Summary
現在のプロトコルは(Sの魔女- H2O2 -抗原 Retrieval - 2,2' -チオジエタノール[TDE])の薄板の蛍光顕微鏡検査のイメージ投射と短いティッシュの変形の技術を日常的に高いスループットのプロトコルのイメージ投射と結合することによって多数の死後の人間の頭脳セクションの急速で、同時光学清算、多円形の分類および3D容積測定の復元のための段階的なプロシージャを提供する。
Abstract
過去10年間に数多くの透明化技術が登場したにもかかわらず、死後の人間の脳の処理は、その寸法と複雑さのために依然として困難な作業であり、マイクロメートルの解像度でのイメージングを特に困難にしています。この論文では、ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)によるサンプルの透明化、ラベリング、およびシーケンシャルイメージングを可能にするSHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-チオジエタノール[TDE])組織形質転換プロトコルで数十のセクションを同時に処理することにより、ヒト脳の体積部分の再構築を行うプロトコルを紹介します。SHORTは、複数のニューロンマーカーを含む厚いスライスの迅速な組織透明化と均質なマルチラベリングを提供し、白質と灰白質の両方で異なるニューロン亜集団の同定を可能にします。クリア後、スライスはLSFMを介してマイクロメートルの解像度で複数のチャンネルで同時にイメージングされ、迅速な3D再構成が可能です。ルーチンのハイスループットプロトコル内でSHORTとLSFM解析を組み合わせることにより、広い体積領域の3D細胞構造再構成を短時間で高解像度で取得することができ、ヒト脳の包括的な構造特性評価が可能になります。
Introduction
ヒトの脳の大量の3D分子組織と細胞構造を解析するには、検体の光学的透明性が必要であり、処理時間の長いプロトコルによって達成されます。組織内の屈折率(RI)の不均一性を最小限に抑えるために光学透明化技術が開発され、それによって光の散乱を低減し、高解像度イメージングのための光の浸透深さを増加させました1,2,3,4,5。透明化および深部組織標識法の現在の進歩により、最先端の顕微鏡技術を活用することにより、無傷のげっ歯類の臓器および胚の体積イメージングが可能になります6,7,8,9,10,11,12。
しかし、死後の人間の脳の広い領域の体積3D再構成は、モデル生物と比較して依然として困難な課題です。複雑な生物学的組成とさまざまな死後の固定および保存条件は、組織の透明化効率、抗体の浸透深さ、およびエピトープ認識を損なう可能性があります13、14、15、16、17、18、19。さらに、モデル生物と比較して、大きなヒトの脳領域の効率的な透明化と均一な標識を達成するためには、機械的組織切片とそれに続く各スライスの透明化と標識が依然として必要であり、その結果、処理時間が長くなり、高度なカスタム機器が必要になります15,20,21,22。
SWITCH - H2O2 - 抗原 R賦活化 - TDE (SHORT) 組織形質転換技術は、ヒトの脳の大量の分析に特化して開発された18,23。この方法では、SWITCHプロトコル11の組織構造保存と高濃度の過酸化水素を使用して、エピトープ修復と組み合わせて組織の自家蛍光を減少させます。SHORTは、異なるニューロンサブタイプ、グリア細胞、血管系、および有髄線維のマーカーを用いて、ヒトの脳スライスを均一に染色することを可能にします18,24。その結果は、低密度および高密度タンパク質の両方の分析に適合します。得られた高い透明性レベルと均一な標識により、蛍光顕微鏡法による厚切りの体積再構成が可能になり、特に、高速取得ライトシート装置18、24、25、26、27を使用することができる。
この研究では、SHORT組織形質転換技術を使用して、ホルマリン固定された数十のヒト脳切片の同時透明化とマルチラウンドラベリングを行う方法について説明します。4つの異なる蛍光マーカーを併用することで、異なる細胞亜集団を同定することができます。クリアリング後、蛍光顕微鏡で高分解能の体積イメージングを行うことができます。ここでは、カスタムメイドの逆LSFM 18,24,25,26,27を使用し、サンプルの高速光学セクショニングと複数のチャンネルの並列取得を可能にしました。この日常的にハイスループットプロトコルにより、ブローカの領域全体のマッピングですでに実証されているように、人間の脳の広い領域の細胞内分解能で包括的な細胞および構造特性評価を得ることができます23。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ホルマリン固定ヒト組織サンプルは、マサチューセッツ総合病院(MGH)剖検サービス(米国ボストン)の神経病理学部門から提供されました。Partners Institutional Biosafety Committee(PIBC、プロトコル2003P001937)からIRBが承認した組織収集プロトコルに従って、死亡前に健康な参加者から書面による同意が得られました。承認文書は、米国マサチューセッツ州ボストンのMGH剖検サービスに保管されており、リクエストに応じて入手できます。
