Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया आरएनए पूरे माउंट प्रतिदीप्ति में सीटू मच्छर घ्राण उपांगों में रसायन विज्ञान जीन के संकरण

Published: November 17, 2023 doi: 10.3791/65933
Automatic Translation
1, 1
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

लेख मच्छर एंटीना और मैक्सिलरी पैल्प में केमोसेंसरी रिसेप्टर जीन के स्थानिक और सेलुलर रिज़ॉल्यूशन में अंतर्दृष्टि प्रकट करने के लिए स्वस्थानी संकरण संकरण (एचसीआर आरएनए डब्ल्यूएम-फिश) में संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया आरएनए पूरे-माउंट प्रतिदीप्ति करने के लिए आवश्यक तरीकों और अभिकर्मकों का वर्णन करता है।

Abstract

मच्छर घातक बीमारियों के प्रभावी वैक्टर हैं और उनके घ्राण उपांगों में व्यक्त कीमोसेंसरी रिसेप्टर्स का उपयोग करके अपने रासायनिक वातावरण को नेविगेट कर सकते हैं। यह समझना कि परिधीय घ्राण उपांगों में केमोसेंसरी रिसेप्टर्स स्थानिक रूप से कैसे व्यवस्थित होते हैं, मच्छर घ्राण प्रणाली में गंध को कैसे एन्कोड किया जाता है, इस बारे में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं और मच्छर जनित रोगों के प्रसार से निपटने के नए तरीकों को सूचित कर सकते हैं। स्वस्थानी संकरण (एचसीआर आरएनए डब्ल्यूएम-फिश) में तीसरी पीढ़ी के संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया आरएनए पूरे माउंट प्रतिदीप्ति का उद्भव स्थानिक मानचित्रण और कई केमोसेंसरी जीन की एक साथ अभिव्यक्ति रूपरेखा के लिए अनुमति देता है। यहां, हम एनोफिलीज मच्छर एंटीना और मैक्सिलरी पैल्प पर एचसीआर आरएनए डब्ल्यूएम-फिश प्रदर्शन करने के लिए एक चरणबद्ध दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। हमने आयनोट्रोपिक घ्राण रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल की जांच करके इस तकनीक की संवेदनशीलता की जांच की। हमने पूछा कि क्या वर्णित एचसीआर डब्ल्यूएम-फिश तकनीक आरएनए जांच को तीन वर्णक्रमीय रूप से अलग-अलग फ्लोरोफोर्स में टेदर करके मल्टीप्लेक्स अध्ययन के लिए उपयुक्त थी। परिणामों ने सबूत प्रदान किए कि एचसीआर आरएनए डब्ल्यूएम-फिश एंटीना और मैक्सिलरी पैल्प घ्राण उपांगों में एक साथ कई केमोसेंसरी जीन का पता लगाने के लिए मजबूत रूप से संवेदनशील है। आगे की जांच डबल और ट्रिपल आरएनए लक्ष्यों की सह-अभिव्यक्ति रूपरेखा के लिए एचसीआर डब्ल्यूएम-फिश की उपयुक्तता को प्रमाणित करती है। यह तकनीक, जब संशोधनों के साथ लागू की जाती है, तो अन्य कीट प्रजातियों के घ्राण ऊतकों या अन्य उपांगों में रुचि के जीन को स्थानीय बनाने के लिए अनुकूलनीय हो सकती है।

Introduction

एनोफिलिस गैम्बिया जैसे मच्छर वैक्टर एक जटिल रासायनिक दुनिया में पनपने के लिए अपने परिधीय घ्राण उपांगों में व्यक्त कीमोसेंसरी जीन के एक समृद्ध प्रदर्शनों की सूची पर भरोसा करते हैं और मानव मेजबानों से निकलने वाले व्यवहारिक रूप से प्रासंगिक गंधों की पहचान करते हैं, अमृत स्रोतों का पता लगाते हैं, और ओविपोजिशन साइटों का पता लगाते हैं1. मच्छर एंटीना और मैक्सिलरी पल्प कीमोसेंसरी जीन से समृद्ध होते हैं जो इन घ्राण उपांगों में गंध का पता लगाने के लिए ड्राइव करते हैं। लिगैंड-गेटेड आयन चैनलों के तीन मुख्य वर्ग मच्छरों के घ्राण उपांगों में गंध का पता लगाते हैं: गंध रिसेप्टर्स (ओआरएस), जो एक ओब्लिगेट ओडोरेंट रिसेप्टर सह-रिसेप्टर (ओर्को) के साथ कार्य करते हैं; आयनोट्रोपिक रिसेप्टर्स (आईआर), जो एक या अधिक आईआर कोरसेप्टर्स (आईआर 8 ए, आईआर 25 ए और आईआर 76 बी) के साथ बातचीत करते हैं; केमोसेंसरी गस्टेटरी रिसेप्टर्स (जीआर), जो कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2)1,2का पता लगाने के लिए तीन प्रोटीनों के परिसर के रूप में कार्य करते हैं।

