Summary
この記事では、エラスムスラダーと呼ばれるデバイスを使用して、微細運動能力の非侵襲的で自動化された評価と、課題に対する適応的および連想的運動学習を可能にするプロトコルを紹介します。タスクの難易度を滴定して、重大な程度から微妙な程度までの運動障害を検出できます。
Abstract
行動は行動によって形作られ、行動には強さ、協調性、学習などの運動能力が必要です。生命を維持するために不可欠な行動は、ある位置から別の位置に移行する能力なしには不可能です。残念ながら、運動能力はさまざまな病気で損なわれる可能性があります。そのため、運動機能のメカニズムを細胞・分子・回路レベルで調べ、運動障害の症状や原因、進行を理解することは、効果的な治療法の開発に欠かせません。この目的のために、マウスモデルが頻繁に使用されます。
本稿では、エラスムス・ラダーと呼ばれる自動化ツールを用いて、マウスの運動能力と学習のさまざまな側面をモニタリングできるプロトコルについて述べる。このアッセイには、不規則な横木で作られた水平のはしごをマウスが移動するように訓練する初期段階(「微細運動学習」)と、移動する動物の経路に障害物を提示する第2段階の2つの段階があります。摂動は、予期せぬ場合(「運動学習の挑戦」)の場合もあれば、聴覚的な緊張が先行する(「連想運動学習」)場合もあります。このタスクは簡単に実行でき、自動化されたソフトウェアによって完全にサポートされています。
このレポートは、テストからのさまざまな読み取り値を、感度の高い統計的手法で分析した場合に、マウスの小さなコホートを使用してマウスの運動能力を詳細に監視できることを示しています。本手法は、運動機能が損なわれた変異マウスにおいて、環境変化による運動適応や初期段階の微妙な運動障害を高感度に評価することを提案します。
Introduction
マウスの運動表現型を評価するために、さまざまなテストが開発されています。各テストは、運動行動の特定の側面に関する情報を提供します1.たとえば、オープンフィールドテストは、一般的な移動運動と不安状態について通知します。ロータロッドとウォーキングビームは、協調性とバランスに関するテストを行います。フットプリント分析は歩行に関するものです。強制的または自発的な身体運動中のトレッドミルまたはランニングホイール。そして、複雑なホイールは運動能力の学習に関するものです。マウスの運動表現型を分析するには、研究者はこれらのテストを順番に実行する必要があり、これには多くの時間と労力がかかり、多くの場合、複数の動物コホートが含まれます。細胞レベルまたは回路レベルで情報がある場合、調査員は通常、関連する側面を監視し、そこから追跡するテストを選択します。しかし、運動行動のさまざまな側面を自動化された方法で識別するパラダイムが不足しています。
本稿では、マウスの様々な運動学習機能を包括的に評価できるシステムであるエラスムス・ラダー2,3を使用するためのプロトコルについて述べる。主な利点は、この方法の再現性と感度、および運動障害を滴定し、運動能力の障害を連想運動学習の障害から分離する能力です。主なコンポーネントは、はしご上のマウスの位置を検出するタッチセンサーを備えた高段(H)と低段(L)が交互に並ぶ水平のはしごで構成されています。はしごは2 x 37段(L、6 mm;H、12 mm)を互いに15 mm間隔で配置し、30 mmの間隔を空けて左右に交互に配置します(図1A)。横木を個別に動かして、さまざまなレベルの難易度を生成する、つまり障害物を作成できます (高い横木を 18 mm 上げます)。エラスムスラダーは、自動記録システムとラングパターンの変更を感覚刺激と関連付けることで、環境上の課題(障害物をシミュレートするためのより高いラングの出現、無条件刺激[US])または感覚刺激との関連(トーン、条件刺激[CS])に応答して、微細な運動学習と運動能力の適応をテストします。試験には2つの異なる段階があり、それぞれが4日間の運動能力の改善を評価し、その間、マウスは1日あたり42回の連続した試験を受けます。初期段階では、マウスはしごをナビゲートして「細かい」または「熟練した」運動学習を評価するように訓練されます。第2段階は、移動する動物の進路により高い段の形の障害物が提示されるインターリーブ試験で構成されています。摂動は、「障害のある」運動学習を評価するために予期せぬものであったり(米国のみの試験)、または「連想的」運動学習を評価するために聴覚音によって発表されたり(対応のある試験)である。
