagment DNA Tamponu (TD) | 2.0 |
| Toplam hacim | 3.0 |
| Zenginleştirme PCR karışımı | |
| Reaktif | Hacim [μL] /rxn |
| Yüksek kaliteli DNA polimeraz | 7.0 |
| Nextera uyumlu indeksleme astarı | 2.0 |
| Toplam hacim | 9.0 |
Tablo 7: Etiketleme karışımı ve zenginleştirme PCR karışımı.
| Adım -ları | Sıcaklık | Süre | |
| Sıcak Başlangıç | 72 °C | 5 dk | |
| İlk denatürasyon | 98 °C | 30 saniye | |
| Denatürasyon | 98 °C | 10 sn | 16 döngü |
| Tavlama | 60 °C | 30 saniye | |
| Uzantı | 72 °C | 1 dk | |
| Son Uzatma | 72 °C | 5 dk | |
| 4 °C | tutmak |
Tablo 8: Zenginleştirme PCR termosikler programı.
| Enstrüman | Yükleme konsantrasyonu |
| MiSeq v2 | Saat 10 |
| SonrakiSıra 500/550 | 1,4 saat |
| NovaSeq 6000 Serisi | 1250 saat |
Tablo 9: Yaygın dizileme aletlerinin yükleme konsantrasyonları için örnekler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İlaç keşfi ve ilaç geliştirme, toplu transkriptomiklerin sağlayabileceği hücresel süreçlerin bütünsel görünümünden büyük ölçüde yararlanabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım genellikle standart toplu RNA-seq protokolü ile yapılan deneyin yüksek maliyeti ile sınırlıdır ve akademik ortamlarda uygulanmasını ve endüstriyel ölçeklenebilirlik potansiyelini yasaklar.
Protokolün en kritik adımları hücre çözme ve kütüphane hazırlığının ilk adımlarıdır. Çözüldükten sonra hücrelerin yüksek canlılığının sağlanması, başarılı tedaviler ve transkriptomik analiz için kritik öneme sahiptir. Hücre toplamanın ilk adımları ve cDNA sentezine kadar kütüphane hazırlığı, RNA'nın bütünlüğünü korumak için kritik öneme sahiptir. Bu aşamada, hücre lizatını her zaman buz üzerinde tutmak ve numuneleri mümkün olduğunca çabuk işlemek çok önemlidir. Aşırı RNA bozunması gözlenirse, herhangi bir RNaz aktivitesini inhibe etmek için laboratuvar yüzeyleri ve ekipmanı belirli ürünlerle temizlenmelidir.
Burada açıklanan protokol şu anda sağlıklı donörlerden alınan PBMC'lerde maksimum 24 saat boyunca ilaç tedavisi için optimize edilmiştir. Deneyi farklı bir hücre tipiyle veya daha uzun inkübasyon süresiyle gerçekleştirmek için, tohumlama ve kültürleme koşulları için hücre sayılarının buna göre optimize edilmesi gerekebilir.
Bu protokol ile PBMC'lerde ilaç tedavisi üzerine transkriptomik analiz için standart laboratuvar ekipmanı kullanılarak ve ticari kitlere ihtiyaç duyulmadan bir iş akışı sağlıyoruz. Bu yaklaşımla ve RNA saflaştırma adımından kaçınarak, çok sayıda bileşiğin paralel analizine izin vererek maliyetleri önemli ölçüde azalttık.
Bu protokol bir in vitro teste dayandığından, en büyük sınırlaması, farklı biyoaktiviteye yol açabilecek ilaçların herhangi bir metabolik işlemini değerlendirememesidir. Ek olarak, yakalanan transkriptlerin sayısı ve dizileme derinliği, standart toplu tam uzunlukta transkriptomik yöntemlerinden daha düşük olacak ve bu verilerin, diferansiyel ekleme veya tek nükleotid polimorfizmlerinin nicelleştirilmesi gibi daha yüksek bilgi içeriği gerektiren uygulamalar için kullanılmasını önleyecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
J.L.S., Alman Araştırma Vakfı (DFG) tarafından Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi (EXC2151-390873048) ve SCHU 950/8-1 kapsamında; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammasyon, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, BMBF tarafından finanse edilen mükemmellik projesi Diyet-Vücut-Beyin (DietBB); ve 733100 hibe numarası altında AB projesi SYSCID. M.B., DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352) tarafından desteklenmektedir. L.B., DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 - Proje numarası 513977171) ve Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi (EXC2151-390873048) tarafından desteklenmektedir. BioRender.com ile oluşturulan görüntüler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
| Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
| Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
| Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
| Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
| Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
| SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
| Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
| Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
References
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L.
- Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery. Front Genet. 11, 19 (2020).
- Bonaguro, L., et al. A guide to systems-level immunomics. Nat Immunol. 23 (10), 1412-1423 (2022).
- Carraro, C., et al. Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state. ELife. 11, 78012 (2022).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- De Domenico, E., et al. Optimized workflow for single-cell transcriptomics on infectious diseases including COVID-19. STAR Protoc. 1 (3), 100233 (2020).
- Dobin, A., et al.
- Patro, R., et al. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Frankish, A., et al. GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).