स्वस्थानी संकरण में आरएनए प्रतिदीप्ति अंतर्जात एमआरएनए3 की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। सामान्य तौर पर, यह विधि एक लक्ष्य एमआरएनए के अनुक्रम पूरक के साथ एक फ्लोरोफोर-टैग किए गए एकल फंसे हुए न्यूक्लिक एसिड जांच का उपयोग करती है। लक्ष्य आरएनए के लिए फ्लोरोसेंट आरएनए जांच के बंधन ब्याज की एक प्रतिलेख व्यक्त कोशिकाओं की पहचान की अनुमति देता है. हाल की प्रगति अब पूरे माउंट मच्छरऊतकों 4,5 में टेप का पता लगाने में सक्षम है. संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया (एचसीआर) तकनीक की पहली पीढ़ी ने आरएनए-आधारित एचसीआर एम्पलीफायर का उपयोग किया; यह एक दूसरी पीढ़ी की विधि है कि बजाय एचसीआर एम्पलीफायर 6,7 के लिए इंजीनियर डीएनए का इस्तेमाल किया में सुधार किया गया था. इस उन्नयन के परिणामस्वरूप सिग्नल में 10x वृद्धि, उत्पादन लागत में नाटकीय कमी औरअभिकर्मकों के स्थायित्व में महत्वपूर्ण सुधार हुआ।

प्रोटोकॉल में, हम किसी भी जीन 8,9 के स्थानिक स्थानीयकरण और अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए डिज़ाइन की गई स्वस्थानी संकरण (एचसीआर आरएनए डब्ल्यूएम-फिश) विधि में तीसरी पीढ़ी के एचसीआर पूरे-माउंट आरएनए प्रतिदीप्ति के उपयोग का वर्णन करते हैं। यह दो-चरण विधि पहले ब्याज के एमआरएनए के लिए विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड जांच का उपयोग करती है, लेकिन जिसमें एक सर्जक मान्यता अनुक्रम भी होता है; दूसरा चरण फ्लोरोफोरे-टैग किए गए हेयरपिन का उपयोग करता है जो फ्लोरोसेंट सिग्नल (चित्रा 1) को बढ़ाने के लिए सर्जक अनुक्रम से बंधता है। यह विधि दो या दो से अधिक आरएनए जांच के मल्टीप्लेक्सिंग और आरएनए का पता लगाने औरमात्रा का ठहराव 8 की सुविधा के लिए जांच संकेतों को बढ़ाने की भी अनुमति देती है। घ्राण उपांगों में व्यक्त कीमोसेंसरी जीन के प्रतिलेख बहुतायत और आरएनए स्थानीयकरण पैटर्न की कल्पना करना कीमोसेंसरी जीन कार्यों और गंध कोडिंग में अंतर्दृष्टि की पहली पंक्ति प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सामग्री पर विचार और तैयारी

  1. तय करें कि ऊतक का पूरा-माउंट या क्रायो-सेक्शन उपयुक्त होगा या नहीं। यह प्रोटोकॉल क्रायो-सेक्शनिंग के बिना एनोफिलीज मच्छर एंटीना और मैक्सिलरी पैल्प में आरएनए के सीटू इमेजिंग में पूरे-माउंट के लिए अनुकूलित है। यदि नमूने 5 मिमी से अधिक मोटे हैं, तो जांच प्रवेश को सक्षम करने के लिए क्रायो-सेक्शनिंग की सिफारिश की जाती है।
  2. ब्याज के जीन की पहचान करें और एक उपयुक्त डेटाबेस से इंट्रोन्स और एक्सॉन सहित अनुक्रमों की प्रतिलिपि बनाएं। संश्लेषण के लिए जीन अनुक्रम को आरएनए में स्थानांतरित करें।
  3. निर्धारित करें कि वाणिज्यिक विक्रेताओं से जांच खरीदनी है या यदि जांच प्रयोगशाला में संश्लेषित की जाएगी।
    नोट: इस अध्ययन में, स्वस्थानी जांच में एक वाणिज्यिक विक्रेता ( सामग्री की तालिकादेखें) से खरीदा गया था। वैकल्पिक रूप से, इसे पहले रिपोर्ट किए गए10 के रूप में संश्लेषित किया जा सकता है। अध्ययन में प्रयुक्त अभिकर्मकों को तालिका 1में वर्णित किया गया है। अभिकर्मकों को तैयार करने के लिए आवश्यक सामग्री सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं।