エラスムスの梯子は比較的最近開発された2,3。プロトコルの設定と最適化には集中的な努力が必要であり、他の運動障害を明らかにする可能性を詳細に調査することなく、小脳依存の連想学習を評価するように特別に設計されているため、広くは使用されていませんでした。現在までに、マウス3,4,5,6,7,8の小脳機能障害に関連する微妙な運動障害を明らかにする能力が検証されています。例えば、コネキシン36(Cx36)ノックアウトマウスでは、卵巣ニューロンのギャップ結合が損なわれており、電卓結合の欠如により発火障害が見られますが、運動の表現型を特定するのは困難でした。エラスムス梯子を用いた実験では、小脳の運動学習課題における下卵巣ニューロンの役割は、刺激の正確な時間的符号化を符号化し、予期せぬ出来事に対する学習依存的な反応を促進することであることが示唆された3,4。脆弱Xメッセンジャーリボ核タンパク質1(Fmr1)ノックアウトマウスは、脆弱X症候群(FXS)のモデルであり、手続き記憶形成の軽度の欠陥とともに、よく知られた認知障害を示します。Fmr1ノックアウトは、エラスムスラダーでのセッションと比較して、歩行時間、試行ごとのミスステップ、または運動能力の改善に有意差を示さなかったが、野生型(WT)の同腹仔と比較して、突然現れる障害物に歩行パターンを調整できず、特定の手続き的および連想的記憶の欠損が確認された3,5.さらに、プルキンエ細胞の産出、増強、分子層介在ニューロンまたは顆粒細胞の産出障害など、小脳機能に欠陥がある細胞特異的なマウス変異株は、効率的なステップパターンの獲得の変化による運動協調と、梯子を横断するためのステップ数に問題を示した6。新生児脳損傷は、小脳の学習障害とプルキンエ細胞の機能障害を引き起こしますが、エラスムスラダー7,8でも検出できます。
このビデオでは、行動室のセットアップ、行動テストプロトコル、およびその後のデータ分析について詳しく説明した包括的なステップバイステップガイドを紹介します。このレポートは、アクセスしやすくユーザーフレンドリーに作成されており、新規参入者を支援するために特別に設計されています。このプロトコルは、マウスが採用する運動訓練のさまざまな段階と予想される運動パターンに関する洞察を提供します。最後に、本稿では、強力な非線形回帰アプローチを使用したデータ分析のための体系的なワークフローを提案し、他の研究状況にプロトコルを適応させ、適用するための貴重な推奨事項と提案を完備しています。
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Protocol
今回の研究では、成体(生後2〜3ヶ月)のC57BL/6Jマウスを用いた。動物はケージごとに2〜5匹収容され、観察中の動物ユニット内の餌と水に 自由にアクセスでき 、温度制御された環境で12時間の暗/明サイクルで維持されました。すべての手続きは、ヨーロッパおよびスペインの規制(2010/63 / UE;RD 53/2013)であり、バレンシアナ州議会の倫理委員会とミゲル・エルナンデス大学の動物福祉委員会によって承認されました。
1.行動室のセットアップ
- 行動実験室を毎日同じ時間に予約し、使用するマウスのリストと順序、およびそれらのホストの手配を確立します。
- 実験用マウスを試験室の外に置いて、試験していないときに空気圧縮機の音やエラスムスラダーの音が聞こえないようにします。
- エラスムスラダーシステムのすべてのコンポーネント(ネットワークルーター、ソフトウェアがインストールされたコンピューター( 材料表を参照)、エアコンプレッサー、2つのゴールボックス、ラングが適切に配置されたはしごなど、すべてのコンポーネントが整っていて、すぐに使用できる状態になっていることを確認します。
- ゴールボックス、はしご、横木は、各動物の後に水で、各トレーニング日の終わりに水と70%エタノールで広範囲に清掃します。
2. 行動テストプロトコル
- 実験を作成し、プロトコルをソフトウェアに入力します(補足図S1)。
- ソフトウェアの電源を入れます。
- 実験を作成するには、[ ファイル] |新しい実験 |[新規] または [セットアップ] |実験プロトコル。
注:この調査で使用されているデフォルトのプロトコルはEMCという名前で、ロッテルダムのエラスムス大学医療センターで設計されました。 - 実験に名前を付けて、[ OK] をクリックします。
