Summary
Denne protokollen presenterer en analyse for modellering av forstoppelse i en alfa-synucleinbasert Drosophila-modell av Parkinsons sykdom.
Abstract
Ikke-motoriske symptomer ved Parkinsons sykdom (PD) er vanlige, vanskelige å behandle og svekker livskvaliteten betydelig. Et utbredt ikke-motorisk symptom er forstoppelse, som kan gå foran diagnosen PD i år eller til og med tiår. Forstoppelse har vært underutforsket i dyremodeller av PD og mangler spesifikke terapier. Denne analysen benytter en Drosophila-modell av PD der humant alfa-synuclein uttrykkes under en pan-neuronal driver. Fluer som uttrykker alfa-synuclein utvikler kjennetegnene til PD: tap av dopaminerge nevroner, motorisk funksjonsnedsettelse og alfa-synucleininneslutninger.
Denne protokollen skisserer en metode for å studere forstoppelse i disse fluene. Fluer settes på fluefôr med blått fargetilsetningsstoff over natten og overføres deretter til vanlig fôr dagen etter. De blir deretter flyttet til nye hetteglass med vanlig fluemat hver time i 8 timer. Før hver overføring beregnes prosentandelen blåfargede fekale flekker sammenlignet med de totale fekale flekkene på hetteglassveggen. Kontrollfluer som mangler alfa-synuclein utviser alle de blå fargestoffene timer før fluer som uttrykker alfa-synuclein. I tillegg kan passasjen av blåfarget mat fra tarmen overvåkes med enkel fotografering. Enkelheten i denne analysen gjør det mulig å bruke den i fremadrettede genetiske eller kjemiske skjermer for å identifisere modifikatorer av forstoppelse i Drosophila.
Introduction
Parkinsons sykdom (PD) er en progressiv nevrodegenerativ lidelse karakterisert klinisk ved tilstedeværelse av motoriske symptomer som bradykinesi, stivhet og tremor, noe som resulterer i betydelig sykelighet1. Patologisk er PD definert ved tap av dopaminerge nevroner i substantia nigra og feilfolding av alfa-synuclein, noe som fører til dannelse av Lewy-legemer og Lewy-nevritter. Patogenesen av PD er fortsatt dårlig forstått, sannsynligvis som følge av et komplekst samspill mellom genetiske og miljømessige faktorer 2,3. For tiden er sykdomsmodifiserende terapier utilgjengelige, muligens delvis på grunn av det avanserte stadiet av patologi som er tilstede på diagnosetidspunktet. Studier har vist at mer enn 60% av dopaminerge nevroner i substantia nigra allerede har gått tapt ved utbruddet av motoriske symptomer, understreker behovet for å utforske potensielle biomarkører for tidlig sykdomsdeteksjon4. En slik klinisk biomarkør er forstoppelse, som er vanlig hos PD-pasienter 5,6 og kan gå foran motorisk symptomdebut med år eller til og med tiår.
Til tross for PDs kliniske definisjon basert på motoriske symptomer, er obstipasjon et av flere ikke-motoriske symptomer som er mer utfordrende å behandle symptomatisk og gir betydelig svekkelse av pasientenes livskvalitet7. Endringer i tarm-hjerneaksen, som representerer toveis kommunikasjon mellom hjernen og det enteriske nervesystemet, har vært involvert i PD-patogenesen. Alfa-synuclein-aggregater er funnet i vevsprøver fra mage-tarmkanalen hos PD-pasienter8, og dyremodeller tyder på at alfa-synucleinaggregater i det enteriske nervesystemet sprer seg på en prionlignende måte til sentralnervesystemet9. I tillegg viser PD-pasienter abnormiteter i tarmmikrobiomet10 og kan oppleve overdreven tarmbetennelse11. Forstoppelse i PD har blitt understudert, med få rapporterte modeller av Parkinsons-assosiert forstoppelse hos fluer12,13 eller gnagere14,15.
Denne analysen benytter en Drosophila-modell av PD der fluer uttrykker det humane alfa-synuclein-genet under kontroll av en pan-neuronal driver, n-synaptobrevin. Disse fluene viser alle kjennetegnene til PD, inkludert alfa-synucleinaggregering, motorisk dysfunksjon og aldersrelatert nevrodegenerasjon, noe som resulterer i tap av dopaminerge nevroner16,17. Tidligere studier har introdusert måling av fekal produksjon i fluer for å vurdere tarmdysfunksjon, kvantifisering av fluefekal materie og sammenligning av ekskretamengder over ulike genetiske linjer for å avsløre funksjonelle forskjeller i fordøyelsessystemet 18,19,20. Her demonstrerer vi forstoppelsesanalysen ved hjelp av fluer som uttrykker humant alfa-synuclein. Dette enkle, men verdifulle verktøyet gjør det mulig å studere et viktig ikke-motorisk symptom på PD.