2. ऊतक पूर्व निर्धारण

  1. 10-15 वयस्क महिला या पुरुष एनोफिलीज कोलुज़ी मच्छरों (तनाव एन'गौसो), 5-10 दिनों की आयु के बाद, उन्हें एक पेपर कप या प्लास्टिक ट्यूब में मुंह एस्पिरेटर के साथ इकट्ठा करके और उन्हें बर्फ युक्त बाल्टी में रखकर एनेस्थेटाइज करें। एक सफल ठंड से प्रेरित संज्ञाहरण की पुष्टि की जा सकती है जब मच्छर स्थिर होते हैं।
  2. संदंश की एक जोड़ी के साथ गर्दन क्षेत्र से सिर को हटाने के द्वारा उन्हें सिर काटना. गैर प्रमुख हाथ का उपयोग संदंश के साथ वक्ष हड़पने और प्रमुख हाथ से आयोजित संदंश के साथ शरीर से गर्दन को अलग. बर्फ पर चिटिनेज-काइमोट्रिप्सिन डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड बफर (सीसीडी बफर) के 500 माइक्रोन युक्त 1.5 एमएल ट्यूब में सिर रखें।
    नोट: फ्रीजिंग जानवर एंटीना को ख़राब कर सकते हैं; बर्फ पर एक त्वरित दस्तक की सिफारिश की जाती है। परीक्षण के दौरान मच्छर की उम्र परियोजना के आधार पर भिन्न हो सकती है। उनकी शारीरिक स्थिति की पुष्टि और समन्वय करना महत्वपूर्ण है, जैसे कि वे रक्त-खिलाए गए, भूखे या संभोग किए गए हैं। इस अध्ययन में, घ्राण उपांगों को मच्छरों से नमूना लिया गया था जिन्हें रक्त-खिलाया और संभोग किया गया था।
  3. 5 मिनट के लिए एक गर्मी ब्लॉक पर 37 डिग्री सेल्सियस पर सीसीडी बफर में पूर्व गर्मी मच्छर सिर और फिर एक संकरण ओवन के लिए मच्छर सिर युक्त ट्यूब हस्तांतरण और 37 डिग्री सेल्सियस पर बारी बारी से सीसीडी बफर में इनक्यूबेशन समय ऊतक प्रकार पर निर्भर करता है. महिला एनोफिलीज एंटीना के लिए, 20 मिनट का उपयोग करें, पुरुष एंटीना को 15 मिनट की आवश्यकता होती है, जबकि मैक्सिलरी पैल्प्स के लिए लंबे समय इनक्यूबेशन (1 एच) की आवश्यकता होती है।
  4. ट्यूब की पूरी सामग्री को एक विदारक घड़ी ग्लास में स्थानांतरित करें। धीरे एक घड़ी (विच्छेदन) कांच के अवसाद में नमूना डालना. यदि मच्छर सिर ट्यूब के अंदर फंस गए हैं, तो ट्यूब में सीसीडी बफर जोड़ने और सिर को कुल्लाने के लिए एक विंदुक का उपयोग करें।
  5. ध्यान से सिर या किसी भी एंटीना / palps इनक्यूबेशन के दौरान अलग हस्तांतरण और पूर्व लगानेवाला के 1 एमएल में तय करने के लिए संदंश का प्रयोग करें.
    नोट: बचे हुए सीसीडी बफर को -20 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित किया जा सकता है। यदि ऊतकों द्वारा सीसीडी बफर कैरीओवर के कारण पूर्व-निरोधक थोड़ा भूरा हो जाता है, तो इसे एक और 1 एमएल लगानेवाला के साथ बदलें।
  6. एक nutator का उपयोग कर 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए पूर्व लगानेवाला में सिर घुमाएँ.
    नोट: इस अध्ययन में प्रयुक्त न्यूटेटर के लिए रॉकिंग गति गैर-समायोज्य थी; निर्माता द्वारा डिफ़ॉल्ट गति सेट (12 आरपीएम) का उपयोग किया गया था।

3. ऊतक विच्छेदन

  1. बर्फ पर 0.1% पीबीएस-ट्विन के 1 एमएल के साथ सिर 4x (5 मिनट प्रति धुने) कुल्ला। नमूना हानि से बचने के लिए, तरल को हटाने के लिए जेल लोडिंग टिप से जुड़े एक विंदुक का उपयोग करें।
    नोट: दो त्वरित washes एक 10 मिनट लंबे धोने के द्वारा पीछा किया, और एक अंतिम त्वरित धोने कदम 3.1 के बजाय किया जा सकता है.
  2. ट्यूब में सिर को एक विदारक घड़ी ग्लास में स्थानांतरित करें। धीरे से एक घड़ी के गिलास के अवसाद में नमूना डालना। 0.1% पीबीएस-ट्वीन के साथ ट्यूब के अंदर फंसे मच्छर के सिर को कुल्ला।
  3. एक विदारक खुर्दबीन के तहत, तेज संदंश के साथ सिर से ब्याज (एंटीना / palps) के ऊतकों को हटा दें. संदंश के साथ सिर के पीछे भाग पकड़ो और आधार से एक और संदंश के साथ एक एंटीना हड़पने. कागज शाही सेना मुक्त विलायक के साथ सिक्त के साथ साफ संदंश. इसी प्रक्रिया का उपयोग करके हथेलियों को हटा दें।
  4. एंटीना और palps खाली डीएनए / बर्फ पर रखा RNase मुक्त ट्यूबों में संदंश के साथ स्थानांतरण. पूर्व लेबल अलग ट्यूबों में विभिन्न ऊतक भागों को अलग.
  5. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मेथनॉल (MeOH 80%) और डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (DMSO 20%) के मिश्रण वाले विलायक के 400 μL में निर्जलीकरण ऊतक।
    नोट: एक nutator पर ऊतक जगह करने के लिए कोई जरूरत नहीं है; इसे लैब बेंच पर कमरे के तापमान पर ट्यूब रैक पर बैठने दें। ताजा विलायक मिश्रण का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। 500 माइक्रोन स्टॉक समाधान के लिए, डीएमएसओ के 100 माइक्रोन के साथ MeOH के 400 माइक्रोन मिलाएं।
  6. निर्जलीकरण अभिकर्मक को निरपेक्ष (100%) मेथनॉल के 400 माइक्रोन के साथ बदलें और -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर निर्जलीकरण ऊतकों को निर्जलित करें। ऊतकों को गुरुत्वाकर्षण द्वारा व्यवस्थित करने की अनुमति दें और तरल को हटाने के लिए एक विंदुक का उपयोग करें।
    नोट: नमूने निर्जलीकरण की विस्तारित अवधि के लिए व्यवहार्य हैं, सिग्नल के नुकसान के बिना 4 रातों तक परीक्षण किया गया है।