1. アガロース包埋とサンプル切断
- ビーカー内の1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)中の4%w/vアガロース溶液を調製し、組織ブロックを内部に埋め込みます。室温(RT)に達するまで待ってから、4°Cで24時間保存します。
- 高精度の切片を得るには、サンプルをビブラトームの検体ディスクに接着し、トレイに冷たい1x PBS(pH 7.4)を充填します。スライスする組織の種類に応じて、周波数、振幅、速度などのビブラトームパラメータを調整します(使用される値:周波数 = 5 (50 Hz)、振幅 = 0.4、速度 = 3 (0.15 mm/s)。
注:サンプル量に応じて異なるビブラトームを使用する必要があります。最大容量が70 x 40 x 15 mmのサンプルには、ビブラトーム(Leica VT1000 Sなど)を使用できます。より大きなサンプルには、圧縮トーム(VF-900-0Zミクロトーム18など)またはカスタムメイドの装置21を使用することが可能です。ここでは、400μmまたは500μmの厚さでカットされたスライスを紹介します。 - 切断後、すべてのスライスを0.01% w/vアジ化ナトリウム(NaN3)を含む1x PBS(pH 7.4)からなる保存液に入れ、4°Cで保存します。
注:包埋する前に、アガロース溶液が37°Cに達するまで待ってください。 温度が高くなると、試験片が損傷する可能性があります。長時間の固定は、抗原を損傷し、組織の自家蛍光を増加させることにより、標識手順に支障をきたす可能性があるため、サンプルをPFAに48時間以上放置しないことをお勧めします。ヒト組織の長期保存には、微生物汚染を防ぐためにNaN3 を含むPBSが使用されます。NaN3は毒性があるため、薬品フードの下で予備液を調製してください。
2. 組織固定
注:以下のプロトコルで使用されるすべての溶液は、同じ組織ブロックのすべてのスライスを処理し、技術的なばらつきを最小限に抑え、個々のステップの時間を短縮するのに十分な量で調製されています。
- 50% v/v 1x PBS pH 3、25% v/v 0.1 M 塩酸(HCl)、25% v/v 0.1 M フタル酸水素カリウム(KHP)、および新鮮な 4% v/v グルタルアルデヒドでスイッチオフ溶液を調製します。すべてのサンプルをスクリュー蓋付きのディッシュ(70 x 23 mm)に入れ、スイッチオフ溶液と一緒に4°Cで1日間穏やかに振とうしながらインキュベートし、アルミホイルで光から保護します。
- 1x PBS(pH 7.4)と新鮮な1% v/vグルタルアルデヒドでスイッチオン溶液を調製します。すべてのサンプルを新しいディッシュに入れ、スイッチオン溶液と一緒に4°Cで1日間穏やかに振とうしながらインキュベートし、アルミホイルで光から保護します。
注意: グルタルアルデヒドは毒性が高く、光に敏感であるため、スイッチオフ溶液とスイッチオン溶液の両方を常に新鮮に調製し、氷上の化学フードの下に保管する必要があります。常に皿に各溶液20 mLを入れ、パラフィルムで密封します。
3. 無効化と消込
注:サンプル中の反応性グルタルアルデヒドは、1x PBS pH 7.4、4% w/v アセトアミド、4% w/v グリシン、pH 9.0からなる不活化溶液とインキュベーションして不活化する必要があります。溶液は4°Cで最大3ヶ月間保存できます。脂質を除去して組織を透明にするために、200 mMのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、20 mMの亜硫酸ナトリウム(Na2SO3)、および20 mMのホウ酸(H3BO3)、pH 9.0からなる透明化溶液を使用します。SDSは4°Cで沈殿するため、溶液は室温で保存する必要があります。 以下のすべてのステップは、溶液で満たされたチューブで行われます。
- サンプルを皿からチューブに移し、1x PBS pH 7.4、室温で穏やかに振とうしながら3 x 2時間洗浄します。
注意: ステップ3.1では、グルタルアルデヒドの毒性があるため、化学フードの下で作業する必要があります。アセトアミド、SDS、ホウ酸も有毒な試薬であり、薬品フードの下で取り扱う必要があります。チューブに必ず50 mLの各溶液を入れてください。 - サンプルを不活化溶液中で37°Cのウォーターバス中で一晩インキュベートします(o/n)。
- 穏やかに振とうしながら、室温で1x PBS pH 7.4で3 x 2時間洗浄します。
- サンプルを55°Cの透明溶液中でウォーターバス中で3〜7日間インキュベートします。溶液は 2 日ごとに交換してください(表 1)。
4. 免疫標識