- 選択したデフォルトの EMC プロトコルが、4 日間の妨害のないセッション(1 日あたり 42 回の妨害のない試行)と 4 日間のチャレンジ セッション(42 回の毎日の混合試験:妨害なし、CS のみ (トーン)、US のみ (障害物)、ペア (障害物がトーンでアナウンスされる) で構成されていることを確認します(図 1B を参照)。右側のパネルで、マウスがはしごを越えるように促すために使用されるライトキュー(最大持続時間3秒)、エアキュー(最大持続時間45秒)、追い風(すべてのトライアルタイプでYes)、およびトーン(250ms、CSのみおよびペアトライアルでのみYes)も確認します。
- 別のプロトコルを作成するには、[ Set up (設定)] |実験計画書 |新規 |最初から 、または EMCプロトコルからコピー して、 セッション数(実験日数) と 1日あたりの試行回数と種類に関連する表の行を編集して、変更するだけです。
注:休息時間、キューの種類と活性化、持続時間、強度、間隔も、実験の質問に応じて調整できます。 - セッションリストを開き、サブジェクトに名前を付けるには、[ 設定 |セッションリスト。
- 「 サブジェクトと変数の追加」をクリックします。
- マウスの順序付きリストに従って 、特定のマウス識別子、生年月日、性別、遺伝子型、および関連するカテゴリをそれぞれ入力します。
- セッションを開始します(補足図S2)。
- 開始する前に、ソフトウェアが開いていることを確認してから、はしごの電源を入れます。
- エアコンプレッサーが接続され、スイッチが入っていることを確認してください。
- [取得]ウィンドウを開くには、作成した実験を開きます。
- [取得] |[取得] を開きます。
- ソフトウェアが示す識別子を持つマウスを、開始ゴールボックス(はしごの右側)に配置します。
- 最初のセッションで取得する マウス識別子 を選択します。
- [ Start Acquisition] をクリックします。
- 赤いはしごメニューノブを3回押します。セッションが開始され、セッションの最後の試行が終了するまでマウスの動きが自動的に制御および記録されることを確認します。
- セッションを終了します。
- 42回目の 試行の最後に、ディスプレイに 「データ送信 」と 「取得済み」のメッセージが表示されていることを確認します。
- マウスをホームケージに戻します。
- はしごとゴールボックスを掃除します。
- 次のマウスを置き、手順2.2.6以降を繰り返します。
- 選択したタイプのセッションを、プロトコルが終了するまで毎日実行します。選択したプロトコルに従って、手順2.2と2.3を毎日繰り返します。
- データをエクスポートします(補足図S2)。
- 記録されたデータを視覚化するには、「 分析 」メニューの「 試行統計量」、「 セッション統計量」および 「グループ統計とグラフ」から選択します。
注:データは、個々の試験のデータと、セッション内の同じ試験タイプの平均を含むスプレッドシートとしてダウンロードできます。セッションは、特定の分析用に選択された変数でフィルタリングすることもできます。 - 右上隅にある[ エクスポート ]ボタンをクリックして、ファイル形式(スプレッドシート)とフォルダの場所を選択します。
- 自動生成されたチャートを右クリックし、[ファイルに保存].jpgを選択します。
- 記録されたデータを視覚化するには、「 分析 」メニューの「 試行統計量」、「 セッション統計量」および 「グループ統計とグラフ」から選択します。
3. データ分析
注意: パラメータのリストは、タッチセンサーのアクティビティの瞬時記録に基づいて、エラスムスラダーによって自動的に測定されます。分析では、ユーザーが選択した出力パラメータがスプレッドシートで整理され、処理されます。ソフトウェアで生成されたグラフに加えて、ユーザーは選択したグラフ作成ソフトウェアを使用してグラフを生成し、セッション中のさまざまなパラメータの特定の変化を視覚化できます。
- 最初の 4 日間の基礎的な動機付けまたは不安状態、感覚反応、運動能力、および微細運動学習を分析するための特定のパラメーターを選択します。
- 光と空気の合図に反応して、ゴールボックス内の静止時間や休息期間後にゴールボックスを出る時間などの制御パラメータを選択してプロットします(図2A)。
注:休息時間または合図への反応は、WTマウスでは比較的一定です。出口の頻度のような他の変数はWTマウスでは基本的に無視できる-動物はめったに合図なしで休憩箱を離れないし、梯子で一度戻って来ることはめったになく、その結果、出口の頻度は試行ごとに1に等しくなる。キューが適用される前に動物が外に出ると、気流が活性化され、マウスはゴールボックスに戻ります。これは、ソフトウェアによる試用としてカウントされません。 - マウスがゴールボックスを離れてからラダーを渡るのに費やした時間として測定された、手がかりの後のラダー上の時間を選択してプロットします(図2B)。
