Summary
本视频演示了如何生长在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层细胞的人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）。
Abstract
本视频演示了如何生长在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层细胞的人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）。
Protocol
分割的人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）接种于小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）
通常一个融合的人类胚胎干细胞板可分割1:6至1:10，特别是胚胎干细胞线。分割板块将再次成为汇合后5-7天分裂。
- 分裂之前两天，涂胶板使用了0.1％的明胶溶液。对于6孔板，每口井，并培育板添加到37℃，5％的CO 2组织培养孵化器一夜之间2毫升。
- 板MEFs糊化6孔板的前一天，你计划的人类胚胎干细胞分裂。 （注：MEFs可镀很多，如果需要的时间提前了3天〜3天之后，MEFs成为扁平化和更多的传播，出和可不能维持人类胚胎干细胞以及新鲜MEFs可以。。）以一小瓶克的照射或丝裂霉素C处理CF1的MEFs，含有5-6 × 10 6细胞，在37℃水浴2分钟的液态氮和解冻。洗涤细胞一次在50毫升猎鹰管与温暖的MEF的文化传媒和重悬在温暖的MEF的文化传媒的最终体积。 5-6 × 10 6细胞，这是足以板两个或三个6孔板。
- 虽然被冲走的MEFs，糊化板，从水井中删除所有的解决方案，并加入2.5毫升每口井的MEF的文化传媒。
- MEF的暂停，每孔加入0.5毫升，以实现在每孔终体积3毫升。确保MEFs是均匀地分散和地方板块在一夜之间解决孵化器。
- 在人类胚胎干细胞分裂的一天，准备好新鲜或使用<2周龄无菌胶原酶在1mg/ml的第四解决方案。删除所有媒体要拆分从人类胚胎干细胞井，洗一次2毫升每口井的温暖1 × PBS，pH值7.4，并添加1毫升胶原酶溶液。在37 ° C为5-10分钟。取6以及人类胚胎干细胞板的孵化器和ES媒体（不含bFGF）的添加1ml到每口井。在每口井使用的解决方案与1毫升吸管，吸了媒体和打击板的干细胞。每口井，这将需要约5至10重复。然后，暂停使用人类胚胎干细胞转移到一个50毫升猎鹰管。所有被拆分的井，并结合在一个50毫升猎鹰管。颗粒的人类胚胎干细胞在200克在室温下5分钟，洗一次缺乏碱性成纤维细胞生长因子与胚胎干媒体。
- 虽然人类胚胎干细胞被冲走，拿出了MEF板，从水井中删除所有媒体和洗一次与无菌的，温暖的1 × PBS，pH值7.4再加入2.5毫升的ES媒体（现为10毫微克/毫升碱性成纤维细胞生长因子与补充）每很好。
- 重悬浮颗粒人类胚胎干细胞在适当的ES媒体体积，辅以在10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子。 （注：当人类胚胎干细胞重悬，他们应该再悬浮量的大小和形状大致统一的殖民地，分光比）仔细吸管的人类胚胎干细胞悬浮起来，几次使殖民地更小，更统一，但没有这么多，产生的单细胞或非常小的殖民地。的人类胚胎干细胞悬浮液，每孔加入0.5毫升的MEF板实现在每孔终体积为3毫升。目视检查，以确保人类胚胎干细胞是均匀分布放置在孵化器的板回一夜之间解决之前。电镀后，它通常会采取殖民地几天，其形状特征和边界外观。
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Discussion
本视频演示了如何生长在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层细胞的人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）。在电镀前的最后一步，当人类胚胎干细胞重悬，他们应大致统一的殖民地的大小和形状。仔细移液器的人类胚胎干细胞悬液和向下几次，使殖民地的体积更小，更均匀，但没有这么多，单细胞或非常小的菌落generated.Immunofluorescence的人类胚胎干细胞全能性的标志物，如10月，染色和显微镜或流式细胞仪4和SSEA - 4，是需要确认的人类胚胎干细胞在一个文化过程中的未分化状态的维护。
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Acknowledgments
在Teitell实验室的人类胚胎干细胞研究是由加州再生医学研究所（CIRM）种子批RS1 - 00313的支持。我们感谢的再生医学和干细胞研究的加州大学洛杉矶分校，特别是博士Amander克拉克，博士杰罗姆扎克，和加州大学洛杉矶分校的Broad研究所干细胞核心设施为支持我们的研究成员的广泛中心的成员。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science . 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).
