Préparation de balles pistolet à gènes et transfection biolistique des neurones en culture Slice

Summary

Nous décrivons une méthode pour la préparation de l'ADN des balles d'or revêtues et de démontrer l'utilisation de ces balles à biolistically transfecter des neurones en culture des coupes d'hippocampe.

Abstract

Transfection biolistique est un moyen physique de transfecter des cellules en bombardant avec des tissus de haute vitesse de l'ADN des particules enrobées. Nous fournissons un protocole détaillé pour la transfection biolistique de coupes d'hippocampe de rat, de la préparation initiale des balles revêtus d'ADN à la fusillade finale de la culture organotypique utilisant un canon à gènes. Transfection pistolet à gènes est un moyen efficace et facile de transfecter des neurones et est particulièrement utile pour l'étiquetage par fluorescence un petit nombre de cellules dans les tissus tranche. Dans cette vidéo, nous avons d'abord un aperçu des étapes nécessaires à la couche de particules d'or avec l'ADN. Nous avons ensuite montrer comment tapissent l'intérieur du tube en plastique avec des balles d'or / ADN, et la façon de couper ce tuyau pour obtenir les cartouches en plastique pour les charger dans le pistolet à gènes. Enfin, nous effectuons la transfection biolistique des cultures rat tranche de l'hippocampe, ce qui démontre la manipulation de l'Bio-Rad Helios canon à gènes, et offrant des conseils de dépannage pour obtenir des tranches de tissu sain et optimal transfectées.

Protocol

PROTOCOLE POUR LA TRANSFECTION biolistique

Faire des balles

Les puces sont bonnes pour un maximum de 6 mois, mais peut commencer à diminuer dans l'efficacité de transfection après 2-3 mois. Bullets doivent être conservés à 4 ° C en présence de boulettes de dessicant. Toujours laisser les flacons à scintillation, dans lequel sont stockées les balles, le réchauffer à température ambiante avant d'ouvrir le flacon.

Avant de commencer avoir en main:

• Spermidine (0,05 M)
• CaCl ₂ (1M)
• EtOH (100% de haute qualité-non ouvert bouteille)
• Autoclavés H ₂ 0
• ADN à transfecter
• Polyvinylpyrrolidone (PVP-20 mg / ml de stock)
• 2 X 15 ml conique (2/bullet jeu)
• Tubes (coupé en 1 X ~ 30 pouces jeu balle /)
• Fioles à scintillation (ensemble 1/bullet)
• Granulés dessiccation
• Seringue de 10 ml w / tube à l'extrémité

Préparer tube:

1. Dry ~ 30 pouces de tubes (environ 2 pouces au-delà droite O-ring) dans la station de tube w / gaz N ₂ (0,4 pression) pour une durée minimale de 20 min.

Précipiter l'ADN sur des billes d'or:

1. Préparer l'ADN à transfecter dans 50 volume total μmL en microtube (maximum 50 mg d'ADN total)
2. Peser 6-8 mg d'or et de transfert à un microtube
3. Ajouter 100 ul de 0,05 M spermidine d'or et une sonication pendant 20 sec
4. Ajoutez les 50 uL d'ADN pour la médaille d'or / spermidine
5. Vortex (autour de la mise 5) W / CAP ouverte
6. Ajouter goutte à goutte 100 ul de CaCl ₂ 1M
7. Brièvement Soniquer (<5 sec)
8. Laisser décanter pendant 10 min à température ambiante
9. Soniquer brièvement

Préparer la solution PVP pendant la sonication:

1. Faire diluer solution PVP dans 15 ml conique, 3,5 ml diluées PVP pour chaque jeu de balles (ajouter 7,5 ul de 20mg/ml PVP stock à 3,5 ml EtOH 100%)

Rinçage des billes d'or avec EtOH:

1. Isoler perles d'or à pleine vitesse pendant 10 secondes dans la microcentrifugeuse
2. Rejeter le surnageant, mais gardez une petite quantité de liquide sur le dessus de perles d'or
3. Laver avec 1 ml EtOH 3X, soniquer brièvement chaque fois, si nécessaire

Or Resuspendre / ADN en solution PVP:

1. Reprendre le culot d'or dans 200 ul de la diluer 3,5 ml PVP / EtOH solution
2. Vortex le culot d'or pour resuspendre (brièvement soniquer si nécessaire)
3. Transférer la uL 200 de l'or / solution de PVP à une nouvelle conique 15 ml
4. Continuer de cette manière, l'ajout de 200 uL de PVP à un moment jusqu'à ce que tous l'or a été transféré à la forme conique de 15 ml, et le volume final est de 3,2 ml

Tube de revêtement:

