Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטת דפוס תאים ללא דיו, ללא תוויות, שאינה תלויה במצע ובעלת תפוקה גבוהה המבוססת על אפקט ארכימדס מגנטי.
Abstract
תבניות תאים, המאפשרות שליטה מדויקת במיקום התא, מהוות יתרון ייחודי בחקר התנהגות התא. בפרוטוקול זה מוצגת אסטרטגיית תבנית תאים המבוססת על אפקט ארכימדס מגנטי (Mag-Arch). גישה זו מאפשרת בקרה מדויקת של פיזור התאים ללא שימוש בחומרי דיו או חלקיקי תיוג. על ידי החדרת מגיב פאראמגנטי כדי לשפר את הרגישות המגנטית של מדיום תרבית התא, תאים נדחים על ידי מגנטים ומסדרים את עצמם לתבנית משלימה לערכות המגנטים הממוקמות מתחת למצע המיקרופלואידי.
במאמר זה, נהלים מפורטים עבור דפוסי תאים באמצעות אסטרטגיה מבוססת Mag-Arch מסופקים. מוצעות שיטות לעיצוב סוגי תאים בודדים, כמו גם סוגי תאים מרובים לניסויי תרבית משותפת. בנוסף, ניתנות הוראות מקיפות לייצור התקנים מיקרופלואידים המכילים תעלות לתבניות תאים. השגת תכונה זו באמצעות שיטות מקבילות היא מאתגרת אך ניתן לעשות זאת בצורה פשוטה וחסכונית. שימוש בתבניות תאים מבוססות Mag-Arch מצייד את החוקרים בכלי רב עוצמה למחקר במבחנה .
Introduction
תבניות תאים מתפתחות לטכנולוגיה אינטואיטיבית ורבת עוצמה למחקרי מבחנה 1. על ידי מניפולציה של מיקומי תאים בלוחות תרבית, הוא מספק פתרונות למגוון ניסויים, כולל נדידת תאים2, תרבית משותפת רב-תאית ביומימטית3, הרכבת אורגנואידים4, מחקרים ביו-חומריים5 ועוד. ברוב המקרים, שיטה ללא דיו וללא תוויות מועדפת לעיצוב תאים מכיוון שהיא מציעה קלות תפעול ויכולת קיום גבוהה של תאים לחקירות הבאות.
אפקט מאג-ארץ' הוא תופעה פיזיקלית שבה עצמים דיאמגנטיים בנוזלים פאראמגנטיים נוטים לנוע לעבר אזורים בעלי שדות מגנטיים חלשים6. תאים חיים הם דיאמגנטיים באופן טבעי, בעוד שמדיה של תרבית תאים יכולה להפוך לפאראמגנטית על ידי הוספת אלמנטים פאראמגנטיים מסיסים, כגון gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA), המשמש בדרך כלל בעירוי תוך ורידי בדימות תהודה מגנטית גרעינית כחומר ניגוד7. כתוצאה מכך, תאים צפויים להידחות על ידי התווך הפאראמגנטי הסובב אותם ולנוע לעבר אזורים שבהם השדות המגנטיים חלשים יותר8. שדה מגנטי בתבנית יכול להיווצר בקלות באמצעות קבוצה של מגנטים ניאודימיום. באופן אידיאלי, תבניות תאים מורכבות בניגוד לתבניות המגנט. מבחינה טכנית, שיטה זו מוגדרת כשיטה ללא תוויות מכיוון שהמגיב הנוסף היחיד, Gd-DTPA, נשאר בסביבה החוץ תאית ואינו נקשר לתאים. לפיכך, ניתן להימנע בקלות מהשפעות פוטנציאליות על תרבית תאים עוקבת על ידי החלפת מדיום התרבית. בהשוואה לשיטות אחרות 1,3,9,10, האסטרטגיה המבוססת על Mag-Arch אינה דורשת רכיבי ביו-דיו או יישום של חלקיקים ספציפיים כדי לתייג באופן חיובי את התאים. יתר על כן, הוכח שהוא עובד על מצעים מרובים להידבקות תאים והוא מסוגל לעצב תאים בעלי תפוקה גבוהה4.
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לתבניות תאים בשיטה המבוססת על Mag-Arch, המכסה כל דבר, החל מייצור התקנים ועד התאמת תבנית התא. בנוסף לדפוסים שהדגמנו, משתמשים יכולים ליצור בקלות תבניות תאים שונות באמצעות מגנטים ופתרון Gd-DTPA. יתר על כן, פרוטוקולים להרכבת דפוסי תרבית משותפת מורכבים ומניפולציה של תאים בשבבים מיקרופלואידים סגורים, מסופקים גם כן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הרכבת ערכות המגנטים
- הרכיבו את ערכות המגנטים לתבניות פסים.
- בחרו מגנטים מלבניים שטוחים, כפי שמתואר באיור 1A. מידות המגנטים המלבניים המשמשים להדגמה זו הן 1.5 מ"מ × 10 מ"מ × 35 מ"מ (עובי × גובה × אורך) (ראה טבלת חומרים). עובי המגנטים קובע את המרווחים בין פסי התא.