注: べき乗非線形回帰は、学習を評価するためのロバストな方法です。ピアソン係数またはスピアマン係数(R)は、データフィッティングが良好かどうかの尺度を提供します(動物がセッションで学習/改善した場合のR値は1に近い。R 値が 0 に近い場合は、データが一定であり、マウスは学習しないことを意味します)。 - ステップに失敗した試行の割合などのステップパターンパラメータを敏感な学習パラメータとして選択してプロットします(図2C)。
- ステップの長さに関係なく、高いラングから別の高いラング (H-H) へのステップとして正しいステップを定義します。低い段を含むステップタイプをミスステップとして考えます。
- 正しいステップとミスステップを、押された横木間のステップの長さと方向性に応じて、短いステップと長いステップ、バックステップ、ジャンプに分けます( 図1Aを参照)。
- 光と空気の合図に反応して、ゴールボックス内の静止時間や休息期間後にゴールボックスを出る時間などの制御パラメータを選択してプロットします(図2A)。
- 特定のパラメーターを選択してプロットし、過去 4 日間のチャレンジドな運動学習 (米国のみの試行) と連想学習 (対応のある試行) を評価します。
- 手がかりの後のラダーに時間を選択してプロットします(図3)。
- ミスステップのある試行の割合を選択してプロットします(図4A)。
- 梯子の同じ側にある障害物の直前(制御ステップ)と後(適応ステップ)の横線活性化のms精度差として定義される摂動 前後 の ステップ時間を選択してプロットします(図4B)。
注: 摂動前と摂動後のステップ時間解析は、各タイプのセッション内のデータを比較するために実行する必要があります。このパラメータは、連想学習中に障害を予測して克服するマウスの能力を測定します。
- 専用の統計ソフトウェア(SigmaPlotなど)でデータを解析します。セッション間で同じ試行タイプから収集されたデータの検出力非線形回帰分析を実行して、学習プロセスをより効率的に記述し、二元配置反復測定(RM)分散分析を使用して試行タイプ間を比較します。
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Representative Results
エラスムス・ラダーのデバイス、セットアップ、および適用されたプロトコルを 図1に示します。プロトコルは、4 つの邪魔されないセッションと 4 つのチャレンジ セッション (それぞれ 42 の試行) で構成されています。各トライアルは、開始ゴールボックスと終了ゴールボックスの間のはしごを1回実行します。セッションの開始時に、開始ボックスの 1 つにマウスが置かれます。1±5〜5秒(「静止」状態)の設定時間後、ライトが点灯します(キュー1、最大3秒)。次に、軽いエアキュー(キュー2、最大45秒)を適用して、マウスが箱を離れて反対側の端に歩くように促します。エアキューに応答する時間は、マウスとセッションとで異なる可能性があり、グループ間のモチベーションまたは不安状態を比較するためのパラメータとして使用できます。マウスが最終ゴールボックスに到達すると、すぐに新しい試行が開始されます。
WTマウスでは、1〜4日目の休息時間と光の合図に反応する時間に差は観察されなかったが、空気の合図に反応する時間は1日目と2日目の間にわずかに減少した(図2A)。はしごを渡る時間の測定により、1日目から4日目までの有意な学習曲線が得られ、検出力回帰曲線(R = 0.50、* p = 0.047、 図2B)を当てはめることができます。はしごを渡るのにかかる時間を決定する重要なパラメータは、ミスの発生です。梯子の上での時間の短縮に伴い、マウスが梯子を横断するためのより効率的なパターンとして、上の段(H-Hステップ)を歩き、下の段を避けることを学習したため、マウスがミスステップを犯した試行の数は、妨げられていないセッションで減少しました(R = 0.90、***p < 0,0001、 図2C)。
5日目から8日目にかけて、マウスは、予期せぬ障害物(US)が導入されたチャレンジセッションを受けました(1つの段が足面からランダムに18mm持ち上げられます)。一部の試行では、トーン(CS、90dB、15kHzトーン、250ms持続)がUS摂動の250ms前に提示されます( 図1Bを参照)。