4. ऊतक पोस्ट-निर्धारण

  1. बर्फ पर 10 मिनट के लिए वर्गीकृत 400 μL MeOH/PBS-Tween की एक चार कदम श्रृंखला में पुनर्जलीकरण ऊतकों. 75% MeOH/25% PBS-Tween से शुरू करें और उसके बाद 50% MeOH/50% PBS-Tween, फिर 25% MeOH/75% PBS-Tween और अंत में 100% PBS-Tween।
    नोट: ऊतकों को खोने से बचने के लिए ट्यूब से बफर को हटाने के लिए एक छोटे से उद्घाटन के साथ एक जेल लोडिंग टिप का उपयोग किया जा सकता है। बफर हटाने एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत किया जा सकता है.
  2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 0.1% ट्वीन-20 (पीबीएस-टी) युक्त फॉस्फेट-बफर खारा के 400 माइक्रोन के साथ धोएं। एक nutator पर नमूना रखकर धो लें.
  3. एक 20 माइक्रोग्राम / एमएल प्रोटीनेज-के समाधान बनाएं और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्रोटीनेज-के समाधान के 400 माइक्रोन में इनक्यूबेट करें।
    नोट: 20 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीनेज-के स्टॉक (1000x स्टॉक समाधान) यानी, 0.1% पीबीएस-ट्वीन के 2 एमएल में 2 माइक्रोन पतला करें। बचे हुए को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. 0.1% पीबीएस-ट्वीन के 400 माइक्रोन के साथ 10 मिन के लिए 2x धोकर ऊतक के एंजाइमेटिक पाचन को रोकें।
  5. पोस्ट-फिक्सेटिव के 400 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान पर 20 मिन के लिए इनक्यूबेट करें। 0.1% पीबीएस-ट्वीन के 400 माइक्रोन के साथ 3x, 15 मिनट प्रति वॉश धोएं।

5. जांच संकरण

  1. 5 मिन के लिए जांच संकरण बफर के 400 माइक्रोन में ऊतक सेते हैं। सुनिश्चित करें कि ऊतक पूरी तरह से धीरे pipetting द्वारा बफर में डूबा हुआ है.
  2. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस जांच संकरण बफर के एक विभाज्य हीटिंग द्वारा अगले कदम के लिए तैयार करें.
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पूर्व गर्म जांच संकरण बफर के 400 माइक्रोन के साथ बफर और पूर्व संकरण निकालें।
  4. जांच के 8 पीएम जोड़कर लक्ष्य chemosensory रिसेप्टर्स (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a या Orco) के लिए जांच समाधान बनाओ. 500 माइक्रोन पूर्व गर्म जांच संकरण बफर करने के लिए 1 माइक्रोन जांच स्टॉक के 8 माइक्रोन जोड़ें।
  5. पूर्व-गर्म जांच संकरण बफर निकालें और इसे गर्म जांच समाधान के 400 माइक्रोन के साथ बदलें।
  6. एक इनक्यूबेटर के अंदर रखा एक nutator पर दो रातों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक सेते हैं और एक बॉक्स के नीचे कवर किया.

6. जांच प्रवर्धन

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर जांच धोने बफर के 400 माइक्रोन के साथ, 37 डिग्री सेल्सियस पर जांच धोने बफर के 400 माइक्रोन के साथ, धोने प्रति ऊतक rinsing द्वारा अतिरिक्त जांच समाधान निकालें, इनक्यूबेटर में nutating.
    नोट: चरण 6.4 के लिए तैयारी शुरू हो सकता है. चरण 6.4 में नोट देखें।
  2. कमरे के तापमान पर 10% ट्वीन-20 (एसएससीटी) युक्त 5x खारा-सोडियम साइट्रेट के 400 माइक्रोन के साथ 2x, 5 मिनट प्रति वॉश नमूने धो लें। एक बेंच टॉप पर कमरे के तापमान पर पिघलना प्रवर्धन बफर।
  3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए प्रवर्धन बफर के 400 माइक्रोन के साथ ऊष्मायन द्वारा प्रवर्धन के लिए ऊतक तैयार करें। प्रवर्धन बफर की चिपचिपाहट के कारण, ऊतक पूरी तरह से जलमग्न नहीं हो सकते हैं। धीरे ऊतक के नीचे प्रवर्धन बफर pipetting और ऊतक के शीर्ष पर बफर निष्कासित जब तक वे जलमग्न कर रहे हैं द्वारा मिश्रण.
  4. अलग से हेयरपिन एच 1 के 18 पीएम और हेयरपिन एच 2 के 18 पीएम को 90 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 3 माइक्रोन स्टॉक के 6 माइक्रोन को गर्म करके और 30 मिनट के लिए एक अंधेरे दराज में कमरे के तापमान को ठंडा करके तैयार करें। सुनिश्चित करें कि थर्मल साइक्लर में गर्म करते समय हेयरपिन के वाष्पीकरण को रोकने के लिए पीसीआर ट्यूबों को कसकर कैप किया गया है।
    नोट: समय बचाने के लिए, चरण 6.1 में 4वें धोने के चरण पर चरण 6.4 शुरू किया जा सकता है। क्रॉस रिएक्शन को रोकने के लिए हेयरपिन को अलग से गर्म किया जाना चाहिए। इस चरण में हेयरपिन को किसी भी बफर से पतला नहीं किया जाना चाहिए। हेयरपिन को जांच के साथ जांच निर्माता से खरीदा जा सकता है।
  5. चरण 6.3 में जोड़े गए प्रवर्धन बफर को गर्म हेयरपिन (चरण 6.4 से) वाले मिश्रण के साथ 100 माइक्रोन प्रवर्धन बफर के साथ बदलें। एक विशिष्ट प्रतिक्रिया में h1 का 6 μL, h2 का 6 μL और प्रवर्धन बफर का 100 μL होगा।
    नोट: हेयरपिन एच 1 और एच 2 को कमरे के तापमान पर ठंडा करने के बाद जोड़ा जा सकता है और फिर प्रवर्धन बफर के 100 माइक्रोन में जोड़ा जा सकता है। ऊतक के नमूनों को एक ट्यूब से दूसरे ट्यूब में स्थानांतरित करने से बचने के लिए, चरण 6.3 में प्रवर्धन बफर को हटाया जा सकता है और प्रवर्धन बफर में पतला हेयरपिन मिश्रण द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  6. ऊतक रातोंरात सेते हैं और nutator की डिफ़ॉल्ट गति का उपयोग कर कमरे के तापमान पर अंधेरे में nutate.