- חתכו לוחות סיליקון בעובי 2 מ"מ (ראו טבלת חומרים) למלבנים בקוטר 2 מ"מ × 8 מ"מ × 30 מ"מ. ודא כי שני הממדים האחרונים של לוחות סיליקון אלה הם מעט קטנים יותר מאלה של מגנטים מלבניים שהוזכרו לעיל כדי לייעל את ההרכבה. עובי לוחות הסיליקון קובע את רוחב פסי התא.
- הרכיבו את המגנטים המלבניים ואת לוחות הסיליקון שכבה אחר שכבה, כפי שמודגם באיור 1A. כל סט מגנטים מורכב מ-4 מגנטים ו-3 לוחות סיליקון. ודא שהקטבים של כל מגנט סמוך מנוגדים, כך שערכות המגנטים יוכלו להתיישר באופן אוטומטי בשל כוח המשיכה הפנימי.
- יש לעקר את המגנטים לפני השימוש.
הערה: מומלץ לשטוף את ערכות המגנט במים טהורים ולאחר מכן לטבול אותן באתנול 75% למשך 10 דקות. הממדים הכוללים של ערכות מגנטים אלה הם 12 מ"מ × 10 מ"מ × 35 מ"מ, שנועדו להתאים ללוחות סטנדרטיים של תרבית תאים 6 בארות.
- הרכיבו את ערכות המגנטים עבור תבניות מערך נקודות
- בחרו מגנטים גליליים מיניאטוריים, כפי שמוצג באיור 1B. מידות המגנטים הגליליים המשמשים להדגמה זו הן Φ1.5 מ"מ × 10 מ"מ (קוטר × גובה), ממוגנטים בכיוון הצירים.
- הרכיבו את המגנטים הגליליים כפי שמצוין באיור 1B. ודאו שכל סט מגנטים מורכב מ-36 מגנטים גליליים המסודרים ברשת של 6 × 6. כמו כן, ודא שהקטבים של כל מגנט סמוך מנוגדים כדי לאפשר לערכות המגנטים להתיישר באופן אוטומטי בשל כוח המשיכה הפנימי.
- יש לעקר את המגנטים לפני השימוש, באותו הליך כמו בשלב 1.1.4. הממדים הכוללים של ערכות מגנטים אלה הם 9 מ"מ × 10 מ"מ × 9 מ"מ, שנועדו להתאים ללוחות סטנדרטיים של תרביות תאים בנות 6 בארות.
2. עיצוב תאים על שקופיות זכוכית
- הכינו את מכשיר תרבית התא.
- השתמשו בלוחות סיליקון בעובי 2 מ"מ ליצירת תבניות סיליקון. השתמש באגרוף כדי ליצור חור מלבני של 1 ס"מ × 1 ס"מ בצלחת. חתכו את לוח הסיליקון סביב החור כדי ליצור תבנית עגולה (קוטר = 25 מ"מ) עם החור במרכז, כפי שמתואר באיור 1C.
- נקו היטב את תבניות הסיליקון באמצעות חומר ניקוי אולטראסוני. לעקר את התבניות על ידי שטיפתן במים טהורים למשך 10 דקות, ולאחר מכן להחליף את המים באתנול 75% למשך 10 דקות נוספות. לבסוף, יבש את התבניות בקופסת סטריליזטור ב 65 ° C במשך 60 דקות.
- חברו את תבנית הסיליקון המעוקרת למגלשה של תא זכוכית עגול בקוטר 25 מ"מ ולחצו עליה בעדינות כך שהסיליקון יידבק לזכוכית, כפי שמוצג באיור 1C. למתקן תרבית התאים שיתקבל יהיה חלק תחתון מזכוכית וחלל תרבית של 200 מיקרוליטר. מידות המכשיר הן Φ25 מ"מ × 2.15 מ"מ, מה שהופך אותו מתאים ללוחות תרבית תאים סטנדרטיים של 6 בארות.
הערה: ניתן להחליף את התקן תרבית התאים המתואר לעיל בצלחות פטרי אחרות בעלות דפנות תחתונות דקות יותר מ-0.5 מ"מ, כגון כלים קונפוקליים. - הניחו את ערכות המגנטים על צלחת בעלת 6 בארות. פינצטה לא מגנטית מומלצת לתפעול קל.
הערה: כל השלבים הבאים צריכים להתבצע בתנאים סטריליים מנקודה זו ואילך עד התצפית על דפוסי התא. - מקמו את מכשיר תרבית התאים על גבי המגנט שנקבע בבאר של צלחת 6 הקידוחים. ודא שהתקן תרבית התאים ממוקם אופקית, ושהחלק התחתון נמצא במגע הדוק עם ערכת המגנטים.
- הכינו את מדיום תרבית התאים המכיל Gd-DTPA
- הכינו הזרקת Gd-DTPA זמינה מסחרית (ראו טבלת חומרים), בדרך כלל בריכוז של 500 mM. לדלל את ההזרקה על ידי הוספת 30 μL של הזרקת Gd-DTPA ל 470 μL של מדיום תרבית תאים מלאה כדי להשיג ריכוז יעד של 30 mM.