5日目にチャレンジセッションが始まると、米国のみの試験では、障害物が予期せぬ形で導入されたため、動物ははしごを越えるのにより多くの時間を必要としました(4日目:5.01秒; 図2B;5日目:7.84秒; 図 3;対応のある t検定、*p < 0.039)。マウスのパフォーマンスは5日目から8日目にかけて改善し、米国のみのセッションで有意な学習曲線が得られました(R = 0.50、*p = 0.045、 図3、オレンジ)。障害物とトーンを対にした連想学習試験では、動物は米国のみの試験と比較して、毎日のセッションを有意に早く完了しました(R = 0.63、 図3、紫、二元配置RM ANOVA、*p = 0.028)。最後に、トーンを単独で提示した場合の対照試験(CSのみ)では、乱れのないセッションに似た有意な学習曲線が報告されました(R = 0.82、***p < 0.001、 図3、青)。
ステップパターンの解析により、米国のみの試験と関連試験の差を検出する際のさらなる確認と感度の向上が得られた。 図4A は、米国のみの試験(R = 0.01、 p = 0.90、オレンジ)を通じて、失敗のある試験の割合が一定に保たれたのに対し、ペアセッションでは失敗のある試験の有意な減少が観察されたことを示している(R = 0.61、*p = 0.01、紫)。 図4B は、米国のみの試験(二元配置RM ANOVA、*p = 0.05)では摂動前と摂動後のステップ時間に有意差があることを示していますが、マウスが障害を克服するためにより速く学習した対応のある試験では有意差が見られません。調査したすべての変数と適用された統計的検定は、 補足表S1に報告されています。
図1:システム、プロトコル、およびパラメータ。 (A)エラスムスラダーは、2つのゴールボックスが側面に並んだ水平のはしごで構成されています。この漫画は、高低の横木が交互に並んだ梯子と、ステップの種類(通常のステップ、塗りつぶされた線、またはミスステップ、破線)や、マウスが音(条件刺激)によってアナウンスされるかどうかにかかわらず、障害物(無条件刺激、より高い段)を克服する必要がある時間として定義される摂動前後のステップ時間など、記録された主なパラメータを表しています。(B)プロトコルは、4つの乱れのないセッションと4つのチャレンジセッション(1セッション/日、42試行/セッション)で構成されており、細かい運動学習(青は邪魔されず、CSのみ)、挑戦された運動学習(米国のみ、オレンジ)、および連想運動学習(ペアCS + US、紫)を個別に分析できます。略語:H =高;L =低い;CS = 条件付き刺激;US = 無条件刺激。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:乱れのないセッション中のWTマウスの運動性能。 (A)ゴールボックスでの休息時間(一定、15秒)、合図に反応する時間:光(一定、3秒)と空気(可変)。1〜4日目の邪魔されないセッション。(B)邪魔されないセッション中にキュー(光と空気)の後にはしごを渡る時間。(C)動物がステップを逃した各中断されていないセッションにおける試行の割合。学習の進捗状況を調べるために、べき乗回帰分析を使用しました(R = 0.50:* p = 0.047、R = 0.90 ***p < 0.0001、それぞれ、n = 4匹のマウス)。略語:WT =野生型。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:チャレンジセッション中のWTマウスのパフォーマンス。 米国のみ (オレンジ)、ペア (紫)、CS のみ (水色) のトライアルの 5 日目から 8 日目のキュー後のラダーの平均時間。学習の進捗状況を調べるために、検出力非線形回帰分析を使用しました(*p = 0.047、**p = 0.0093、***p < 0.001、n = 4マウス)。試験タイプを比較するための二元配置RM分散分析(*p = 0.028、**p = 0.008、n = 4マウス、2匹の雄と2匹の雌、平均±SEM)。略語:CS =条件刺激;US = 無条件刺激。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:チャレンジセッションにおけるマウスステップパターンの変化。 (A)米国のみのセッションおよびペアのセッション中に動物がステップを逃したセッションあたりの試行の割合。学習過程の研究には検出力回帰分析(*p = 0.013)を使用し、試験タイプ間の比較には二元配置RM ANOVA(*p = 0.032、n = 4匹のマウス)を用いた。