7. बढ़ते ऊतक का नमूना

  1. 5x SSCT के 300 μL (ट्वीन -20 में पतला सोडियम क्लोराइड-सोडियम साइट्रेट) के साथ इनक्यूबेटेड ऊतक में प्रवर्धन बफर को पतला करें।
    नोट: कमजोर पड़ने चिपचिपाहट को कम करने के लिए सहायक है और ऊतक से प्रवर्धन बफर को हटाने के लिए आसान बनाता है। हमने प्री-फिक्सेटिव के लिए ट्राइटन-एक्स 100 और पोस्ट-फिक्सेटिव स्टेप के लिए ट्वीन-20 का इस्तेमाल किया क्योंकि सेल झिल्ली को पार करने के लिए एजेंटों के रूप में उनके कार्यों में अंतर था।
  2. कमरे के तापमान पर 5x SSCT के 400 μL के साथ ऊतक 5x धोएं।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो घुड़सवार होने के लिए तैयार होने तक अस्थायी रूप से 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक स्टोर करें। हम इमेजिंग से पहले 2 दिन से अधिक नहीं हैं।
  3. एक गिलास स्लाइड पर बढ़ते समाधान के 5 बूंदों बनाओ. इसे व्यापक बनाने के लिए एक 200 माइक्रोन विंदुक टिप की नोक काटें और ऊतक को एक नई ग्लास स्लाइड में स्थानांतरित करें।
  4. संदंश के साथ अपने आधार से ऊतक के नमूनों को पकड़ो और धीरे विसर्जित और बढ़ते समाधान बूंदों की एक श्रृंखला में कुल्ला. सावधान रहें कि इस चरण में ऊतकों को न तोड़ें।
  5. बढ़ते समाधान के साथ माउंट करें, जगह coverslip, और नेल पॉलिश के साथ सील। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सीटू ऊतक के नमूनों में छवि।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एनोफिलीज एंटीना में केमोसेंसरी जीन का मजबूत पता लगाना
हमने मच्छर घ्राण ऊतकों में कीमोसेंसरी रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एचसीआर फिश विधि (चित्रा 1) की संवेदनशीलता की जांच की। मादा एनोफिलीज मच्छर एंटीना पर पहले रिपोर्ट किए गए आरएनए प्रतिलेख डेटा द्वारा निर्देशित, हमने विभिन्न प्रकार के आईआर को लक्षित करने के लिए जांच उत्पन्न की। चार स्वतंत्र antennal प्रतिलेख अध्ययनों से औसत प्रतिलेख मूल्यों से पता चला है कि Ir41t.1 (11 RPKM), Ir75d (12 RPKM), और Ir7t (13 RPKM) सह रिसेप्टर्स Ir25a (197 RPKM) और Ir76b (193 RPKM) 5,11,12,13,14 की तुलना में एंटीना में कम प्रचुर मात्रा में थे. हमने Ir41t.1, Ir75d और Ir7t को लक्षित करने के लिए जांच उत्पन्न की। IR64a (31 RPKM) को भी लक्षित किया गया था, क्योंकि इसका प्रतिलेख स्तर ब्याज के उम्मीदवार जीन के बीच सबसे कम प्रतिलेख मूल्य से लगभग 3x अधिक प्रचुर मात्रा में है। यहां यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ट्रांसक्रिप्टोमिक्स अध्ययन से आरपीकेएम मान पूरे एंटीना से टेप के थोक माप का प्रतिनिधित्व करते हैं। जैसे, यह हो सकता है कि केवल कुछ न्यूरॉन्स एक आईआर जीन प्रतिलेख को अत्यधिक व्यक्त करते हैं, या यह हो सकता है कि एक आईआर जीन कई कोशिकाओं में कम व्यक्त किया गया हो। इसलिए आरपीकेएम मान जरूरी नहीं कि एक न्यूरॉन के भीतर आईआर के बहुतायत स्तर के अनुरूप हो। इसके अलावा, एचसीआर विधि द्वारा वहन किए गए सिग्नल प्रवर्धन भी फ्लोरोसेंट संकेतों के आधार पर न्यूरोनल ट्रांसक्रिप्ट स्तरों को सटीक रूप से मापने के लिए इस पद्धति का उपयोग करना मुश्किल बना सकता है। हमारे हाल के प्रकाशन ने इन अवधारणाओं पर अधिक विस्तार से चर्चाकी 5. डेटा से पता चलता है कि एचसीआर डब्ल्यूएम-फिश एंटेनल ऊतकों से एमआरएनए टेप का पता लगाने के लिए अत्यधिक संवेदनशील है जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है।