注:標識ステップの前に、残留SDSを除去し、自家蛍光を低減し、10 mMトリス塩基、1 mM EDTA、および0.05% v/v Tween 20、pH 9からなる抗原賦活化溶液でエピトープをマスク解除する必要があります。溶液のpH 9 は、効率的な回収プロセスのために最適化されています。トリス塩基は緩衝剤として機能し、安定したpH環境を維持します。キレート剤であるEDTAは、抗原のアクセシビリティを高めます。非イオン性界面活性剤Tween 20は、組織の透過性を改善するのに役立ちます。この溶液は4°Cで保存できます。 過酸化水素と抗原賦活化ステップを組み合わせると、非特異的なバックグラウンドシグナルの原因となる内因性蛍光色素(リポフスチンなど)を分解および/または修飾することにより、自家蛍光シグナルを低減する相乗効果があることに注意することが重要です。
- 0.1% v/v Triton X-100(PBST)でPBSを1個調製し、37°Cに予熱し、インキュベーター内で37°Cで穏やかに振とうしながら、日中に3 x 3時間サンプルを洗浄します。最後の洗浄はそのままにしておきます。
注:PBSTストック溶液は4°Cで保存してください。 SDSは低温で不溶性の沈殿物を形成し、その後の取得プロセスに干渉する可能性があるため、組織からSDSを除去することが重要です。 - 翌日、各サンプルに10 mLの30% v/v過酸化水素(H2O2)を加え、室温で45分間穏やかに振とうします。
- 室温で穏やかに振とうしながら、1x PBS(pH 7.4)で 3 x 10 分間洗浄します。
- 抗原賦活化溶液をウォーターバス中で95°Cに予熱します。サンプルを加熱した溶液に移し、95°Cで10分間放置します。
- 試験片を穏やかに振とうしながら40分間室温まで冷却します。
- 軽く振とうしながら、脱イオン水で3 x 5分間洗浄します。
- サンプルをPBS中で4°Cで15分間平衡化します。
- 0.01% w/v NaN3 のPBST製の新しい抗体溶液を調製し(ステップ1.3については注を参照)、一次抗体を添加します。サンプルをスクリュー蓋付きのディッシュに入れ、37°Cのインキュベーターで穏やかに振とうし、光から保護してn日間(1〜7)インキュベーターでインキュベートします(表2)。
注:インキュベーション時間はサイズと厚さによって異なります(表1および表2)。 - n日後、サンプルをチューブに移し、インキュベーター内で穏やかに振とうしながら、37°Cで予熱したPBSTで3 x 2時間洗浄します。
- 0.01% w/v NaN3 のPBSTに二次抗体を添加し、サンプルをスクリュー蓋付きの新しいディッシュに入れ、37°Cでn日間(1-6)、穏やかに振とうし、光から保護したインキュベーターでインキュベートします(表1および表2)。
- n日後、サンプルをチューブに移し、穏やかに振とうするインキュベーターで37°Cに予熱したPBSTで日中に3 x 3時間洗浄します。最後の洗浄はそのままにしておきます。
注意: Triton X-100およびTween 20は粘性があるため、ゆっくりとピペットで操作してチップを充填してください。チューブに必ず50 mLの各溶液を入れてください。各サンプルに10 mLの抗体溶液を使用し、溶液の蒸発を防ぐためにパラフィルムでディッシュを密封します。抗体溶液にはNaN 3が含まれているため、 4°Cで保存し、2週間以内に新しい検体に再使用して標識することができます。
5. 屈折率マッチング
注:高いレベルの透明性を実現するには、組織の屈折率を均質化する必要があります。ここでは、1x PBSで希釈した2,2'-チオジエタノール(TDE)を使用します。TDE ソリューションは RT に保存する必要があります。
- サンプルを新しいディッシュに移し、30% v/v TDEを添加し、室温で穏やかに振とうしながら4時間放置します。
- 30% v/v TDE 溶液を除去し、68% v/v TDE をサンプルに添加し、室温で穏やかに振とうします。
注意: TDEは粘性があるため、ゆっくりとピペットで操作してチップを充填します。TDE蒸気またはミストを吸入すると、呼吸器系を刺激する可能性があります。したがって、曝露を最小限に抑えるために、換気の良い場所で作業するか、ドラフトを使用することをお勧めします。TDE 溶液は RT で保存する必要があります。 各サンプルに 10 mL の TDE 溶液を使用します。
6. サンプルの取り付け
注:サンプルの取り付けとLSFM画像の取得を容易にするために、顕微鏡スライド、スペーサー、カバーガラスの3つの部分で構成されるカスタムメイドの密閉型サンプルホルダー(「サンドイッチ」と呼ばれる)を使用しています。
- スチールスペーサー(56 x 56 x 0.5 mm3)を顕微鏡スライド(60 x 60 x 1 mm3)の上に置き、サンプルを顕微鏡スライドに置きます。
- 石英カバーガラス(60 x 60 x 0.5 mm3)を慎重に置き、すべてをクリップで留め、1:1の比率で2成分のシリコン接着剤を準備します。屈折率を一致させるために石英カバーガラスを使用し、取得プロセス中の光学収差を低減します。