Protocol
Fluer brukt i denne analysen: kontroll: nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+; alfa-synuclein fluer: nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-synuclein/+; 1- og 10-dager etter eclosion; hann- og hunnfluer (parrede og uparrede) fluer (se materialfortegnelse).
1. Tilberede den fargede fluematen
- Bland blå, myk gelpasta, konditorfarge (se materialtabell) med destillert vann i forholdet 1: 1 (v / v).
MERK: Bruk kommersiell konditorfarge som bare inneholder ikke-absorberbare fargestoffer, da noen blå fargestoffer har vist seg å ha nevrobeskyttende effekter21. - Mikrobølgeovn hetteglassene med flueføde som består av standard maismel-agar (se materialfortegnelse) i intervaller på 10-15 sekunder til maten har smeltet til væske eller slam. Ikke la maten koke over.
- Legg fargestoffblandingen til hvert hetteglass med mat for å oppnå en jevn farge mellom hetteglassene. Bland i fargestoffblandingen til maten er homogent blå (figur 1). Tilsett en mengde av den blå fargestoffblandingen slik at fargen på maten er mettet, og det er ingen variasjon i farge mellom hetteglassene.
MERK: Dette trinnet må gjøres kort tid etter mikrobølgeovn, da maten stivner raskt. Hvis maten stivner, mikrobølgeovn hetteglasset igjen. - La hetteglassene med farget mat lufttørke til det stivner. Legg et tynt papirhåndkle over åpningen på hetteglasset mens du tørker for å forhindre at hjemløse fluer lander i hetteglasset.
- Når maten er avkjølt og størknet, overfører du fluene som skal brukes til testing til den blå maten.
MERK: For smale hetteglass (25 mm) anbefales det at 9-14 fluer tilsettes hvert hetteglass. For brede hetteglass (28,5 mm) anbefales det at 10-20 fluer tilsettes hvert hetteglass. Fluer er ikke adskilt etter kjønn eller parringserfaring og inkluderer en blandet populasjon av mannlige og kvinnelige fluer, med både parrede og uparrede kvinner. - Inkuber hetteglassene med fluer over natten ved 25 °C i en kuvøse.
2. Avbilde fluene
MERK: Dette trinnet er valgfritt (figur 2).
- Neste morgen (tid 0), bedøve representanten flyr med karbondioksid i 60 s. Plasser flua slik at den ventrale siden vender oppover.
- Bruk et kamera (se materialfortegnelse), ta bilder av fluene hver time for å visualisere mengden blå mat som er igjen i fordøyelsessystemet.
MERK: Disse fluene bør ikke brukes til den kvantitative delen av analysen (trinn 3), da anestesi kan påvirke resultatene. - På hver time, bedøve og bilde nye fluer.
3. Utføre forstoppelsesanalysen
- Overfør de resterende (ikke-bedøvede) fluene til hetteglass med standard Drosophila mat. Nummer hvert hetteglass.
- La fluene ligge i inkubatoren ved 25 °C i 60 minutter.
- Etter 60 min, overfør fluene til nye hetteglass med standard Drosophila mat. Start dataopptak fra det første settet med hetteglass.
- Tegn en stiplet strek nedover lengden på hetteglasset for å markere punktet hvor tellingen skal starte.
- Tell antall små, runde prikker manuelt på veggen i hvert hetteglass. Ikke tell prikker på maten eller proppen i hetteglasset.
- Begynn med å telle antall blå prikker på veggen til hvert hetteglass.
- Tell antall ugjennomsiktige, fargeløse prikker på veggen i hvert hetteglass.
MERK: Hver prikk er flueekskrement, som er en kombinasjon av urin og avføring22. Noen ganger kan en flue gå over ekskrementet og legge igjen et spor, i så fall teller du bare den opprinnelige prikken, ikke hvert enkelt merke i stien. - Registrer forholdet mellom blå prikker og totalt antall prikker for hvert hetteglass.