הערה: בהתאם לתקנות ולזמינות המקומיות, חומרי ניגוד אחרים מבוססי גדוליניום (GBCA) עם ריכוז יעד זהה עשויים להניב תוצאות דומות11.
- הכינו הזרקת Gd-DTPA זמינה מסחרית (ראו טבלת חומרים), בדרך כלל בריכוז של 500 mM. לדלל את ההזרקה על ידי הוספת 30 μL של הזרקת Gd-DTPA ל 470 μL של מדיום תרבית תאים מלאה כדי להשיג ריכוז יעד של 30 mM.
- צור את תבניות התא.
- קצור תאים לצורך יצירת תבניות. בהדגמה זו נעשה שימוש בתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs, ראו טבלת חומרים) לצורך דפוסים (איור 2). צנטריפוגו את התאים למשך 5 דקות במהירות של 200 x גרם (בטמפרטורת החדר) כדי לאסוף אותם מהמתלה ולהשהות אותם מחדש בתווך המכיל Gd-DTPA. ספור את צפיפות התא.
- התאם את צפיפות התאים לכ- ~2 × 105 תאים/מ"ל עם תווך המכיל Gd-DTPA. ערבבו בעדינות את תרחיף התא והוסיפו 200 μL לחלל של כל תבנית תרבית תאים ליצירת משטח נוזלי מלא שוליים.
- מעבירים בזהירות את הצלחת לאינקובטור תרבית תאים ודגרים במשך 3-6 שעות עד שהתאים נצמדים היטב למצע. הימנע מטריקת דלת האינקובטור כדי למנוע הפרעה להרכבה של תבניות תאים. עבור תאים עם שיעורי הידבקות ירודים, טיפול לילה עם GBCAs הוא בדרך כלל בטוח12.
- דפוס תאים נחשב שלם כאשר תאים נצמדים לתחתית החלל של התקן תרבית התא. החלף את המדיום המכיל Gd-DTPA במדיום תרבית שלם.
- הסר את התקן תרבית התאים ממערכת המגנטים. אפשר להתבונן מיד בתבנית התא או להעביר את המכשיר לצלחת תרבית חדשה להמשך טיפוח.
3. דפוס תרבות משותפת על ידי מגנט הצידה: ייצור התבנית הנעה
הערה: ההליך הבא מוצג כדי לנצל את דפוסי התאים מבוססי Mag-Arch ולבחון את האפשרות של יישומים נוספים.
- הכן את ההתקן לעיצוב תאי פסים לפי שלבים 1 ו-2. עם זאת, הפחיתו את צפיפות התא ל-1 × 105 תאים/מ"ל והחליפו את לוחות הסיליקון המפרידים בין המגנטים למגנטים דקים יותר, מה שהופך כל תבנית תא פס לדקה יותר.
הערה: הדבר מספק שטח מספיק להנחת תאים מרובים בתבניות פסים. כהפניה, אנו ממליצים להשתמש בלוחות סיליקון 1 מ"מ במקום 2 מ"מ כדי להפריד בין המגנטים. - תבנית סוג התאים הראשון כפי שמודגם בשלבים 2.2-2.3. שלב זה דורש גם 3-6 שעות עבור חיבור לתא.
הערה: כדי להבחין בין סוגי תאים שונים במערכת התרבית המשותפת, משתמשים יכולים לתייג תאים בצבעים פלואורסצנטיים כגון DiI, DiD או עוקבי תאים (CMTPX, CMFDA, CMAC וכו') לפני יצירת תבניות. לדוגמה, עבור צביעת DiI ו- DiD, הוסף 1 μL של תמיסת המלאי (10 mM) (ראה טבלת חומרים) לכל 1 מ"ל של מדיום ללא FBS וערבב היטב כדי לקבל פתרון עובד. החלף את מדיום התרבית בפתרון העבודה לכיסוי תאים דבקים. לאחר הדגירה במשך 30 דקות ושטיפה עם PBS שלוש פעמים, להמשיך עם קצירת תאים. - לאחר עיצוב סוג התאים הראשון, הזיזו את מכשיר תרבית התאים 1 מ"מ מהמגנטים למטה ימינה, כפי שמודגם באיור 3Aii.
- שטפו בעדינות את מגלשות הזכוכית עם 200 μL של PBS פעמיים. הימנע מלתת לשקופיות להתייבש.
- עצב את סוג התאים השני באותו אופן כפי שמודגם בשלבים 2.2-2.3.
- הזיזו את מכשיר תרבית התאים 1 מ"מ מהמגנטים למטה ימינה, כפי שמודגם באיור 3Aiii, ושטפו שוב את שקופיות הזכוכית עם 200 מיקרוליטר PBS. עצב את סוג התאים השלישי באותו אופן כפי שמודגם בשלבים 2.2-2.3.
- לאחר עיצוב כל סוגי התאים, שטפו בעדינות את שקופיות הזכוכית עם 200 μL של PBS פעמיים והוחלפו במדיום תרבית תאים שלם.
- הסר את התקן תרבית התאים ממערכת המגנטים. לאחר מכן ניתן להתבונן בתבנית התא או להעביר את המכשיר לצלחת תרבית חדשה להמשך טיפוח.