- 1 mLのシリンジを使用して、スペーサーとカバーガラスの間のスペースを2液シリコン接着剤で満たし、10分間乾燥させます。
- クリップを取り外し、小さな針を使用して、サンドイッチ全体を68%v/v TDEでゆっくりと満たします。
- 新鮮な接着剤を作り、サンドイッチを密封します。
注意: 手順6.1でTDEが誤ってスペーサーに到達した場合、接着剤は硬化しません。手順6.2で気泡が発生しないことを確認してください。
7. ストリッピング
注:SHORTの構造保存とエピトープへのアクセス性の向上により、抗体を除去し、サンプルを他のマーカーで再染色することにより、スライスのマルチラウンドラベリングが可能になります。
- ブレードでサンドイッチを開き、30% v/v TDEで満たされたスクリュー蓋付きの新しい皿に試験片を入れ、3時間放置します。
- サンプルをチューブに移し、室温で1x PBS(pH 7.4)で穏やかに振とうしながら3 x 2時間洗浄し、最後の洗浄はそのままにしておきます。
- サンプルを清澄溶液に浸し、80°Cのウォーターバスに4時間入れます。
- 1x PBST(pH 7.4)で37°C、穏やかに振とうしながら3 x 2時間洗浄し、最後の洗浄はそのままにしておきます。これで、サンプルをステップ4.8から再度ラベル付けする準備が整いました。
注意: チューブには必ず50 mLの各溶液を充填してください。各サンプルに 10 mL の TDE 溶液を使用します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ここで説明するプロトコルは、SHORT法を使用して、厚さ100μmから500μmの範囲の複数のスライスの同時処理を可能にします。このアプローチにより、手順全体の処理時間が大幅に短縮されます。この研究では、複数の死後ヒト脳厚切片を同時に処理するためのパイプライン全体(図1)を包括的に説明し、一度に24スライスのプロトコルを実証します(図2A)。透明化および共標識の期間は、サンプルのサイズと厚さを考慮して11〜30日の範囲です(表1)、イメージングおよびポストイメージング処理を除く。TDEにおける脱脂化と屈折率マッチングに続いて、灰白質と白質の両方ですべての組織スライスの最適かつ均質な透明性が達成されます(図2B)。
画像取得は、共焦点25や2光子顕微鏡14など、さまざまな高度な蛍光顕微鏡で実行できます。ここでは、405 nm、488 nm、561 nm、638 nmの4つの励起レーザーラインを備えたカスタムメイドの逆LSFM18,23を使用し、蛍光色素標識抗体で標識された4つの異なる生物学的特徴を取得できるようにしました。図3Aは、介在ニューロンの2つの異なる亜集団と核マーカーDAPIを標識する汎ニューロンマーカーであるNeuN、ソマトスタチン(SST)、およびカルレチニン(CR)を共標識したヒトブローカ領域の厚さ400μmのスライスの代表的な画像を示しています(図3A、B)。厚さ400μmのスラブでは、Zに沿ったグローバル蛍光は表面に限定されず、中央部でシグナル強度がわずかに低下するものの、組織の深さ全体にわたってほぼ均一であることが観察されました(図3C)。
ヒト脳組織のより包括的な細胞特性評価を達成するために、SHORTの原著論文で実証されているように、抗体を剥ぎ取り、サンプルを再標識することにより、同じ標本のマルチラウンド標識を実行することが可能です。 図4 (Pesce et al.18から引用)は、SHORTで処理した厚さ500 μmの組織切片に7種類の抗体を3回連続で免疫染色した可能性を示しています。使用される抗体には、抑制性神経細胞マーカーとしてNeuN、SST、CR、パルブアルブミン(PV)、血管作動性腸管ペプチド(VIP)、グリア細胞のグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、血管系のビメンチン(VIM )が含まれます(表2)。この結果は、さまざまなストリッピング手順を通じて組織情報を保存し、自家蛍光シグナルを効果的に低減し、効率的な検体除去を達成するSHORTの優れた能力を示しています。
図1:SHORTのタイムライン SHORTプロトコルでサンプルを処理するために必要なステップを表すスキーム。各ステップでは、数十枚のヒト脳組織スラブが一緒に処理されます。アガロースに包埋してスライスした後、サンプルをスイッチオン溶液とスイッチオフ溶液にそれぞれ1日間入れます。不活性化ステップは一晩行われますが、清澄溶液中でのインキュベーションによる脱脂化には3〜7日かかります。その後、サンプルを一次抗体溶液および二次抗体溶液とそれぞれ最大7日間および6日間インキュベートします。屈折率マッチング後、サンプルはサンプルホルダー(サンドイッチ)にマウントされ、LSFMイメージングと保存が行われます。サンドイッチアセンブリ後はいつでも、サンプルを剥がしてラベルを付け直し、さまざまなマーカーを検出することができます。