(B)セッション全体の米国のみのセッションおよびペアセッションにおける摂動前後のステップ時間。二元配置反復測定ANOVA、*p < 0.05、n = 4匹のマウス、2匹の雄と2匹の雌、平均±SEM。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足図S1:ソフトウェアインターフェース:実験の作成方法とプロトコルの選択方法。 プロトコルステップ 2.1 で説明したワークフローを示すソフトウェアのスクリーンショットで、ステップ 2.1.4 から 2.1.8 までをカバーしています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:ソフトウェアインターフェース:セッションの開始方法とデータのエクスポート方法。 プロトコルのステップ 2.2 と 2.5 で説明されているワークフローを示すソフトウェアのスクリーンショットで、ステップ 2.2.4 から 2.2.7 および 2.5.1 から 2.5.3 をカバーしています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
附表S1:統計表。 図2B、C、図3、および図4A、Bに報告されている、調査したすべての変数と適用された統計的検定の説明。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
エラスムスラダーは、現在のアプローチを超える運動表現型評価に大きな利点をもたらします。試験は実施が容易で、自動化され、再現性があり、研究者は単一のマウスコホートを使用して運動行動のさまざまな側面を個別に評価できます。本研究では、再現性により、デバイスの特性、実験計画、および解析方法を利用して、少数のWTマウスでロバストなデータを生成することができました。例えば、従来のビームウォークアッセイと比較すると、ラダーパスに入るための動機付けの手がかり(空気と光)と試験を完了するための追い風を追加することで、一貫性が向上し、ばらつきの主な原因である実験者の介入の必要性がなくなります。
マウスの方向と位置に合わせて調整できる空気の流れを生成するには、空気圧縮機システムが必要です。気流は、予定されている試験開始前にマウスがゴールボックスを離れようとすると、反対方向から時速30kmの向かい風を発生させ、マウスをゴールボックスに戻します。また、試行中、マウスがはしごを完全に横切って反対側のゴールボックスに入るまで、一定の追い風(1〜16 km / h)を発生させます。加圧された空気が梯子を渡るインセンティブがなければ、マウスは横木で一時停止したり、ゆっくりとしたペースで方向を逆方向にしたりすることが多く、分析には逆効果の探索的変数が生じます。
ここで説明する標準プロトコルは、基本的な細かい運動の調整と学習 (邪魔されないセッション)、および課題への適応と連想運動学習 (チャレンジ セッション) を 8 日間の期間にわたって測定します。この作業は、ここで使用したC57Bl6Jマウスなど、神経科学研究に通常使用されるWTマウス株では容易であり、どの試験セッションでも怪我は観察されず、安全です。また、ロータロッドやトレッドミルなど他の運動テストと比較しても、疲労の兆候は見られませんでした。
4日間の初期段階で、WTマウスはスキルを習得し、最も効率的なランニングパターン(H-Hステップ)を採用することを学習することではしごを渡り、4日目までに失敗はめったに発生しません(図2B、C)。第2段階の5日目、マウスは最初に障害物に遭遇したときは遅くなりますが、すぐに適応します(図3、米国のみ)。障害物を条件付け刺激(トーン)と組み合わせると、試行期間が障害物が提示されない試行と等しくなる程度まで学習が促進されます(図3、ペア)。注目すべきは、米国のみの試験では失敗の試行数が一定であったのに対し(図4A)、ペアセッションでは有意な減少が観察され(図4A)、連想学習プロセスの有効性が確認されたことです。