MERK: Totalt antall prikker er antall blå prikker på veggen til et hetteglass lagt til antall fargeløse prikker på veggen i det samme hetteglasset. Dette vil bli brukt til å beregne prosentandelen av blå avføring per time. - Gjenta trinn 3.2–3.8 sju ganger til, og samle inn data hver time over totalt 8 timer.
4. Dataanalyse
- Graf prosentandelen blå avføring per time for hver tilstand.
- Sammenlign dataene mellom betingelsene.
MERK: Statistisk signifikans kan bestemmes på 3 måter: ved å sammenligne individuelle tidspunkter mellom forhold, ved å måle linjens helning over tid, eller ved å sammenligne arealet under kurven.
Representative Results
Fordi Drosophila magen er gjennomsiktig, kan blå mat visualiseres inne i tarmen i levende bedøvede fluer. Kvalitative forskjeller i tarmtransitt kan vurderes ved å ta bilder av fluene på ulike tidspunkter. Hos kontrollfluer blir den blå maten raskt utvist, mens hos alfa-synuclein fluer forblir den blå maten tilstede i tarmen så lenge som 8 timer (figur 2).
Alfa-synucleinfluene viser aldersrelatert nevrodegenerasjon, med en robust fenotype som utvikler seg innen 10 dager etter eclosion10. På dette tidspunktet ses forskjeller i tarmtransittid sammenlignet med kontrollfluer ved å sammenligne individuelle tidspunkter mellom forhold, ved å måle linjens helning over tid, eller ved å sammenligne arealet under kurven (figur 3). Det observeres ingen forskjeller i tarmpassasje mellom kontroll- og alfa-synucleinfluer på et tidligere tidspunkt, dag 1 etter eclosion, når motorisk dysfunksjon og nevrodegenerasjon heller ikke er til stede (figur 4).
Figur 1: Hetteglass med blå mat og avføringsflekker. (A) Alle hetteglass inneholder blåfarget mat. På dette tidspunktet har fluer nettopp blitt introdusert til den blå maten, og ingen blå avføring er synlig. (B) Et hetteglass etter at w1118 fluer har blitt overført til fersk mat i 1 time, og deretter fjernet. Venstre innfelling forstørres i (C), og høyre innfelling forstørres i (D). (C) Et område som er ekskludert fra analysen på grunn av tilstedeværelse av fluemat. (D) Forstørret visning av fekale flekker, som indikerer blå (svarte piler) og ikke-blå flekker (gule piler). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Visualisering av tarmtransitt av den fargede maten over tid. Kontrollfluer og fluer som uttrykker humant alfa-synuclein i nevroner ble igjen på blåfarget mat over natten og deretter overført til standardmedier neste dag. Fluer ble serielt overført til ny standard fluemat hver time. Representative bilder ved tidspunkt null og 2, 4, 6 og 8 timer etter overføring vises. Kontroll- og alfa-synucleinfluer viser lignende flekker av blå mat i tarmen ved tid null. Ved senere tidspunkter har kontrollfluene mindre blå mat enn alfa-synuclein fluer, og all blå mat er borte ved 8 timers tid i kontrollfluer. Genotypene for hvert fluesnøre er som følger: kontroll (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); alfa-synuclein fluer (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-synuclein/+). Kvinnelige fluer brukes til avbildning på grunn av deres lettere evne til å visualisere magen på grunn av deres større størrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Obstipasjonsanalyse på dag 10 etter eclosion fluer. Kontrollfluer og fluer som uttrykker humant alfa-synuclein i nevroner ble liggende på blåfarget mat over natten og deretter overført til vanlig fluemat neste dag. Fluer ble serielt overført til nye standardmedier hver time. (A) Prosent blått avføring per time. Feilfelt representerer standardavvik. N = 6 hetteglass per genotype; Hvert hetteglass inneholdt 9-14 fluer. Alle statistiske analyser ble utført i Graphpad Prism (se Materialliste). Statistisk signifikans ved hvert tidspunkt ble beregnet ved hjelp av toveis ANOVA. Linjens helning og differansen mellom skråningene ble beregnet ved hjelp av den lineære regresjonsanalysen. (B) Arealet under kurven for hver genotype ble beregnet. Feilfelt representerer standardavvik. Genotypene for hvert fluesnøre er som følger: kontroll (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); alfa-synuclein fluer (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-synuclein/+). Både hann- og hunnfluer inngår i omtrent like mange. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Obstipasjonsanalyse dag 1 etter eclosion fluer. Kontrollfluer og fluer som uttrykker humant alfa-synuclein i nevroner ble igjen på blåfarget mat over natten og deretter overført til standardmedier neste dag. Fluer ble serielt overført til ny standard fluemat hver time. (A) Prosent blått avføring per time. Feilfelt representerer standardavvik. N = minimum 5 hetteglass per genotype; Hvert hetteglass inneholdt 9-14 fluer. Alle statistiske analyser ble utført i Graphpad Prism. Statistisk signifikans ved hvert tidspunkt ble beregnet ved hjelp av toveis ANOVA. Linjens helning og differansen mellom skråningene ble beregnet ved hjelp av den lineære regresjonsanalysen. (B) Arealet under kurven for hver genotype ble beregnet. Feilfelt representerer standardavvik. Genotypene for hvert fluesnøre er som følger: kontroll (nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); alfa-synuclein fluer (nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alfa-synuclein/+). Både hann- og hunnfluer inngår i omtrent like mange. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Det er flere trinn i denne protokollen som vil hjelpe til med vellykket gjennomføring av analysen. For det første er det viktig å sikre at tidsintervallene mellom hver runde for hvert hetteglass er konsistente gjennom hele eksperimentet. Merking av hetteglassene med tall vil bidra til å unngå behovet for lange genotypebeskrivelser, noe som sparer tid. I tillegg er det avgjørende at metoden for å telle avføring22 forblir konsistent gjennom hele forsøket. Mens blått avføring er synlig på maten og hetteglasspluggen, er fargeløs avføring ikke. Tell derfor ikke de blå prikkene på maten eller hetteglasspluggen.
Med atferdsanalyser er det alltid en mulighet for inkonsekvenser i resultatene på grunn av svingninger i flueoppførsel eller ukjente variabler som påvirker analysen. Vi anbefaler å bruke samme Drosophila-medium , samme matfargestoff og samme merke av hetteglass for alle eksperimenter. Interessant nok ble det i flere forsøk observert at fluer har en tendens til å gjøre sitt fornødne sjeldnere tidlig på ettermiddagen, muligens på grunn av fluenes døgnrytme23. Imidlertid er denne oppførselen konsistent i både kontrollfluer og fluer som uttrykker alfa-synuclein, så det bør ikke gi bekymringer.
Hvis fluene ikke skiller ut blått avføring i begynnelsen av analysen, er det mulig at fargestoffet som brukes ikke er pigmentert nok. I dette tilfellet kan man øke forholdet mellom fargestoff og destillert vann tilsvarende. Det er også mulig at når det bare er en liten mengde blå mat igjen i fluens fordøyelseskanal, kan det være vanskelig å avgjøre om avføringen er lyseblå eller fargeløs. Når dette skjer, vil det å plassere et hvitt ark bak hetteglasset bidra til å bestemme fargen på fekalprikken. Selv om avføringen er veldig lyseblå, er det best å registrere det som blått avføring i stedet for fargeløst avføring.
En begrensning av denne analysen er at den krever manuell telling av fekale flekker. For å forbedre potensialet for screening med høy gjennomstrømning, kan denne protokollen endres i fremtiden for å muliggjøre automatisert kvantifisering av blå fekale flekker produsert av individuelle fluer i flerbrønnsplater. En annen begrensning er at selv om alfa-synuclein-modellen har potensial til å bli utviklet til en prodromalmodell av PD, er det ennå ikke identifisert et optimalt tidspunkt hvor forstoppelse er tilstede uten nevrodegenerasjon.