略語:TDE = 2,2'-チオジエタノール;SHORT = SWITCH - H2O2 - 抗原 R賦活化-TDE;o / n = 一晩;RI = 屈折率;LSFM = ライトシート蛍光顕微鏡法。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ブローカ領域のブロックから同時に処理されたヒトの脳スライス。 (A)ブローカの領域4 x 4 x 0.04 cm3 のPBSから、SHORT法で処理する前の24枚の連続スライス。(B)SHORT処理後の A と同じ試験片。スケールバー = 1 cm。略語:TDE = 2,2'-チオジエタノール;SHORT = SWITCH - H2O2 - 抗原 R賦活化-TDE;PBS = リン酸緩衝生理食塩水。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図 3.4つの異なるマーカーでラベル付けされた清澄化スライスの代表的なLSFM画像。 (A)最大強度投影画像(解像度3.3 x 3.3 x 3.3 μm3)は、NeuN、ソマトスタチン、カルレチニン、および核マーカーDAPIについて標識されたブローカ領域のSHORT処理されたスライスのメゾスコピック再構成を示す。右側には、マージされたイメージ (NeuN-SST-CR-DAPI) が表示されます。スケールバー = 0.5 cm。 (B) Aの結合画像の拡大挿入。スケールバー = 100 μm。 (C) (B) の高解像度 (0.55 x 0.55 x 3.3 μm) yz 画像。スケールバー = 100 μm。略語:TDE = 2,2'-チオジエタノール;SHORT = SWITCH - H2O2 - 抗原 R賦活化-TDE;LSFM = ライトシート蛍光顕微鏡;NeuN = ニューロン核抗原;SST = ソマトスタチン;CR =カルレチニン;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:SHORT処理されたスライスにおけるマルチラウンド染色の代表的なLSFM画像。 (A)屈折率マッチング(68%TDE)によるプレクリアリング(PBS)およびマルチラウンドラベリング後のヒト脳スライスの画像。スケールバー = 1 cm。 (B) その後の 3 回のマルチラウンドで取得したさまざまなチャネルのマージ。この画像は、血管活性腸ペプチド、ソマトスタチン、パルブアルブミン、カルレチニン、神経核抗原、グリア線維性酸性タンパク質、およびビメンチンで標識された白質と灰白質の両方を示しています。高解像度(0.55 x 0.55 x 3.3 μm)のシングルチャンネル画像が画像の右側と下に表示されます。スケールバー = 100 μm GFAP を除くすべての画像(スケールバー 10 = μm)。(C)厚さ500 μmのスライスの最大強度投影画像で、3回の連続した免疫染色で使用した7種類の抗体からのシグナルを示しています。ラウンド1:PV-SST-VIP;ラウンド2:CR-SST-NeuN;ラウンド3:VIM-SST-GFAP。スケールバー = 1 mm。この図はPesce et al.18から修正したものである。略語:TDE = 2,2'-チオジエタノール;SHORT = SWITCH - H2O2 - 抗原 R賦活化-TDE;LSFM = ライトシート蛍光顕微鏡;NeuN = ニューロン核抗原;SST = ソマトスタチン;CR =カルレチニン;PV = パルブアルブミン;GFAP =グリア線維性酸性タンパク質;VIM = ビメンチン;VIP = 血管作動性腸ペプチド。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表1:さまざまな面積と厚さのサンプルのSHORTの代表的な時間長。 面積や厚さが異なる検体では、透明化や抗体溶液中でのインキュベーション時間を可変にする必要があるため、SHORTパイプライン全体で異なる時間長が生じます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:SHORTに適合する抗体。 この表には、SHORTプロトコルで試験され、厚さ400〜500μmのヒト脳標本で特異的な染色を示したすべての抗体がリストされています。P/M列は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を示します。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ヒトの脳の大きな領域の高解像度イメージングと3D再構成には、機械的組織切片作成とそれに続く光学的透明化と単一スライスの免疫標識が必要です。ここに示されるプロトコルは短いティッシュの変形方法がLSFMの細胞内決断の3D頭脳の再建のための多数の人間の頭脳の厚いセクションの急速で、同時処理に使用することができる方法を記述する。
他のアプローチとは異なり、SHORT法では、クリアリングとマルチラベリングのステップは、高度なカスタマイズされた機器を必要としません。大量の検体をまとめて処理できるため、大きなヒト脳組織ブロックの処理時間が短縮され、技術的なばらつきが最小限に抑えられます。