エラスムスラダーソフトウェアが提供する代表的なパラメータを解析するためのワークフローを提案します。累乗回帰分析により、有意な学習曲線を記録し、4匹のWTマウスを使用して課題学習と連想学習の違いを検出することができました。追加の文献とパイロット実験に基づいて、変異マウスまたは治療されたマウスを含む実験計画では、マウス数を7〜10匹のマウスに増やす必要がある場合があります4,5,6。私たちの手元にあるでは、セッションあたり42回の試行は、数回の試行を平均するとばらつきが減少するため、小さなマウスコホートで頑健なデータを得るのに最適な数でした。数は多く見えるかもしれませんが、42回の試行セッションごとに15分から35分かかり、1日あたり12〜16匹のマウスを合理的にテストできます。試用期間 (休憩時間、合図への応答、およびはしごを横断する時間を含む) は、トレーニング日と試行の種類に応じて、20 秒から 50 秒の間で異なります。
それにもかかわらず、システムの汎用性により、研究者は、1日あたりのセッション数と試行回数、キューとCSの強度と期間、米国の性質など、さまざまな設定を調整することで、カスタマイズされたプロトコルを設計できます。例えば、私たちのデータは、WTマウスでは、特にパフォーマンスがプラトーに達した後の1日目から2日目の間に、急速な学習曲線を示しました(図2B、C)。これは、追加の2日間は、中断されていないセッションで基本的な運動学習をテストするために厳密には必要ではない可能性があり、トレーニング期間をわずか2日間に短縮することで標準プロトコルの変更を実装できることを示唆しました。しかし、この適応は、インターリーブされた非妨害試験、米国のみ、CSのみ、およびペア試験を組み込んだプロトコルの第2フェーズには適していない可能性があります。刺激は、特定の行動を評価するためにランダムかつ予想外に提示され、実験的試行をこれら4つのカテゴリに分ける必要があるため、統計的検出力に必要な試行回数は42です。したがって、プロトコルの再編成では、妨げられていない試験の数を減らすか、特定のチャレンジ試験を増やすかの実現可能性を評価する必要があります。CS(90dB、15kHzトーン)とUSの間の刺激間間隔(ISI)は、ここでは250msに設定されていますが、刺激と応答の関連性を調べるために変化させることもできます。この種の調整により、研究者は難易度を滴定したり、科学的な問題に応じてさまざまな行動に焦点を当てたりすることができます。
今日まで、エラスムスラダーは、主に小脳起源の運動協調の微妙な欠陥を検出するために使用されてきました。例えば、ミスステップは全身の運動協調の尺度です。この研究では、若年成体マウスが用いられたが、自発運動機能の成熟を研究するために、P23のような若いマウスが他のマウスによって用いられている7,8。中枢性起源の同側病理は、マウスの右足と左足の位置の識別分析を通じて研究することができます。最後に、エラスムス梯子で運動能力を習得すると、大脳基底核、運動皮質、脳梁などの接続経路を含む他の運動制御回路が関与する可能性があります。この行動パラダイムを細胞、分子、回路の手法と組み合わせることで、運動適応を媒介する回路メカニズムの調査に有用であり、運動学習を促進するために利用することができます。そのような例の1つは、脱髄のマウスモデルにおける微細運動能力の獲得に非常に敏感な軸索髄鞘形成への影響を研究することです9,10。
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Disclosures
著者には開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
視聴覚技術者兼ビデオプロデューサーのレベッカ・デ・ラス・エラス・ポンセ氏と獣医師長のゴンサロ・モレノ・デル・ヴァル氏には、マウス実験中のグッドプラクティスを監督していただいたことに感謝します。この研究は、GVAエクセレンスプログラム(2022/8)およびスペイン研究機関(PID2022143237OB-I00)からイザベル・ペレス・オターニョへの助成金によって資金提供されました。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
C57BL/6J mice (Mus musculus) | Charles Rivers | ||
Erasmus Ladder device | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
Erasmus Ladder 2.0 software | Noldus, Wageningen, Netherlands | ||
Excel software | Microsoft | ||
Sigmaplot software | Systat Software, Inc. |
References
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