कीमोसेंसरी उपांगों में विभिन्न आरएनए लक्ष्यों के बहु-लेबलिंग
आरएनए लक्ष्यों के सह-स्थानीयकरण की जांच करने के लिए, हमने विभिन्न फ्लोरोफोर्स के लिए संयुग्मित जांच उत्पन्न की। गंध रिसेप्टर सह-रिसेप्टर जीन (ओर्को) के प्रतिलेखों को लक्षित करने वाले सीटू संकरण में डबल और सबसे व्यापक रूप से व्यक्त आयनोट्रोपिक रिसेप्टर सह-रिसेप्टर जीन (आईआर 25 ए) ने एंटीना (चित्रा 3ए) और मैक्सिलरी पैल्प(चित्रा 3बी)में सेल आबादी के सबसेट में इन विशिष्ट केमोसेंसरी रिसेप्टर परिवारों के सहस्थानीयकरण का खुलासा किया। हमने तीन IR-coreceptor जीन (Ir8a, Ir25a, और Ir76b) के प्रतिलेखों के सहस्थानीयकरण की भी जांच की। सहस्थानीयकरण पैटर्न से पता चलता है कि Ir76b-पॉजिटिव कोशिकाएं Ir25a को व्यक्त करती हैं, जबकि Ir8a-पॉजिटिव कोशिकाएं आंशिक रूप से Ir76b और Ir25a(चित्र 4)के साथ सह-स्थानीयकरण करती हैं। आईआर-कोरसेप्टर्स का सह-अभिव्यक्ति विश्लेषण मल्टीप्लेक्स अध्ययनों के लिए एचसीआर डब्ल्यूएम-फिश का उपयोग करने की मजबूती को प्रदर्शित करता है।

Figure 1
चित्रा 1: स्वस्थानी संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया में योजनाबद्ध। यह विधि दो चरणों में काम करती है: पता लगाना और प्रवर्धन। स्वस्थानी संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया में के लिए एक जांच सेट एक विभाजन सर्जक और आरएनए लक्ष्य के लिए विशिष्ट एक न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम शामिल है. जांच सेट के कई जोड़े आरएनए लक्ष्य में कई क्षेत्रों को संकरण करने के लिए डिज़ाइन किए जा सकते हैं; यह पता लगाने के चरण को परिभाषित करता है। प्रवर्धन कदम फ्लोरोफोर-टैग हेयरपिन (एच 1 और एच 2) की आवश्यकता होती है जो विशेष रूप से एक जांच सेट के लिए संयुग्मित सर्जक को बांधने के लिए होती है। बंधन पर, फ्लोरोफोर द्वारा लेबल किए गए आरएनए सिग्नल को फ्लोरोफोरे-टैग किए गए हेयरपिन के बार-बार बंधन द्वारा बढ़ाया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: आईआर केमोसेंसरी जीन का आरएनए स्थानीयकरण। आईआर को लक्षित करने के लिए मादा एनोफिलीज कोलुज़ी एंटीना की एचसीआर डब्ल्यूएम-फिश। आरएनए जांच में (ए) आईआर 41 टी .1, (बी) आईआर 75 डी, (सी) आईआर 7 टी, और (डी) आईआर 64 ए शामिल हैं। सफेद धराशायी बक्से में इनसेट ऊतक से आवर्धित चित्र हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एंटीना और मैक्सिलरी पैल्प में केमोसेंसरी जीन के सीटू सह-स्थानीयकरण में डबल। (ए) एंटीना और (बी) मादा एनोफिलिस कोलुज़ी मच्छरों के मैक्सिलरी पल्प में Ir25a (हरा) और Orco (मैजेंटा) व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की Confocal Z-स्टैक छवियां। सफेद धराशायी बक्से में इनसेट ऊतक से आवर्धित चित्र हैं। पैमाना 10 माइक्रोन है। चित्रा 3 बी 15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: कई आरएनए लक्ष्यों के स्थानिक सहस्थानीयकरण मानचित्रण। मच्छर एंटीना में तीन IR coreceptors, IR25a (मैजेंटा), IR8a (हरा), और IR76b (नीला) के colocalization पैटर्न दिखा स्वस्थानीकरण छवियों में. सफेद तीर उन कोशिकाओं को इंगित करते हैं जो तीन IR कोरसेप्टर्स (IR25a, IR8a, और IR76b) को व्यक्त करती हैं। पैमाना 20 माइक्रोन है। इस आंकड़े को5 से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: स्वस्थानी संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया में के लिए अभिकर्मक। अभिकर्मकों को स्वस्थानी संकरण में संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया पूरे-माउंट फ्लोरोसेंट प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया (एचसीआर) की तीसरी पीढ़ी कई आरएनए लक्ष्य8 कल्पना करने के लिए अपनी संवेदनशीलता और मजबूती के लिए उल्लेखनीय है. एचसीआर डब्लूएम-फिश का ड्रोसोफिला, चिकन, चूहों और जेब्राफिश के भ्रूण के साथ-साथ नेमाटोड और जेब्राफिश10,16,17के लार्वा पर सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। मच्छर एंटीना और मैक्सिलरी पल्प्स आमतौर पर उच्च ऑटोफ्लोरेसेंस और कमजोर जांच पैठ से ग्रस्त होते हैं जो सीटू विधियों में पारंपरिक पूरे-माउंट का संचालन करते समय विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण होते हैं। इन कमियों को एचसीआर प्रोटोकॉल में एकीकृत सिग्नल प्रवर्धन कदम से कम किया गया है जो सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात में सुधार करता है और घ्राण केमोरिसेप्टर एमआरएनए टेप(चित्रा 2)का पता लगाने की अनुमति देता है। एचसीआर प्रोटोकॉल डिजाइन यह सुनिश्चित करता है कि प्रारंभिक जांच प्रवर्धन पॉलिमर से जुड़ी हुई है जो कम सिग्नल के साथ इमेजिंग आरएनए लक्ष्यों की अनुमति देता है। मल्टीप्लेक्स सेट-अप में, विभिन्न ऑर्थोगोनल एचसीआर एम्पलीफायरों को वर्णक्रमीय रूप से अद्वितीय फ्लोरोफोर्स से जोड़ा गया था। यह दृष्टिकोण एक पड़ोसी इमेजिंग चैनल से वर्णक्रमीय खून बह रहा से बचने के लिए महत्वपूर्ण था.