1. Éteignez N ₂ à la station de tuyaux et tubes en retirer séchées
2. Fixez tube séché à la seringue de 10 ml
3. Secouez vigoureusement les 15 ml conique rempli d'or / PVP
4. Placez l'extrémité du tuyau en or / solution de PVP et sucer lentement en prenant soin d'éviter les bulles
5. Laisser ~ 2 pouces à sec des deux extrémités de la tuyauterie
6. Avec le tube encore attaché à la seringue et rempli de la solution d'or / PVP, placer soigneusement le dos tube dans la station
7. Marquer les extrémités du tube où la solution se trouve
8. Laissez l'or se contenter de 5 min avec la seringue fixée
9. Suce-place de la solution très lentement en tirant la seringue afin que l'or réglée soit laissé (veillez à ne pas revenir de lavage)
10. Déconnecter la seringue
11. Rotation de 90 ° et laisser reposer 2 secondes
12. Rotation de 180 ° et laisser reposer encore 2 secondes
13. Tournez le tube pendant 5 secondes
14. Allumez le N _{2 de} sorte que la vanne lit entre 0,4 à 0,5 et le spin du tube recouvert d'or pendant le séchage pendant 5 min.

Coupe tube:

1. Retirez le tube de la tubulure de préparation en station et couper les extrémités à la marque.
2. Mettez un flacon à scintillation étiqueté sous le couperet tuyau pour attraper cartouches coupé
3. Placer dans le tube chopper tube et couper le tube avec de rasoir propre
4. Placer un dessèchement granulés en flacon à scintillation
5. Conservez les cartouches à 4 ° C

Tir des tranches de tissu

Lorsque vous photographiez des tranches de culture, il est important d'employer une technique relativement stérile afin d'éviter toute contamination. Rappelez-vous que lorsque vous photographiez deux constructions différentes, les deux séries de balles peuvent être chargées dans le support de la cartouche même, mais le canon-liner et l'écran doit être changé entre les constructions.

Avant de commencer avoir en main:

• Balles ADN (laissez flacon à scintillation se réchauffer à température ambiante avant ouverture)
• Tranches de tissu
• Helios pistolet à gènes
• Réservoir d'hélium avec un tuyau pistolet à gènes attachés </ Li>
• Support de la cartouche
• Liner baril de plastique joint torique en place
• Diffuseur (modifié)
• Écran diffuseur
• Forceps

Prepping le pistolet génique:

1. En utilisant une pince placer les cartouches en or recouvert de plastique dans le support de la cartouche.
2. Placez le support de la cartouche dans le pistolet à gènes d'abord repousser verrouillage
3. Fixez le support de la cartouche avec blocage
4. Obtenir une doublure canon avec un joint torique et l'écran diffuseur solidement en place
5. Vissez le baril-liner dans le pistolet à gènes

Tir tranches cultivés avec le pistolet à gènes:

1. Mettez cache-oreilles
2. Branchez le pistolet à gènes dans le tuyau de gaz réservoir relié Hélium
3. Tournez la pression sur le réservoir à 180 PSI
4. Tirez une vierge dans l'air afin d'enlever toute la poussière ou les débris de l'écran diffuseur. Pour tirer le canon, d'abord appuyer sur le bouton de verrouillage de sécurité jusqu'à ce que les bips fusil, puis tirez sur la gâchette.
5. Après le tournage de la vierge, retirez les tranches de l'incubateur
6. Avance au pistolet d'abord construire
7. Shoot avec l'écran diffuseur d'environ 0,5 - 1 pouce de la tranche
8. Advance de la cartouche entre les puits.
9. Après le tournage du dernier puits, placer les tranches de retour dans l'incubateur
10. Éteignez la pression du gaz et la libération avant de détacher le pistolet du tuyau d'hélium
11. Dévissez la doublure baril, et retirez la cartouche et les coquilles utilisées

Nettoyage porte-cartouches et les doublures canon:

1. Placez les cartouches, les doublures baril, et les écrans de diffuseur dans un bécher avec de l'eau savonneuse
2. Bécher place dans sonicateur de bain et une sonication pendant 20 min
3. Rincer abondamment à l'eau jusqu'à ce que tous les résidus de savon sont retirés
4. Faire tremper dans EtOH à 70% pour une heure
5. Placez-le sur une serviette en papier sèche sécher une nuit
6. Nettoyer les cartouches, les doublures baril, et les écrans peuvent ensuite être réutilisées dans les prochains transfections biolistique

Conseils de dépannage pour la transfection biolistique

Transfection biolistique peut parfois aboutir à des conditions de transfection optimales. Elle peut conduire à trop peu ou trop grand nombre de cellules transfectées, trop haut ou trop bas niveaux d'expression, ou peuvent causer des tranches de tissu pour devenir généralement malsain. Entraînent souvent malsaine tranches de l'explosion de pression. Voici quelques conseils pour obtenir des tranches de tissu de façon optimale transfectées.

Si les tranches semblent être malsaine (ou si trop de cellules sont transfectées / tranche), essayez:

• distance de tir augmente
• la pression diminue sur le réservoir de gaz
• diminuant la quantité d'or
• découper le centre du diffuseur de Bio-Rad et le remplacement du centre avec un écran diffuseur.

Si trop peu de cellules sont transfectées, essayez:

• diminuant la distance de tir
• une pression croissante sur le réservoir de gaz
• augmentant la quantité d'or
• augmentant le nombre de tranches de tissu / puits
• assurez-vous que le joint torique dans le canon-liner est intacte.