脱色およびエピトープ除去処理は、老化したホルマリン固定ヒト組織を扱う場合に重要です。過酸化水素とアルカリ性抗原賦活化溶液は、iDISCO 6,28、CLARITY、SWITCH、SHIELD24などの他の透明化方法と組み合わせて使用することもできます。
エピトピープル情報を確実に保存し、灰白質と白質の両方を均一に除去するには、サンプルを熱や化学試薬に耐性のあるゲル/組織ハイブリッドに変換する必要があります。グルタルアルデヒドは、その優れた架橋能力と、低pH(pH = 3)で組織スラブに浸透する能力のために選択されました。グルタルアルデヒドの濃度は、組織の強度と透明度を決定する上で重要な要素です。濃度が高いほど、組織構造の保存性が向上しますが、除去に必要な時間も長くなります。この選択により、エピトープの保存と均質なクリアリングの観点から望ましい結果が得られます。スイッチオフ溶液(プロトコルステップ2.1)の場合、グルタルアルデヒドの濃度は慎重に選択され、効果的な架橋と迅速な透明化のバランスをとるように最適化されています18,25。SHORTは、ブローカ野、海馬、皮質皮質18,23,25のホルマリン固定ヒト脳スライスを扱うために特別に調整されています。ただし、他の生物学的モデルや異なる脳領域を扱う場合、灰白質と白質の組成の違いにより、いくつかの変更が必要になる場合があります。
このプロトコルの1つの重大な仕事はまた標本のサイズおよびティッシュの生物的構成と関連している除去(議定書ステップ3.4)および抗体の解決(議定書のステップ4.8および4.10)の孵化時間の最適化である。500 μmは、白質と灰白質の両方で最適な透明性を達成し、いくつかの抗体染色において組織深度全体にわたって均一な標識を実現するための組織厚さの限界であると推定されました(表2)。これらのプロセスの詳細な説明は、Pesce et al.18 および Scardigli et al.24 にあります。脳の領域が異なれば、脂質やタンパク質の組成も異なる可能性があり、老化した脳では、リポフスチン型色素とニューロメラニンが高濃度で発生し、強い自家蛍光シグナルを生成し、組織全体のプローブ拡散を変化させます。一例として、ヒトのブローカ領域からの16cm2 の厚さ400μmのスライスは、高レベルの脱脂化に達するために透明化溶液で7日間の処理を必要とする。組織深度全体にわたって均一な染色を行うには、一次抗体溶液と二次抗体溶液でそれぞれ7日間および6日間インキュベートする必要があります(図3)。したがって、ここで説明するハイスループットプロトコルを適用する前に、透明化とラベリングのステップを細かく最適化する必要があります。
SHORTは、蛍光シグナルが少なくとも1年間保存されることが実証されているため、サンプルをカスタムメイドのイメージングホルダーに保存することができます。したがって、研究者はすべてのサンドイッチを事前に準備し、後で実行できるイメージングステップのためにそれらを保存することができます。特に、サンドイッチを作製するために使用される顕微鏡スライド、スペーサー、およびカバーガラスは、標本のサイズに応じてカスタマイズできます。
ここで説明するSHORTプロトコルで処理されたサンプルは、カスタムメイドの逆LSFM18,23を使用して分析されました。このセットアップは、屈折率(RI)補正環を備えた12倍のカスタムメイド対物レンズを備えた2つのアームで構成されています。各対物レンズは照明アームと検出アームとして同時に機能し、0.16 cm3/hの体積速度で2つのチャンネルを同時に取得できます。試料ホルダーは一度に2つのサンドイッチを収納できるため、10時間で2つのスライスで4つのチャンネルを連続してイメージングすることができます。TDE蒸気は呼吸器系に軽度の毒性があるため、球面収差を避けるために、試料ホルダーは、石英カバーガラスとTDE溶液の両方のRI(1.46)と一致する91%v/vグリセロール/水溶液で満たされています。91%v / vグリセロール/水溶液は、粉塵汚染を避けるために3日ごとに交換する必要があります。したがって、当社のLSFMは、後処理18,23,29の後、3.6μmの等方性分解能で低光退色で試料を高速に取得することができます。生成された大量のデータは、自社開発のソフトウェアであるZetaStitcher(https://github.com/lens-biophotonics/ZetaStitcher)23,29を使用して、画像スタックの再スライスとスティッチングのために定義されたパイプラインを使用して処理されました。
SHORTはライトシート蛍光顕微鏡と組み合わせて使用しましたが、ラボの可用性と特定のアプリケーションに応じて、さまざまな種類の蛍光イメージング技術を取得に使用できます。例えば、共焦点顕微鏡25または2光子顕微鏡14を使用して、透明な試料を分析することができる。このタイプの分析は、スキャンベースのシステムであり、大きな組織領域の取得時間が非常に長いため、比較的少量のサンプルに推奨されます30。ライトシート蛍光顕微鏡は、より高速なイメージングと横方向と軸方向の分解能のデカップリングを実現することにより、大量の透明サンプルをイメージングするための好ましい方法です3,4,18,31,32,33。