मच्छर उपांगों के साथ उपयोग के लिए एचसीआर विधि को अनुकूलित करने के लिए, हमने कई अवलोकन किए। एचसीआर एम्पलीफायरों प्रकाश संवेदनशील होते हैं और उन्हें हमेशा -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक बॉक्स में संग्रहित किया जाना चाहिए। हमारे अनुभव में, सीसीडी बफर, प्रोटीनेज के, या पैराफॉर्मलडिहाइड में लघु निर्धारण समय में ऊतकों की व्यापक इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप धोने के चरणों के दौरान एंटीना या तालु का टूटना हो सकता है। टूटने से बचने के लिए एंटीना और मैक्सिलरी पल्प्स को भी हमेशा आधार से पकड़ना चाहिए। इस प्रोटोकॉल को अपनाने के प्रारंभिक चरण में, हमने बफर एक्सचेंजों (चरण 5 और 6) की श्रृंखला के दौरान लगातार ऊतकों को खो दिया। इस तरह के नुकसान को कम करने के लिए, ऊतकों की संख्या प्रयोग की शुरुआत में दोगुनी हो गई, धोने कदम और बफर एक्सचेंजों खुर्दबीन के तहत प्रदर्शन किया गया, और जेल लोड हो रहा है युक्तियाँ कोई 0.5 मिमी से व्यापक ऊतकों से बफ़र्स को हटाने के लिए इस्तेमाल किया गया.

एचसीआर डब्लूएम-फिश एनोफिलिस गैम्बिया 5,15 और एडीस एजिप्टी 4,18 मच्छर वैक्टर के परिधीय घ्राण उपांगों में सफल रहा है, और प्रोटोकॉल को अन्य कीट ऊतक भागों या विभिन्न जानवरों के लिए अनुकूलित और अनुकूलित किया जा सकता है। निर्माता द्वारा डिज़ाइन किया गया मूल प्रोटोकॉल सीसीडी बफर में इनक्यूबेशन शामिल नहीं करता है। इस कदम को चिटिनस छल्ली को पचाने और अनुमति देने के लिए प्रोटोकॉल में एकीकृत किया गया था। हमने जांच प्रवेश के लिए अधिक समय देने के लिए दो रातों के लिए जांच सेट में इनक्यूबेशन समय बढ़ाया, निर्माता के प्रोटोकॉल का एक संशोधन जो 16 घंटे इनक्यूबेशन समय की सिफारिश करता है जो स्लाइड पर जेनेरिक नमूनों के लिए अच्छी तरह से काम करता है। अन्य कीट ऊतक भागों के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूलन सीसीडी बफर में इनक्यूबेशन समय अलग की आवश्यकता होगी; मोटी छल्ली के साथ परिधीय ऊतक भागों की संभावना विस्तारित इनक्यूबेशन समय की आवश्यकता होगी. प्रोटीन कश्मीर की एकाग्रता भी प्रयोगात्मक समायोजित किया जाना चाहिए, जबकि जानवरों के विभिन्न ऊतक या विकास चरणों के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलन. 5 मिमी से अधिक मोटे ऊतकों के साथ काम करते समय, जांच पैठ एक चुनौती बन जाती है। ऐसी स्थिति में, ऊतक क्रायोसेक्शन करने या इस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल को और बदलने के लिए अतिरिक्त प्रयासों की आवश्यकता है।