4. דפוס תרבות משותפת על ידי התאמת הריכוז של Gd-DTPA
הערה: GBCAs אינם משפיעים באופן משמעותי על הידבקות תאים או על גדילה לאחר מכן בריכוזי עבודה (≤75 מילימול). בנוסף, דפוסי התא מושפעים מריכוז Gd-DTPA: ריכוזים גבוהים יותר גורמים לתבניות תאים קטנות / דקות יותר. לכן, ניתן ליצור מערכות תרבות משותפת פשוט על ידי התאמת הריכוז של Gd-DTPA. דוגמה זו מדגימה תבניות של מערכים מעגליים קונצנטריים.
- עצב את סוג התאים הראשון כפי שמודגם בשלבים 2.2-2.3 באמצעות מגנטים גליליים זעירים משלב 1.2. תייג את התאים בצבעים פלואורסצנטיים כגון DiI, DiD או עוקבי תאים (ראה שלב 3) לפני קצירתם כדי להבחין בין סוגי תאים שונים במערכת התרבית המשותפת.
הערה: יש צורך בריכוז גבוה יותר של Gd-DTPA (50 מ"מ במקום 30 מ"מ) ובצפיפות תאים נמוכה יותר, בערך 1 × 105 תאים/מ"ל. - לאחר עיצוב מערך התאים הראשון, שטפו בעדינות את שקופיות הזכוכית עם 200 μL של PBS פעמיים. הימנעו מלאפשר למגלשות להתייבש.
- עצב את סוג התאים השני לאחר אותו הליך כמו קודם. שמרו על מגלשות הזכוכית יחסית ללא תנועה על המגנטים כדי למנוע נקע. מומלץ לחבר פלטת סיליקון עם שקע המתאים למערכות המגנטים אל מתחת לפני השטח של מגלשת הזכוכית.
הערה: כאן, יהיה צורך בריכוז נמוך יותר של Gd-DTPA (20 מילימטר במקום 30 מילימטר) כך שתבניות התא השני צפויות להיות גדולות יותר מהראשון, כפי שמודגם באיור 3B. - לאחר עיצוב כל סוגי התאים, שטפו בעדינות את שקופיות הזכוכית עם 200 μL של PBS פעמיים והחליפו את המדיום במדיום תרבית תאים שלם.
- הסר את התקן תרבית התאים ממערכת המגנטים. לאחר מכן ניתן להתבונן בתבנית התא או להעביר את המכשיר לצלחת תרבית חדשה להמשך טיפוח.
5. תבנית תאים בשבב מיקרופלואידי
הערה: השיטה המבוססת על Mag-Arch הוכחה כפועלת בתאים צרים סגורים במחקר הקודם שלנו8. הנה דוגמה לתבניות של מערכי נקודות בתעלה מיקרופלואידית.
- ייצור שבב microfluid
- התאמה אישית של תבניות 40 מ"מ × 75 מ"מ × 20 מ"מ פוליטטרה-פלואוראתילן (PTFE) (ראו טבלת חומרים) המכילות חלל מלבני של 24 מ"מ ×-50 מ"מ ×-8 מ"מ, כפי שמודגם באיור 4A.
- משטחים פלטת סיליקון בעובי 0.5 מ"מ. חתכו את לוחות הסיליקון בהתאם לצורת תעלת הנוזל, בעלת חלל מלבני של 15 מ"מ × 20 מ"מ ×-0.5 מ"מ עם אזורי חיץ משולשים הן בצד הכניסה והן בצד היציאה, כפי שמודגם באיור 4A,B.
- התאם אישית לוחות זכוכית מלבניים בגודל 40 מ"מ × 75 מ"מ. נקו את לוחות הזכוכית עם פלסמת אוויר למשך 30 שניות.
- מיד לאחר ניקוי פלזמה אוויר, לכסות את לוחות הזכוכית עם 0.5 מ"ל של חיץ נגד הידבקות זמין מסחרית (ראה טבלה של חומרים) ולאפשר להם להתייבש באוויר. שטפו את צלחות הזכוכית פעם אחת באתנול ותנו להן להתייבש באוויר.
- חברו לוחית סיליקון שהוכנה בשלב 5.1.2 היטב למרכז צלחת זכוכית, כפי שמודגם באיור 4A.
- הכינו פרה-פולימר פולידימתילסילוקסאן (PDMS) בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים). עבור כל שבב PDMS, לשקול 10 גרם של מרכיב הבסיס ו 1 גרם של סוכן מיצוק לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
- מערבבים היטב את החומרים עם מוט ערבוב זכוכית עד שבועות קטנות מפוזרות באופן אחיד בקולואיד. הערבוב אורך 5-10 דקות, תלוי בנפח הקולואיד. צנטריפוגה את פרה-פולימר קולואיד למשך דקה אחת ב 500 x גרם (בטמפרטורת החדר) כדי לחסל בועות.
- לאט לשפוך ~ 10 מ"ל של prepolymer לתוך החלל כדי למלא את תבנית PTFE.
- הניחו בזהירות את התבנית במאגר ואקום ושמרו אותה אופקית כדי למנוע מהפרה-פולימר לזרום משם.
- הסירו שאריות בועות אוויר מהפרה-פולימר בעזרת משאבת ואקום. שאיבת האבק אורכת 120-180 דקות.
- במידת הצורך, יוצקים עוד פרה-פולימר כדי למלא עוד יותר את חלל התבנית. שאבו אבק למשך 60 דקות נוספות.
- כסו בזהירות את תבנית ה-PTFE עם צלחת הזכוכית, כאשר צד הסיליקה פונה לחלל, כפי שמודגם באיור 4Bi.
- ודא שכל הבועות מסולקות. מעבירים את התבנית לתנור ייבוש בטמפרטורה של 60°C כדי שהקדם-פולימר יתמצק למשך הלילה.
- מוציאים את התבנית מהתנור. לאחר הקירור, יש להסיר בזהירות את כיסוי ה-PDMS המוצק. צור פתח כניסה ושקע עם מנקב מחטים Φ1 מ"מ.
- שטפו את כיסוי ה-PDMS והחליקו את כיסוי ה-PDMS בקוטר 24 מ"מ ×-50 מ"מ בהתאם לשלב 2.1.2.
הערה: בצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים. - חבר כיסוי PDMS ושקופית כיסוי כדי ליצור שבב מיקרו-נוזל המכיל תעלת זרימה בגובה של כ~500 מיקרומטר. הצד התחתון צריך להיות מורכב משקופית כיסוי זכוכית ~ 0.15 מ"מ כדי לאפשר תבניות תאים עם אסטרטגיה מבוססת Mag-Arch.
- הרכיבו מתאמים סטריליים הזמינים מסחרית הן בכניסה והן ביציאה של שבב המיקרו-נוזל8.
- הכינו חיץ ציפוי ג'לטין 2% (w/v, מומס ב-PBS). לעקר את המאגר על ידי autoclaving.
- הזריקו את חיץ ציפוי הג'לטין לתוך השבב דרך מתאם הכניסה באמצעות מזרק 1 מ"ל. אם נוצרות בועות, שטפו אותן החוצה עם חיץ ציפוי נוסף.
- הכניסו את השבב לצלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ. הוסיפו 1 מ"ל PBS סביב תחתית הצלחת כדי למנוע ייבוש. מעבירים את המנה לאינקובטור תרביות תאים. הציפוי אורך 30 דקות.
- שטפו את חיץ הציפוי עם 2 מ"ל של תווך המכיל Gd (30 mM) דרך המפרצון.
- הזריקו בעדינות 1 מ"ל של תרחיף תאים המכיל 30 mM Gd-DTPA עם מזרק 1 מ"ל.
- תאי תבנית כפי שמודגם בשלבים 2.2-2.3 באמצעות מגנטים גליליים זעירים משלב 1.2.
הערה: עם זאת, מומלץ לחבר פלטת סיליקון עם שקע שמתאים לערכות המגנטים אל מתחת לפני השטח של מגלשת הזכוכית, כפי שמוצג באיור 4Ci. - לאחר התבנית, רענן בעדינות את המדיום המכיל Gd-DTPA עם 1 מ"ל של מדיום מלא על ידי שטיפה עם מזרק 1 מ"ל.
הערה: התהליך של תבניות תאים במיקרופלואידיקה, משלבים 5.7-5.9, אורך כ-180 דקות, בדומה לתבניות תאים בשקופיות זכוכית סטנדרטיות. - כמת את הדפוסים תחת מיקרוסקופ. במידת הצורך, חבר את שבב המיקרו-נוזל למכשיר תרבית במחזור הדם להמשך הטיפוח.
הערה: מניסיוננו, תאים מסוגלים לגדול במשך 72 שעות לפחות כאשר הם נתמכים על ידי מכשיר פשוט מבוסס מיקרו-משאבה, המספק למיקרופלואידיקה זרימה רציפה של מדיום תרבית טרי באינקובטורתא 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מגנטים מלבניים (1.5 מ"מ × 10 מ"מ × 35 מ"מ) וגליליים (Φ1.5 מ' × 10 מ"מ) נבחרו ליצירת תבניות תאים כהדגמה. למשתמשים יש את הגמישות לשנות את הגודל והצורה של מגנטים או להרכיב אותם באופן שונה כדי ליצור תבניות תאים מגוונות. באיור 1A,B הורכבו המגנטים, כאשר הקטבים המגנטיים מתוארים בכחול (דרום) ובאדום (צפון) לצורך בהירות. בתצורה זו, מגנטים מושכים זה את זה לרוחב ומסתדרים יחד, כפי שמודגם באיור 2. איור 1C,D מדגים את המבנה של התקן תרבית התאים ואת תהליך עיצוב התא.
איור 2 מציג תבניות תאים מסוג מונו. HUVECs מסומנים GFP שימשו לתצפית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. התאים אורגנו בתבניות מערך פסים ונקודות באמצעות מערכות מגנטים מתאימות. עבור HUVECs, אשר להיצמד במהירות שקופיות זכוכית (בתוך 120-180 דקות), ההליך כולו הושלם בתוך 4 שעות. מעקב אחר הפרוטוקול הביא לדפוסים עם קצוות מוגדרים היטב ואחידות גבוהה. כדי לקבוע את הכדאיות, התאים טופלו עם Gd-DTPA במשך 12 שעות, שזה הרבה יותר מאשר 3-6 שעות בשלב 2. עם זאת, הן צביעה חיה/מתה והן בדיקת CCK88 לא הראו ירידה משמעותית בכדאיות התאים. ריכוז גבוה יחסית של GD-DTPA (50 מילימטר) גרם להבדל סטטיסטי, אך עדיין שמר על שיעור חיים של 90.76% ± 1.78% (תרשים משלים 1).
בהתבסס על פרוטוקול תבניות תאים מסוג מונו, ניתנו דוגמאות לתבניות תאים מרובות סוגים עבור יישומי תרבית משותפים פוטנציאליים. בתרחיש זה, HUVECs, תאי סרטן השחלות A2780, ותאי שריר חלק (SMC) היו בשימוש. כדי להבדיל ביניהם, התאים סומנו ב-GFP, DiD ו-DiI לפני יצירת הדפוס. על-ידי ביצוע שלב 3, נוצרה תבנית תא משולשת של פסים זה לצד זה (איור 3A). לעומת זאת, שלב 4 שימש ליצירת מערכי נקודות קונצנטריים על-ידי התאמת הריכוז של Gd-DTPA (איור 3B). שכבת התאים הראשונה הוכתמה ב-DiI (אדום) ועוטרה ב-50 mM Gd-DTPA, ואילו שכבת התאים השנייה סומנה ב-GFP (ירוק) ובתבנית ב-25 mM Gd-DTPA. כתוצאה מכך, גודל הנקודות של השכבה הראשונה היה קטן יותר, מוקף באופן קונצנטרי על ידי השכבה השנייה של תאים בדוגמת נקודות. סוגי תאים שונים הציגו קצבי התקשרות והתפשטות משתנים, כאשר HUVECs התחברו והתפשטו במהירות, A2780s התחברו במהירות אך התפשטו לאט יותר, ו-SMCs התחברו והתפשטו לאט יחסית. תוצאות אלה הראו כי סוגי תאים שונים יכולים ליצור תבניות תאים תוך 3 שעות ולהיות מנוצלים בניסויים בתרבית משותפת.
יתר על כן, הוכח כי דפוס תאים באמצעות שדה מגנטי תואם להתקני תרבית צרים סגורים, כגון שבבים מיקרופלואידים. על-ידי ביצוע שלב 5, שבבים מיקרופלואידים נוצרו, ומערכי נקודות נוצרו בתוכם (איור 4).
איור 1: הגדרה ודיאגרמה סכמטית של תבניות תאים מבוססות קשת מאג . (A) הרכבה של ערכות מגנטים ליצירת תבניות תאי פסים. (B) הרכבה של ערכות מגנטים ליצירת תבניות תאים של מערך נקודות. (ג) הגדרת התקן תרבית התא. (D) הליך שלב אחר שלב לעיצוב תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הרכבה של התקנים ודפוסים של HUVECs לתבניות של מערך פסים ונקודות. (A) ערכות מגנטים הכלואות בתוך התקני תרבית תאים (i) וממוקמות בלוח תרבית תאים (ii). (B) ו-(C) ערכות מגנטים ותבניות התאים התואמות. התאים סומנו בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לצורך הדמיה של תבנית התא. מוטות קנה מידה = 1.5 מ"מ; כניסות = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תבניות של מערכות תרבות משותפת עם אסטרטגיה שלב אחר שלב. (A) תבניות תרבות משותפת באמצעות מגנט צדדי (i-iii). התאים סומנו ב-GFP (ירוק), DiD (כחול) ו-DiI (אדום) כדי להבחין בין סוגי תאים שונים. פסי קנה מידה = 1 מ"מ. (B) דפוסי תרבות משותפת המושגים על ידי התאמת ריכוז Gd-DTPA; (i) 50 mM, (ii) 20 mM. מוטות קנה מידה = 1.5 מ"מ; כניסות = 250 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תבנית תאים בתא מיקרופלואידי. (A) תרשים סכמטי של התבנית המיקרופלואידית. (B) ייצור מיקרופלואידיקה באמצעות פולידימתילסילוקסאן (PDMS) (i,ii). (C) תבניות תאים בתוך ההתקן המיקרופלואידי (i,ii) ותוצאה מייצגת המציגה תבניות תאים של מערך נקודות (iii). התאים סומנו בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). סרגל קנה מידה = 3 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: השפעת Gd-DTPA על כדאיות התא. HUVECs טופלו בריכוזים משתנים של Gd-DTPA במשך 12 שעות ולאחר מכן היו נתונים לכתמים חיים/מתים או לבדיקת CCK-8. (A) כתמים חיים/מתים של HUVECs. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) היסטוגרמה המתארת תוצאות צביעה חיה/מתה. (C) היסטוגרמה המציגה תוצאות בדיקת CCK-8. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תבנית התאים מבוססת Mag-Arch מספקת פתרון ידידותי למשתמש עבור רוב המעבדות הביו-רפואיות. שיטה זו מתקדמת במקביל לתווים ללא דיו, ללא תוויות, ללא תלות במצע ויכולת תבניות 8,13 בתפוקה גבוהה. עבור תבנית תאים מסוג מונו, היא מעצבת תאים באופן של צעד אחד. ההליך מסתיים בפשטות במדיומים תרבותיים מרעננים.
מחקרים קודמים השתמשו בחלקיקים מגנטיים כדי לתייג תאים ולמשוך אותם עם מגנטים כדי ליצור תבניות מדויקות14,15. עם זאת, נוכחותם של חלקיקים מגנטיים על תאים העלתה חששות לגבי השפעות אפשריות על התנהגויות תאים. תבניות תאים מבוססות Mag-Arch נוקטות באסטרטגיה הפוכה על ידי הפיכת נוזלים חוץ-תאיים לפאראמגנטיים, במקום תאים. אסטרטגיה זו מקלה מאוד על הסרת הריאגנטים הפאראמגנטיים הנוספים על ידי רענון מדיום התרבית. מחקרים יצרו כדורים תאיים ומערכי נקודות עם תבנית תאים מבוססת Mag-Arch11,16. בהשוואה למחקרים קיימים מבוססי Mag-Arch, השיטות המוצגות על ידי פרוטוקול זה יכולות להתאים אישית את צורת הדפוסים באופן חופשי. יתר על כן, הפרוטוקול מציג אסטרטגיות לייצור מערכות תרבות משותפת. הוכח גם שהוא עובד בתוך תאי תרבית תאים צרים סגורים, כפי שבדקנו במיקרופלואידיקה.
במקום שיטות מקבילות, הדורשות ציוד הדפסה ביולוגית מקצועי 17, תבניות מותאמות אישית18, או שינוי פני השטח של קומפלקס19, השיטה מבוססת Mag-Arch דורשת רק שני צרכים: מגנטים ו- GBCAs. פני השטח של תבנית המגנט קובעים את תבנית התא באופן הפוך. הודגמו מספר תבניות של פסים ומערכי נקודות כבסיסיים. משתמשים יכולים ליצור תבניות חופשיות עם צורות שונות של ערכות מגנטים, אשר זמינים בשפע מסחרי. כדי להשיג תוצאה אידיאלית, מומלץ לאמץ מגנטים המספקים כוח מגנטי מספיק. בפרקטיקה שלנו, אימצנו מגנטים ניאודימיום-ברזל-בורון N52, שהקביעות שלהם הייתה מעל 1430 mT ומגנטיות פני השטח הייתה מעל 100 mT על קטבים. עבור GBCAs, Gd-DTPA אומץ מכיוון שהוא יציב בתנאים פיזיולוגיים וזמין בזול ברוב המדינות והאזורים. ניתן לאמץ חלופות אחרות של GBCA. GBCA מקרוציקלי לא יוני, כגון gadobutrol ו gadoteridol, יכול להיות בחירה טובה יותר עבור ציטוטוקסיות נמוכה יותר בעת דפוס תאים פגיעים לטיפול ארוך טווח11,12.
המגבלה של תבניות תאים מבוססות Mag-Arch טמונה בעיקר באזור העבודה של השדה המגנטי שנוצר על ידי מגנטים. בעקבות הנוסחה הריבועית ההופכית, השדה המגנטי יורד בחדות עם מרחק8. כתוצאה מכך, שיטת Mag-Arch אינה מצליחה להרכיב תבניות תאים אידיאליות על צלחות או צלחות תרבית תאי פוליסטירן כלליות, שתחתיתן עבה מ-1 מ"מ. לכן, הפרוטוקול צריך לעבוד על משטחי תרבית תאים דקים יותר, כגון שקופיות זכוכית או צלחות תרבית תאים קונפוקליות. כאשר תבניות בתוך microfluidics, נדרש גם כי שקופיות התחתונות של microfluidics צריך להיות דק יותר מ 0.5 מ"מ. עבור הקמת מערכות תרבית משותפת, השיטה עשויה לגזול זמן, שכן כל סוג תא נוסף מגדיל את הזמן ב 3-6 שעות עבור חיבור התא.
