Summary
וידאו זה מדגים את נוהל המבדילים תאים דנדריטים מיאלואידית ממח העצם העכבר. בידוד של השוקה העכבר הירך, ועיבוד של מח העצם הם הפגינו. תמונות הוכחת מורפולוגיה תא לפני ואחרי בידול, דמויות המתארות פנוטיפ התא IL-12 בייצור התבגרות הבאות באמצעות CPG מוצגים.
Abstract
תאים דנדריטים מיאלואידית (DCS) משמשים לעתים קרובות כדי לחקור את יחסי הגומלין בין מנגנוני החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות לבין תגובה מוקדמת לזיהום. כי אלה האנטיגן החזק ביותר בהצגת תאים, DCs נמצאים בשימוש יותר ויותר וקטור חיסון ללמוד את האינדוקציה של אנטיגן ספציפי התגובה החיסונית. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הליך קצירת tibias ואת עצמות הירך של העכבר תורם, עיבוד מח עצם הבחנה DCs במבחנה. המאפיינים של שינוי בעקבות גירוי DCs: תאים דנדריטים בשלים הם phagocytes חזק, ואילו DCs בוגרים המסוגלים מצגת אנטיגן ואינטראקציה עם CD4 + ו - CD8 + T תאים. שינוי זה בפעילות תפקודית מתכתב עם upregulation של סמנים משטח התא ייצור ציטוקינים. סוכנים רבים שניתן להשתמש בהם כדי DCs בוגרים, כולל ציטוקינים חיוג כמו ligands הקולטן. בסרטון הזה אנחנו מדגימים השוואות תזרים cytometric הביטוי של שני שיתוף גירוי מולקולות, CD86 ו - CD40, ואת ציטוקינים, IL-12, בעקבות גירוי לילה עם טיפול CPG או מדומה. לאחר התמיינות, DCs ניתן להשפיע יותר כמו וקטור חיסון לשימוש או לייצר אנטיגן ספציפי על ידי המערכת החיסונית במבחנה פועם באמצעות פפטידים או חלבונים, או transduced באמצעות וקטורים ויראליים רקומביננטי.
Protocol
פרוטוקול זה הותאם מ לוץ ואח' 1.
קציר ועיבוד של מח העצם
- בידוד של עצם השוק לבין עצם הירך: להרדים את העכבר תורם ולרסס את הרגליים עם אתנול 70%. תפוס את הקרסול first היטב עם מלקחיים בוטה מתחילים לחתוך את העור ואת שרירי הבסיסי לחשוף את עצם השוק. כדי למנוע פגיעה בעצמות, לחתוך לאט במקביל השוקה, והשאיר על כנו מפרק הברך.
כדי לנקות את עצם הירך, מפרק הברך לשתק את ידי אחיזה עם מלקחיים בוטה. לנקות את השרירים עם זוג מספריים חדות מלקחיים מעוקל. המשך כלפי מעלה עד מפרק הירך חשוף ומספריים יכול להיות ממוקם בין ראש עצם הירך ואת מפרק הירך. מוציאים את העצמות על ידי חיתוך משותף בין עצם הירך לבין המותן ומקום לתוך בופר פוספט (PBS) על קרח. - הסרת מח עצם: השרירים הנותרות נקי של עצמות בעזרת מספריים מלקחיים מעוקל. לחתוך את העצם אפיפיזות כל ולאתר את חלל במרכז. בעזרת מזרק 10 מ"ל עמוסה PBS ו 25G0.5 "מחט, שטוף מוח העצם לתוך צלחת פטרי ללא רקמה מצופה.
- עיבוד של מוח העצם: השתמש סוף הגומי של הבוכנה של מזרק 1mL לנתק את מח העצם לתוך ההשעיה תא בודד (להשתמש מעלה ומטה, לא מגרד תנועה). איסוף מח העצם בצינור בז חרוטי, ולשטוף את מוח העצם שיורית עם PBS.
התרבות של תאים דנדריטים
- תאים Resuspend בוושינגטון התקשורת לספור מבשרי DC על hemocytometer (איור 1). אתה תראה תאים בגדלים שונים; מבשרי DC הם הגדולים והמבריקים. דיפרנציאלי לספור רק את התאים האלה. משתי עצמות הירך ושני tibias של C57Bl wild-type / 6 העכבר (6-8 שבועות), אתה יכול לצפות בין 25-40 x 10 6 מבשרי DC הכולל.
איור 1
- התרבות תאים בצפיפות של 2 x 10 5 מבשרי DC / mL בוושינגטון התקשורת בתוספת 40 ng / mL רקומביננטי Murine GM-CSF. פלייט תאים שאינם רקמת מצופה צלחות פטרי קלקר.
הוסף מדיה (יום 3)
כדי לרענן את התקשורת, להוסיף חצי מהנפח הכולל של התקשורת טריים בתוספת 40 ng / mL GM-CSF.
החלף שליש התקשורת (יום 6) ו ההבשלה
כדי לרענן את התקשורת, להסיר בזהירות שליש מהנפח הכולל של התקשורת להחליף את נפח התקשורת עם טרי DC בתוספת 40 ng / mL GM-CSF ביום 6 של התרבות.
אם תרצה, תאים דנדריטים יכול להיות מגורה על התבגרות באמצעות ציטוקינים או חיוג כמו ligands הקולטן. בסרטון, DCs היו התבגר ידי גירוי לילה עם 5 ng / mL CPG.
קציר של תאים דנדריטים
תרבות הבירה הושלמה (איור 2). תאים יהיה גם השעיה דבק רופף הצלחת. תאים דבק ניתן להסיר על ידי גירוד מגרד את המנה עם תרבית רקמה ושטיפה עם PBS. המספר הכולל של תאים יגדל פי 5-8 במהלך התרבות שבוע ארוך תקופת הבחנה, אם כן, מצפים לקצור 1-1.6 x 10 6 תאים / מ"ל. 
איור 2
ריאגנטים
- DC התקשורת
- RPMI-1640 מדיה, בתוספת:
- 10% בסרום שור עוברית
- 100 IU / mL פניצילין
- 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין
- 1% L-גלוטמין
- 0.1% 2-mercaptoethanol
- 1X שאינם חיוניים חומצות אמינו
- 1X נתרן pyruvate
- רקומביננטי Murine GM-CSF
- rmGM-CSF (Peprotech inc, ניו ג'רזי, לא קטלוג. 315-03)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DCs שימושיים מחקרים של אינטראקציות החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות, והוא יכול להיות מועסקים וקטור חיסון. בסרטון הזה, אנחנו הוכיחו את הצעדים כדי לבודד מח עצם להבדיל תאים דנדריטים מיאלואידית במבחנה. בעקבות התקופה תרבות, תאים אלו יכולים להיות דמיינו מיקרוסקופית שני תאים כמו חסיד, אשר לעתים קרובות בעלי דנדריטים, ולא חסיד תאים עגולים. DCs ניתן להשפיע עוד יותר על ידי פועם עם אנטיגן להצגת אנטיגן או גירוי של ייצור ציטוקינים לבין מולקולה upregulation costimulatory בעזרת ציטוקינים ו / או חיוג כמו ligands קולטן (לסקירה, ראה גלבוע, 2008 (2)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
JB נתמך על ידי studentships מן למדעי הטבע וההנדסה המועצה למחקר (NSERC). תמיכה עבור פרויקט זה סופק על ידי מכוני הבריאות הקנדית Research, גרנט MOP-67066.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| recombinant murine GM-CSF | Reagent | Peptrotech | 315-03 |
References
- Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
- Gilboa, E.