एचसीआर डब्लूएम-फिश एक साथ स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स की तुलना में एक समय में केवल कुछ जीन लक्ष्यों की कल्पना करने तक सीमित है जो संभवतः हजारों जीन19 की एक साथ इमेजिंग की अनुमति दे सकता है। आरएनए जांच का वाणिज्यिक संश्लेषण महंगा है; विकल्प प्रयोगशाला में जांच और एम्पलीफायरों का उत्पादन करना होगा, लेकिन यह अधिकांश समूहों के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है और श्रम-गहन और समय लेने वाला है। यह प्रोटोकॉल पूरे माउंट मोटी नमूनों के माध्यम से आरएनए जांच प्रवेश द्वारा सामना की जाने वाली कठिनाइयों से भी सीमित है, जिसे प्रोटोकॉल (जैसे, चरण 2 ऊतक तैयारी) या बरकरार ऊतक के सेक्शनिंग में विकल्प की आवश्यकता हो सकती है। यदि यहां वर्णित एचसीआर डब्लूएम-फिश विधि घ्राण उपांग में आरएनए प्रतिलेख का पता लगाने में विफल रहती है, तो जीन को केवल कुछ कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है और ऊतक के व्यापक सर्वेक्षण की आवश्यकता होती है, संभवतः लिखित नहीं होता है, या इस विधि की पहचान सीमा से नीचे के स्तर पर स्थानांतरित किया जा सकता है। ऐसे निष्कर्षों को मान्य करने के लिए मात्रात्मक आरटी-पीसीआर या आरएनए सीक्यू का प्रदर्शन किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम मार्गो हेरे और लेस्ली वोशाल लैब को एडीस aegypti घ्राण उपांगों के लिए अपने इन-सीटू संकरण प्रोटोकॉल को साझा करने के लिए धन्यवाद देते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से C.J.P. (NIAID R01Al137078), JIR को HHMI हन्ना ग्रे फैलोशिप, JIR को जॉन्स हॉपकिन्स पोस्टडॉक्टोरल एक्सेलेरेटर अवार्ड और JIR को जॉन्स हॉपकिन्स मलेरिया रिसर्च इंस्टीट्यूट पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम जॉन्स हॉपकिन्स मलेरिया रिसर्च इंस्टीट्यूट और ब्लूमबर्ग परोपकार को उनके समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplification buffer Molecular Instruments Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence 50 mL
Calcium Chloride (CaCl2) 1M  Sigma-Aldrich  21115-100ML
Chitinase Sigma-Aldrich C6137-50UN
Chymotrypsin Sigma-Aldrich CHY5S-10VL 
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 472301
Eppendorf tube VWR 20901-551 1.5 mL
Forceps Dumont 11251 Number 5
Gel loading tip Costar 4853 1-200 µL tip
Hairpins  Molecular Instruments Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence h1 and h2 initiator splits
HEPES (1M) Sigma-Aldrich H0887
IR25a probe Molecular Instruments Probe Set ID: PRK149  AGAP010272
IR41t.1 probe Molecular Instruments  Probe Set ID: PRK978 AGAP004432
IR64a probe Molecular Instruments Probe Set ID: PRK700  AGAP004923
IR75d probe Molecular Instruments Probe Set ID: PRK976 AGAP004969
IR76b probe Molecular Instruments Probe Set ID: PRI998 AGAP011968
IR7t probe Molecular Instruments Probe Set ID: PRL355 AGAP002763
IR8a probe Molecular Instruments Probe Set ID: PRK150 AGAP010411
LoBind Tubes VWR 80077-236 0.5 mL DNA/RNA LoBind Tubes
Magnessium Chloride (MgCl2) 1M Thermo Fisher AM9530G
Methanol Fisher  A412-500
Nuclease-free water Thermo Fisher 43-879-36
Nutator Denville Scientific Model 135 3-D Mini rocker
Orco probe Molecular Instruments Probe set ID PRD954 AGAP002560
Paraformaldehyde (20% ) Electron Microscopy Services  15713-S
Phosphate Buffered Saline (10X PBS) Thermo Fisher AM9625
Probe hybridization buffer Molecular Instruments https://www.molecularinstruments.com/ 50 mL
Probe wash buffer Molecular Instruments Molecular Instruments, Inc. | In Situ Hybridization + Immunofluorescence 100 mL
Proteinase-K Thermo Fisher AM2548
Saline-Sodium Citrate (SSC) 20x  Thermo Fisher 15-557-044
SlowFade Diamond Thermo Fisher  S36972 mounting solution
Sodium Chloride (NaCl) 5M Invitrogen AM9760G
Triton X-100  (10%) Sigma-Aldrich  93443
Tween-20 (10% ) Teknova T0027
Watch glass Carolina 742300  1 5/8" square; transparent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Konopka, J. K., et al. Olfaction in Anopheles mosquitoes. Chem Senses. 46, (2021).
  2. Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967 (2022).
  3. Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806 (2020).
  4. Herre, M., et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 185 (17), 3104-3123.e28 (2022).
  5. Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito. Cell Rep. 42 (2), 112101 (2023).
  6. Choi, H. M. T., et al. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).
  7. Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  8. Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), dev165753 (2018).
  9. Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), dev199847 (2021).
  10. Choi, H. M. T., et al. Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression. Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).
  11. Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids. Sci Rep. 7, 40297 (2017).
  12. Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae. BMC Genomics. 14, 749 (2013).
  13. Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep. 38 (10), 110494 (2022).
  14. Athrey, G., et al. Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus. BMC Genomics. 18 (1), 751 (2017).
  15. Task, D., et al. Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons. eLife. 11, e72599 (2022).
  16. Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
  17. Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos. Development. 145 (1), dev156869 (2018).
  18. Herre, M., Greppi, C. RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).
  19. Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).

Tags

इस महीने में JoVE अंक 201
संकरण श्रृंखला प्रतिक्रिया आरएनए पूरे माउंट प्रतिदीप्ति <em>में सीटू</em> मच्छर घ्राण उपांगों में रसायन विज्ञान जीन के संकरण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raji, J. I., Potter, C. J.… More

Raji, J. I., Potter, C. J. Hybridization Chain Reaction RNA Whole-Mount Fluorescence In situ Hybridization of Chemosensory Genes in Mosquito Olfactory Appendages. J. Vis. Exp. (201), e65933, doi:10.3791/65933 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter