Summary
यहाँ हम का प्रदर्शन थर्माप्लास्टिक microfluidic गर्म embossing और गर्मी सील चिप्स का उपयोग कैसे बनाना है. तो फिर हम कैसे सीटू प्रकाश निर्देशित कलम बांधने का काम सतह और polymerization में सील चिप के माध्यम से उपयोग करने के लिए समग्र ठोस चरण स्तंभों के रूप में प्रदर्शित.
Abstract
हमारी प्रयोगशाला में, हम सफलतापूर्वक मानव रक्त, मूत्र और मल / बहुलक nanoparticle समग्र microscale lysis और ठोस चरण निष्कर्षण स्तंभों का उपयोग कर के microliter और submicroliter मात्रा से सीधे nucleic एसिड अलग है. बरामद नमूने केंद्रित, छोटी मात्रा के नमूने है कि PCRable किसी भी अतिरिक्त सफाई के बिना कर रहे हैं, कर रहे हैं. यहाँ, हम प्रदर्शन कैसे बनाना थर्माप्लास्टिक microfluidic गर्म embossing और गर्मी सील चिप्स का उपयोग करने के लिए. तो, हम कैसे सीटू प्रकाश निर्देशित कलम बांधने का काम सतह और polymerization में सील चिप के माध्यम से उपयोग करने के लिए समग्र ठोस चरण स्तंभों के रूप में प्रदर्शित. हम कलम बांधने का काम का प्रदर्शन और एक कार्बन नैनोट्यूब बहुलक / बैक्टीरिया कोशिका lysis के लिए समग्र स्तंभ के polymerization. हम तो lysis / सिलिका बहुलक संमिश्र स्तंभ का उपयोग कर चिप पर नमूना से nucleic एसिड की ठोस चरण निष्कर्षण द्वारा पीछा प्रक्रिया दिखा. संलग्न प्रोटोकॉल दोनों lysis और ठोस चरण निष्कर्षण स्तंभों को कैसे बनाने के लिए पर विस्तृत निर्देश होते हैं.
Protocol
microfluidic चैनलों एक चक्रीय polyolefin (Zeonex ® 690R, ZEON रासायनिक इंक, Louisville, KY) में गढ़े हैं. Zeonex 136 डिग्री सेल्सियस के एक ग्लास संक्रमण के तापमान (टी जी) और पारदर्शी यूवी है, जो प्रकाश निर्देशित झरझरा केवल पत्थर का खंभा गठन में इस्तेमाल किया रसायन विज्ञान के लिए आवश्यक है . microchannels Nico electroformed मास्टर ढालना, जो microfluidic मंच के नकारात्मक (व्युत्क्रम) के साथ माइक्रो गर्म - embossing द्वारा गढ़े हैं. गर्म embossing निम्नानुसार किया जाता है:
- मोल्ड और बहुलक सब्सट्रेट दो समानांतर धातु platens के बीच रखा जाता है.
- platens embossing तापमान (166 डिग्री सेल्सियस) है, जो 30 टी जी Zeonex के ऊपर º सी करने के लिए गरम कर रहे हैं.
- platens हैं तो लगभग 5 मिनट के लिए एक साथ दबाया और 250 साई पर दबाव बनाए रखा है.
- मोल्ड और सब्सट्रेट तो गर्म platens, 1-2 मिनट के लिए शांत करने की अनुमति दी से हटा रहे हैं, और तब मैन्युअल रूप से एक दूसरे से अलग.
- 1.5 मिमी व्यास के वेल्स नमूना परिचय और संग्रह के लिए चैनलों के सिरों पर drilled हैं.
- उभरा प्लास्टिक सब्सट्रेट तो thermally Zeonex का एक टुकड़ा के साथ बंधुआ संलग्न microfluidic चैनलों फार्म. उभरा सब्सट्रेट और कवर टुकड़ा यूवी - ओजोन या थर्मल संबंध से पहले इलाज प्लाज्मा सील दक्षता बढ़ाने के लिए और संलग्न चैनल संरचना (भट्टाचार्य और Klapperich, 2007) की निष्ठा सुनिश्चित किया जा सकता है.
ठोस चरण निष्कर्षण स्तंभ (विशेष) के प्लास्टिक microfluidic चैनलों के भीतर निर्माण कार्य
ठोस चरण के निर्माण कार्य एक दो कदम प्रक्रिया है. सबसे पहले, गढ़े microchannels सतह रहे हैं क्रम में प्लास्टिक डिवाइस के लिए विशेष स्तंभ के आसंजन सुधार के लिए संशोधित. सतह photopolymerization के माध्यम से कलम बांधने का काम polymeric microchannels की दीवारों functionalize प्रयोग किया जाता है.
कलम बांधने का काम प्रक्रिया निम्नानुसार है:
- microchannels ethylene (EDA) 3% benzophenone है, जो एक हाइड्रोजन abstracting photoinitiator साथ और मिथाइल methacrylate (एमएमए) diacrylate की एक 1:1 मिश्रण के साथ भर रहे हैं. EDA एमएमए, और benzophenone सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस, MO से खरीदी कर रहे हैं.
- चिप तो 254 एनएम यूवी और एक पराबैंगनी प्रदर्शन साधन (सीएल-1000 यूवी Crosslinker, UPV इंक, Upland, सीए) में 200 MJ / 2 सेमी ऊर्जा तरंगदैर्ध्य से कम 10 मिनट के लिए यूवी विकिरणित है. कलम बांधने का काम एच - अमूर्त और सतह सीमित बहुलक श्रृंखला है, जो polymerization के दूसरे चरण में केवल पत्थर का खंभा की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया मिश्रण के भीतर शामिल हो में polymerization के परिणाम के माध्यम से होता है.
- अतिरिक्त monomer चैनलों से वैक्यूम आकांक्षा का उपयोग मेथनॉल के 15 μL के साथ rinsing द्वारा हटा दिया जाता है.
Photografting प्रक्रिया के बाद, एक microporous बहुलक केवल पत्थर का खंभा microchannels के भीतर बनाई है कि फंसाने डीएनए निष्कर्षण के लिए सिलिका के कण. झरझरा केवल पत्थर का खंभा के बगल में तैयार निम्नानुसार है :
- सतह संशोधित चैनल एक केवल पत्थर का खंभा अग्रदूत BuMA (15% wt), EDMA (10% wt), 1-dodecanol (52.5% wt), cyclohexanol (22.5% wt), DMPAP मिलकर मिश्रण (सम्मान के साथ 1% wt के साथ भर रहे हैं ) monomers और 0.7 सुक्ष्ममापी सिलिका के कण (पूर्व बहुलक मिश्रण की कुल मात्रा के लिए सम्मान के साथ 15%). सिलिका microspheres Polysciences इंक, (Warrington, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) से खरीदे गए थे और monomers और porogenic सॉल्वैंट्स सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस, MO से खरीदी कर रहे हैं.
- चिप MJ 200 / 2 सेमी यूवी crosslinker में यूवी के साथ विकिरणित 1.1 polymerization के आरंभ मिनट के लिए, और अधिक monomer चैनलों से वैक्यूम आकांक्षा का उपयोग मेथनॉल के 15 μL के साथ rinsing द्वारा हटा दिया जाता है.
- fluidic कनेक्शन (NanoPorts टीएम कनेक्शन, Upchurch वैज्ञानिक, ओक हार्बर, WA) तो और microfluidic चैनलों की शुरूआत संग्रह कुओं पर जुड़ी हुई हैं.
- झरझरा केवल पत्थर का खंभा तो मेथनॉल के साथ 100mL/hour की एक प्रवाह दर पर सिरिंज पंप का उपयोग कम से कम 30 मिनट के लिए फिर से धोया.
प्लास्टिक microfluidic चैनलों के भीतर CNT lysis केवल पत्थर का खंभा के निर्माण
CNT (कार्बन नैनोट्यूब) lysis केवल पत्थर का खंभा के निर्माण की एक दो कदम प्रक्रिया है. सबसे पहले, गढ़े microchannels प्लास्टिक डिवाइस में SPE स्तंभों के लिए के रूप में एक ही तरीके से सतह संशोधित (grafted) कर रहे हैं.
Photografting प्रक्रिया के बाद, एक microporous बहुलक केवल पत्थर का खंभा microchannel कि बहु दीवारों कार्बन नैनोट्यूब के साथ गर्भवती है के भीतर का गठन किया है. झरझरा केवल पत्थर का खंभा के बगल में तैयार निम्नानुसार है :
- बहु - दीवार नैनोट्यूब cyclohexanol में 2.27M की एकाग्रता में resuspended हैं. यह resuspension 30 मिनट के लिए 50% के आयाम पर ultrasonicated है और 50% के साथ कर्तव्य चक्र sonifier सेल (disruptor Sonifier एस - 250डी, अल्ट्रासोनिक Branson, Danbury, सीटी) द्वारा निर्मित है. sonication CNTs के एक प्रभावी और स्थिर 0.5m निलंबन प्रदान की है. CNTs Nanolabs (ब्राइटन, एमए) से खरीदे गए थे.
- अब cyclohexanol के समाधान + CNTs का प्रयोग किया जाता है सिवाय इसके कि सतह संशोधित चैनलों को एक समान केवल पत्थर का खंभा अग्रदूत मिश्रण के साथ भर रहे हैं. केवल पत्थर का खंभा BuMA (15% wt), EDMA (10% wt), 1 dodecanol (52.5% wt), और cyclohexanol + CNTs (22.5% wt) के मिश्रण होते हैं. इस समाधान photoinitiator DMPAP (monomers के लिए सम्मान के साथ 1.13 wt%) जोड़ा जाता है. monomers, porogenic सॉल्वैंट्स और DMPAPA सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस, MO से खरीदी कर रहे हैं.
- चिप यूवी crosslinker में यूवी के साथ 120 MJ / 2 सेमी 0.9 polymerization के आरंभ मिनट के लिए विकिरणित है. डिवाइस crossliker में 180 डिग्री के रूप से फ़्लिप किया है और 120 MJ / 2 सेमी पर एक 0.9 मिनट के लिए विकिरणित. अतिरिक्त monomer चैनलों से वैक्यूम आकांक्षा का उपयोग मेथनॉल के 50 μL के साथ rinsing द्वारा हटा दिया जाता है.
- fluidic कनेक्शन (NanoPorts टीएम कनेक्शन, Upchurch वैज्ञानिक, ओक हार्बर, WA) तो और microfluidic चैनलों की शुरूआत संग्रह कुओं पर जुड़ी हुई हैं.
बैक्टीरियल CNT lysis केवल पत्थर का खंभा के साथ उपयोग के लिए नमूना तैयार
एक जीवाणु नमूने के लिए नमूना तैयार 600nm में एक ऑप्टिकल घनत्व माप लेने के शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें कि नमूना अत्यंत ऐसा नहीं ध्यान केंद्रित किया है के रूप में चैनल clogging से बचने के लिए.
- मीडिया में बैक्टीरिया के साथ 600nm में एक आयुध डिपो पढ़ने लो, यह एक biophotometer (Eppendorf BioPhotometer, Eppendorf वैज्ञानिक, Inc, Westbury, NY) के साथ किया जाता है. जब तक आयुध डिपो रीडिंग रेंज 0.18-0.25 ए के भीतर गिर नमूना पतला
- 5 मिनट के लिए 6500 rpm पर नमूना अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला छानना.
Lysis
- GuSCN में Resuspend बैक्टीरिया * + 0.01% एसडीएस + 4% proteinase कश्मीर (0.8mg/ml). भंवर संक्षिप्त (1ml मीडिया में बैक्टीरिया की 1ml GuSCN में resuspended होना चाहिए). Proteinase कश्मीर समाधान के लिए जोड़ा गया था करने के लिए प्रोटीन है कि जीवाणु के डीएनए के लिए संलग्न हैं और DNAases और RNAases बाधित denaturing के साथ सहायता. Proteinase कश्मीर का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह भी नीचे सेलुलर दीवार प्रोटीन जो वांछनीय है के बाद से दोनों ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया कोशिका दीवारों प्रोटीन की एक बड़ी मात्रा में होते हैं (हालांकि ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया आम तौर पर और अधिक प्रोटीन है को तोड़ने के साथ एड्स ). chaotropic बफर अतिरिक्त प्रोटीन denaturing जबकि डिटर्जेंट कोशिका दीवार बाधित के साथ proteinase कश्मीर एड्स. Proteinase कश्मीर और guanidinium thiocyanate (GuSCN) Qiagen इंक (वालेंसिया, सीए) से खरीदे गए थे. एसडीएस (सोडियम Dodecyl सल्फेट) पियर्स (रॉकफोर्ड, आईएल) से खरीदा गया था.
- तुरंत एक तिरछी नज़र टयूबिंग से जुड़े सिरिंज में नमूना लोड. सिरिंज Aspirate इतना है कि कोई हवा प्रणाली में है. Nanoport और चैनल के लिए टयूबिंग कनेक्ट.
एक KDS100 सिरिंज पंप (केडी वैज्ञानिक, Holliston, एमए द्वारा निर्मित) प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था और प्रवाह इस्तेमाल की दर 450 / सभी चरणों के लिए μL घंटे है. 450ul/hr नमूना lysis चैनल फ्लो.
- नमूना ले लीजिए और SPE के माध्यम से डीएनए निष्कर्षण (डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल देखें) करने के लिए आगे बढ़ना. नोट: यह जीवाणु नमूना लोड चरण 2 का पालन की जरूरत नहीं है, के बाद से निलंबन GuSCN है *.
डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल
निष्कर्षण प्रक्रिया 3 चरणों के होते हैं:
- लोड.
- Wash.
- Elute.
KDS100 सिरिंज पंप (केडी वैज्ञानिक, Holliston, एमए द्वारा निर्मित) प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था और प्रवाह इस्तेमाल की दर 300 μL / सभी चरणों के लिए घंटे.
भार
- हालत chaotropic बफर के साथ प्रयोग शुरू करने से पहले 1-2 मिनट के लिए (* GuSCN, thiocyanate guanidinium) चैनल .
- 1:1 के अनुपात में chaotropic बफर के साथ नमूना मिक्स.
- 3 मिनट के लिए चैनल के माध्यम से नमूना मिश्रण फ्लो.
धोना
- 2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के साथ चैनल धो लें.
- 2 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के साथ चैनल धो लें.
Elute
- 3 मिनट के लिए millipore पानी में डीएनए निकाला Elute. शुद्ध 15 μL, पीसीआर तैयार डीएनए लीजिए.
* Qiagen किट (बफर RLT) से GuSCN इस्तेमाल किया गया था.
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References
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Mechanical and chemical analysis of plasma and ultraviolet-ozone surface treatments for thermal bonding of polymeric microfluidic devices. Lab Chip. 7, 876-882 (2007).