בסך הכל, פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה יותר עבור דפוסי תאים, אשר ניתן לשכפל ברוב המעבדות ללא כל ציוד מיוחד. משתמשים עשויים לאמץ אותו ככלי רב עוצמה לחקר התנהגויות תאים, חיקוי מיקרו-סביבות רב-תאיות או בדיקת הזיקה התאית של ביו-חומרים8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך כספית על ידי תוכנית המו"פ הלאומית של סין (2021YFA1101100), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32000971), קרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות (מס '2021FZZX001-42), וקרן המדע של ליל כוכבים של אוניברסיטת ג'ג'יאנג מכון שנגחאי ללימודים מתקדמים (מענק מס '. SN-ZJU-SIAS-004).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A2780 ovarian cancer cells | Procell | CL-0013 | |
| Cell culture medium (DMEM, high glucose) | Gibco | 11995040 | |
| Cover slides | Citotest Scientific | 80340-3610 | For fabricating microfluidics. Dimension: 24 mm × 50 mm |
| DiD | MedChemExpress (MCE) | HY-D1028 | For labeling cells with red fluorescence (Ex: 640 nm) |
| DiI | MedChemExpress (MCE) | HY-D0083 | For labeling cells with orange fluorescence (Ex: 550 nm) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochannel | BC-SE-FBS07 | |
| Gadopentetate dimeglumine (Gd-DTPA) | Beijing Beilu Pharmaceutical | H10860002 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | V900863 | |
| Glass cell slides | Citotest Scientific | 80346-2510 | Diameter: 25 mm; thickness: 0.19-0.22 mm |
| Glass plates | PURESHI hardware store | For fabricating microfluidics. Dimension: 40 mm × 75 mm | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) | Servicebio | STCC12103G-1 | |
| Neodymium-iron-boron magnets (N52) | Lalaci | ||
| Non-toxic glass plate coating (Gel Slick Solution) | Lonza | 1049286 | For convenience of demolding when fabricating microfluidics |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Servicebio | G4200 | |
| Plasma cleaner | SANHOPTT | PT-2S | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | DOWSIL | SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | For fabricating microfluidics |
| Polytetrafluoroethylene (PFTE) mold | PURESHI hardware store | Customized online, for fabricating microfluidics | |
| Silicon plate | PURESHI hardware store | ||
| Smooth Muscle Cells (SMC) | Procell | CL-0517 | |
| Ultrasonic cleaner | Sapeen | CSA-02 |
References
- Christian, J., et al. Control of cell adhesion using hydrogel patterning techniques for applications in traction force microscopy. J Vis Exp. 179, e63121 (2022).
- Abbas, Y., Turco, M. Y., Burton, G. J., Moffett, A. Investigation of human trophoblast invasion in vitro. Hum Reprod Update. 26 (4), 501-513 (2020).
- Park, M., et al. Modulation of heterotypic and homotypic cell-cell interactions via zwitterionic lipid masks. Adv Healthc Mater. 6 (15), 1700063 (2017).
- Ren, T., Chen, P., Gu, L., Ogut, M. G., Demirci, U. Soft ring-shaped cellu-robots with simultaneous locomotion in batches. Adv Mater. 32 (8), e1905713 (2020).
- Ren, T., Steiger, W., Chen, P., Ovsianikov, A., Demirci, U. Enhancing cell packing in buckyballs by acoustofluidic activation. Biofabrication. 12 (2), 025033 (2020).
- Ge, S., et al. Magnetic levitation in chemistry, materials science, and biochemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 59 (41), 17810-17855 (2020).
- Puluca, N., et al. Levitating cells to sort the fit and the fat. Adv Biosyst. 4 (6), e1900300 (2020).
- Ren, T., et al. Programing cell assembly via ink-free, label-free magneto-archimedes based strategy. ACS Nano. 17 (13), 12072-12086 (2023).
- Li, Y. C., et al. Programmable laser-assisted surface microfabrication on a poly(vinyl alcohol)-coated glass chip with self-changing cell adhesivity for heterotypic cell patterning. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (40), 22322-22332 (2015).
- Chliara, M. A., Elezoglou, S., Zergioti, I. Bioprinting on organ-on-chip: Development and applications. Biosensors (Basel). 12 (12), 1135 (2022).
- Moncal, K. K., Yaman, S., Durmus, N. G. Levitational 3D bioassembly and density-based spatial coding of levitoids. Adv Funct Mater. 32 (50), 2204092 (2022).
- Parfenov, V. A., et al. Magnetic levitational bioassembly of 3D tissue construct in space. Sci Adv. 6 (29), eaba4174 (2020).
- Dell, A. C., Wagner, G., Own, J., Geibel, J. P. 3D bioprinting using hydrogels: Cell inks and tissue engineering applications. Pharmaceutics. 14 (12), 2596 (2022).
- Ino, K., Ito, A., Honda, H. Cell patterning using magnetite nanoparticles and magnetic force. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1309-1317 (2007).
- Okochi, M., Matsumura, T., Honda, H. Magnetic force-based cell patterning for evaluation of the effect of stromal fibroblasts on invasive capacity in 3d cultures. Biosens Bioelectron. 42, 300-307 (2013).
- Mishriki, S., et al. Rapid magnetic 3D printing of cellular structures with mcf-7 cell inks. Research (Wash D C). 2019, 9854593 (2019).
- Ozturk-Oncel, M. O., Leal-Martinez, B. H., Monteiro, R. F., Gomes, M. E., Domingues, R. M. A. A dive into the bath: Embedded 3D bioprinting of freeform in vitro models. Biomater Sci. 11, 5462-5473 (2023).
- Sahni, G., Yuan, J., Toh, Y. C. Stencil micropatterning of human pluripotent stem cells for probing spatial organization of differentiation fates. J Vis Exp. 112, e54097 (2016).
- Joddar, B., et al. Engineering approaches for cardiac organoid formation and their characterization. Transl Res. 250, 46-67 (2022).