Si vous obtenez des tranches à la fois avec trop de cellules transfectées et trop peu pendant le tournage même s'assurer que:

• que vous tenez le pistolet symétriquement au-dessus ainsi
• que l'or est uniformément revêtement de l'intérieur du tube. (Si vous avez trouvé une ligne d'or, d'en tirer le surnageant du tube à un rythme plus rapide une fois l'or s'est installé et tourner l'or plus avant de tourner sur l'azote. Si, d'autre part, vous avez trouvé des stries d'or , cela est probablement attribuable à une exposition trop d'humidité pendant la fabrication de puce: assurez-vous que vous utilisez un flacon non ouvert d'EtOH, que le tube est bien sec avant de revêtement, et que vous le plafonnement des couvercles et des balles en préparation en temps opportun).

Si l'efficacité de transfection semble optimal (# des cellules transfectées / tranche), mais le niveau d'expression semble trop haute ou trop basse:

• ajuster le ratio de l'ADN à l'or. (Par exemple, si elle est trop faible maintenir la quantité d'or, mais augmenter la quantité d'ADN.)
• ajuster la quantité de temps entre les tirs et la collecte des données

Dans le cas de la transfection double, si vous avez trouvé l'expression trop peu de l'un de vos constructions, d'ajuster le ratio de ces deux concepts de façon appropriée et assurez-vous que les deux constructions sont sous le même promoteur, afin de s'assurer que l'on promoteur ne sera pas hors-compétition de l'autre.

Discussion

Transfection biolistique est un moyen physique de transfecter des cellules par l'intermédiaire bombardement de tissus vivants avec des particules de haute vitesse de l'ADN d'or enrobées. Dans le transfert de gène médié particules, en général, les cellules transfectées résultat quand la balle vient reposer dans le noyau. Alors que de nombreuses méthodes de transfection différentes existent, telles que la microinjection, la lipofection, la transfection de phosphate de calcium, l'électroporation et la transfection virale, la transfection biolistique peut offrir un moins de travail, et alternative efficace pour transfecter des cellules qui ne sont pas facilement transfectées en utilisant ces autres méthodes. En fait, il a d'abord été développé comme une technique de transfert de gènes dans les plantes, car la présence de la paroi cellulaire faite de transfection difficile en utilisant des méthodes préexistantes ^1. De même, biolistique a gagné en popularité dans le domaine de la neurobiologie depuis neurones post-mitotiques sont notoirement difficiles à transfecter ^2,3. En particulier, il est largement reconnu comme principe de la technique pour être utilisés dans des expériences visant à évaluer la morphologie fine de neurones isolés dans les tranches de cerveau intact. Les méthodes décrites ici fournissent une explication détaillée et exhaustive de la façon d'effectuer la transfection biolistique des tranches de cerveau de culture en utilisant une main du gène-gun (le système Hélios Gene Gun; Bio-Rad).

Transfection biolistique est devenu la méthode privilégiée pour la transfection de neurones en culture tranche, car il permet la transfection d'un certain nombre de cellules éparses à travers la tranche du cerveau. De cette façon, les neurones individuels peuvent être examinés isolément. Comme cette technique est particulièrement bien adapté pour la transfection de neurones dans le cerveau tranche, il est souvent utilisé en conjonction avec deux microscopie biphotonique, puisque la visualisation 2-photons d'excitation permet de cellules marquées par fluorescence profonde dans le tissu diffusion de la lumière ^4. En effet, les images à fort grossissement de la seule neurones pyramidaux présentées tout au long de cette vidéo ont été capturées à l'aide d'une coutume microscope intégré au laser 2-photons numérisation. En conclusion, la transfection biolistique est un moyen efficace de transfecter des cellules individuelles dans le contexte d'une forte densité de cellules environnantes, et comme tel s'est avéré extrêmement utile pour l'étiquetage fluorescence neurones individuels dans la culture tranche de neurones.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1.6um gold particles (microcarrier)	0.25g	Bio-Rad	1652264
1M CaCl2		Fluka	21115
100% EtOH	1pint	Goldshield
Cartridge Tubing		Bio-Rad	1652412
Scintillation vials	20ml, 500/case	VWR international	66021-668
Dessication pellets	”Dricap”	MTI (800-445-9890)
Water bath sonicator	model 50T	VWR international
Cartridge holder	pack of 5	Bio-Rad	1652426
Barrel liner	pack of 5	Bio-Rad	1652417
Diffuser screen	pack of 5	Bio-Rad	1652475
O-ring	75 Viton, Size 007, Qty, 100	McMaster-Carr
Screen (mesh)		McMaster-Carr	144258
PVP	20mg/ml in EtOH	Bio-Rad		Comes with tubing from biorad
Tubing prep station		Bio-Rad	1652418
Tubing cutter		Bio-Rad	1652422
Helios Gene-Gun		Bio-Rad	1652411
Gene gun hose		Bio-Rad		Comes with Gene-Gun
Spermidine	5g	Sigma-Aldrich	s-0266
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