Oppsummert gir denne metoden en enkel, grei tilnærming til modellering av forstoppelse, et understudert ikke-motorisk PD-symptom, i en Drosophila-modell av PD.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner Dr. Mel Feany ved Brigham and Women's Hospital og Harvard Medical School for den vennlige gaven av kontrollen og alfa-synuclein som uttrykker Drosophila-linjer . Vi anerkjenner følgende kilder til tilskuddsstøtte til Dr. Olsen: NINDS K08, American Parkinson Disease Association George C. Cotzias Fellowship, Department of Defense Parkinson's Disease Early Investigator Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1400 g sucrose | MP Biomedicals | 904713 | |
| 1800 g dextrose | MP Biomedicals | 901521 | |
| 2884 g yeast | MP Biomedicals | 903312 | |
| 428 g agar | Fisher Scientific | 10253156 | |
| 4600 mL molasses | Grandma's Molasses | 7971942 | |
| 68 L water | N/A | N/A | |
| 680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol) | |||
| 6864 g cornmeal | Pearl Milling | 125045 | |
| 800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water) | |||
| cellSens Standard software | Olympus | N/A | |
| Ethanol | Pharmco-Aper | 111ACS200 | |
| Flugs for wide plastic vials | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene | Genesee Scientific | 32-117 | |
| Graphpad Prism | GraphPad | N/A | Version 9.5.1 |
| Olympus DP23 camera | Olympus | N/A | |
| Olympus SZX12 Stereo Microscope | Olympus | N/A | |
| Phosphoric Acid | Fisher Scientific | S25470A | |
| Propionic Acid | Fisher Scientific | A258 - 500 | |
| Soft gel paste food color, Royal blue | AmeriColor | 202 | |
| Tegosept | Apex | 20-258 | |
| Drosophila Stocks | |||
| nSyb-QF2, nSyb-Gal4 | All lines provided by Dr. Mel Feany | N/A | Lines are available directly from Dr. Feany |
| nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein | N/A | ||
| w1118 | N/A |
References
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- Bloem, B. R., Okun, M. S., Klein, C.
- Ball, N., Teo, W. P., Chandra, S., Chapman, J.
- Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease. NPJ Parkinsons Dis. 7 (1), 116 (2021).
- Ueki, A., Otsuka, M. Life style risks of Parkinson's disease: association between decreased water intake and constipation. J Neurol. 251 (Suppl 7), vII18-vII23 (2004).
- Houser, M. C., Tansey, M. G. The gut-brain axis: is intestinal inflammation a silent driver of Parkinson's disease pathogenesis. NPJ Parkinsons Dis. 3, 3 (2017).
- Pfeiffer, R. F.
- Klann, E. M., et al. The Gut-brain axis and its relation to parkinson's disease: A review. Front Aging Neurosci. 13, 782082 (2021).
- Mukherjee, A., Biswas, A., Das, S. K.
- Yemula, N., Dietrich, C., Dostal, V., Hornberger, M. Parkinson's disease and the gut: symptoms, nutrition, and microbiota. J Parkinsons Dis. 11 (4), 1491-1505 (2021).
- Chen, S. J., Lin, C. H. Gut microenvironmental changes as a potential trigger in Parkinson's disease through the gut-brain axis. J Biomed Sci. 29 (1), 54 (2022).
- Hawrysh, P. J., et al. PRKN/parkin-mediated mitophagy is induced by the probiotics Saccharomyces boulardii and Lactococcus lactis. Autophagy. 19 (7), 2094-2110 (2023).
- Liu, W., Lim, K. L., Tan, E. K. Intestine-derived α-synuclein initiates and aggravates pathogenesis of Parkinson's disease in Drosophila. Transl Neurodegener. 11 (1), 44 (2022).
- Rota, L., et al. Constipation, deficit in colon contractions and alpha-synuclein inclusions within the colon precede motor abnormalities and neurodegeneration in the central nervous system in a mouse model of alpha-synucleinopathy. Transl Neurodegener. 8, 5 (2019).
- Diwakarla, S., et al. ATH434 reverses colorectal dysfunction in the A53T mouse model of Parkinson's disease. J Parkinsons Dis. 11 (4), 1821-1832 (2021).
- Ordonez, D. G., Lee, M. K., Feany, M. B. α-synuclein Induces mitochondrial dysfunction through spectrin and the actin cytoskeleton. Neuron. 97 (1), 108.e6-124.e6 (2018).
- Olsen, A. L., Feany, M. B. Glial α-synuclein promotes neurodegeneration characterized by a distinct transcriptional program in vivo. Glia. 67 (10), 1933-1957 (2019).
- Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis. Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).
- Urquhart-Cronish, M., Sokolowski, M. B. Gene-environment interplay in Drosophila melanogaster: chronic nutritional deprivation in larval life affects adult fecal output. J Insect Physiol. 69, 95-100 (2014).
- Popovic, R., et al. Blocking dPerk in the intestine suppresses neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson's disease. Cell Death Dis. 14 (3), 206 (2023).
- Poteet, E., et al. Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives. PLoS One. 7 (10), e48279 (2012).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Schlichting, M., et al. A neural network underlying circadian entrainment and photoperiodic adjustment of sleep and activity in Drosophila. J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).