要約すると、数十の死後ヒト脳切片の同時透明化、均質な共標識、および3D体積再構成のための迅速ハイスループットプロトコルについて説明しました。SHORTをLSFMイメージングおよび計算解析と組み合わせることで、ヒト脳の包括的な細胞センサスとプロテオミクス解析のための3次元データを取得することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言しています。
Acknowledgments
マサチューセッツ総合病院、A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging、放射線科のBruce Fischl氏に、この研究で分析されたヒト脳標本を提供していただいたことに感謝します。本プロジェクトは、欧州連合(EU)のホライズン2020研究・イノベーションフレームワークプログラム(Horizon 2020 Research and Innovation Framework Programme)から助成金契約第654148号(Laserlab-Europe)、欧州連合(EU)のHorizon 2020 Framework Programme for Research and Innovation(研究・イノベーションのためのホライズン2020フレームワークプログラム)から特定助成契約第785907号(Human Brain Project SGA2)および第945539号(Human Brain Project SGA3)から、米国国立衛生研究所総合病院コーポレーションセンター(National Institutes of Health)から助成金U01 MH117023で資金提供を受けました。 Euro-Bioimaging Italian Node(ESFRI研究インフラストラクチャ)の枠組みにおけるイタリア教育省から。最後に、この研究は「Fondazione CR Firenze」の協力を得て行われました。この作業の内容は著者の責任であり、必ずしも米国国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。 図 1 は BioRender.com で作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
References
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
- Richardson, D. S., et al.
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Lee, H., Park, J. -H., Seo, I., Park, S. -H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
- Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
- Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
- Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
- Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
- Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
- Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
- Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca's area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
- Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
- Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
- Keller, P. J., Dodt, H. -U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
- Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W.
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
- Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).
