Summary
Это видео демонстрирует процедуру для дифференциации миелоидных дендритных клеток из костного мозга мыши. Выделение мышью голени и бедра, и обработки костного мозга продемонстрировано. Картинки демонстрируя морфологии клеток до и после дифференциации, и цифры изображением фенотип клетки и Ил-12 производства после созревания использованием CpG показаны.
Abstract
Миелоидного дендритные клетки (ДК), часто используются для изучения взаимодействия врожденных и адаптивных иммунных механизмов и ранний ответ на инфекцию. Потому что это самый мощный антиген представляющих клеток, ЦОДов все чаще используются в качестве вакцины для изучения вектор индукции антиген-специфического иммунного ответа. В этом видео мы продемонстрируем процедуры для уборки большеберцовые кости и бедра от донора мыши, обработки костного мозга и дифференциации контроллеры домена в пробирке. Свойства изменение домена после стимуляции: незрелые дендритные клетки являются мощным фагоцитов, в то время как зрелые РС способны презентации антигена и взаимодействия с CD4 + и CD8 + Т-клеток. Это изменение функциональной активности соответствует регуляция клеточных поверхностных маркеров и продукции цитокинов. Многие агенты могут быть использованы для зрелой контроллеры домена, включая цитокины и звонок, как лиганды рецептора. В этом видео, мы демонстрируем проточной цитометрии сравнения выражения двух костимулирующих молекул CD86 и CD40, и цитокинов, IL-12, после стимуляции ночь с CpG или макет лечения. После дифференциации, контроллеры домена могут быть дополнительно манипулировать для использования в качестве вакцины вектора или генерировать антиген-специфического иммунного ответа в процессе искусственного пульсирующий использованием пептиды или белки, или трансдуцированных с использованием рекомбинантной вирусных векторов.
Protocol
Этот протокол был адаптирован с Lutz и др. 1.
Урожай и обработки костного мозга
- Выделение голени и бедра: усыпить доноров мыши и спрей ноги с 70% этанола. Возьмите первый лодыжки прочно с тупыми щипцами и начинают срезать кожи и подлежащих мышц подвергать голени. Во избежание повреждения костей, нарезать медленно и параллельно голени, оставляя коленного сустава без изменений.
Для очистки бедра, иммобилизации коленного сустава, захватив с тупыми щипцами. Чистый от мускулатуры с парой острых ножниц и изогнутым пинцетом. Продолжите вверх до тазобедренного сустава подвергается и ножницы могут быть помещены между головкой бедра и тазобедренного сустава. Удалить кости, сокращая между бедренной кости и тазобедренного сустава и поместить в фосфатным буферным раствором (PBS), на льду. - Удаление костного мозга: Чистота остальные мышцы от костей с помощью ножниц и изогнутым пинцетом. Отрежьте эпифизов каждой кости и найдите центр полости. Использование 10 мл шприц загружается с PBS и 25G0.5 "иглу, промыть костного мозга в не-ткань покрыта чашке Петри.
- Обработка костного мозга: используйте резиновые конце поршень из шприца 1 мл отделить костного мозга в одной клеточной суспензии (использование вверх и вниз, а не выскабливание движения). Сбор костного мозга в конической трубе сокол, и промойте остаточной костного мозга с PBS.
Культура дендритных клеток
- Ресуспендируют клеток в DC СМИ и подсчета DC прекурсоров на гемоцитометра (рис. 1). Вы увидите, клетки разных размеров; DC прекурсоров являются самыми крупными и яркими. Дифференциально рассчитывать только эти клетки. Из двух бедренных костей и два большеберцовые кости дикого типа C57Bl / 6 мыши (6-8 недель), вы должны ожидать от 25-40 х 10 6 общего прекурсоров постоянного тока.
Рисунок 1
- Культуры клеток при плотности 2 х 10 5 прекурсоров DC / DC мл в среде с 40 нг / мл рекомбинантного мышиного GM-CSF. Пластина клеток в ткани, не покрытых пластинами полистирола Петри.
Добавить медиа (день 3)
Для обновления информации, добавить половину от общего объема свежей среде с 40 нг / мл GM-CSF.
Замените треть средств массовой информации (день 6) и созревание
Для обновления информации, тщательно удалить одну треть от общего объема средств массовой информации и заменить этот объем со свежими СМИ DC дополнена с 40 нг / мл GM-CSF на 6 день культуры.
При желании, дендритные клетки могут быть стимулированы для созревания использованием цитокинов или звонок, как лиганды рецептора. В видео, контроллеры домена были созрели ночным стимуляцию с 5 нг / мл CpG.
Урожай дендритных клеток
DC культуры является полным (рис. 2). Клетки будут и во взвешенном состоянии и свободно придерживаться пластины. Наклеивании клетки могут быть удалены путем соскабливания блюдо с скребок культуре ткани и промывки PBS. Общее число ячеек увеличится 5-8 раз в течение недельного культуры и дифференциации периода, следовательно, рассчитывать на урожай 1-1,6 х 10 6 клеток / мл. 
Рисунок 2
Реагенты
- DC СМИ
- RPMI-1640 средств массовой информации, дополнен:
- 10% эмбриональной телячьей сыворотки
- 100 МЕ / мл пенициллина
- 100 мкг / мл стрептомицина
- 1% L-глутамина
- 0,1% 2-меркаптоэтанола
- 1X без незаменимых аминокислот
- 1X пирувата натрия
- Рекомбинантный мышиный GM-CSF
- rmGM-CSF (Peprotech Inc, Нью-Джерси, каталог нет. 315-03)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Контроллеры домена являются полезными для исследования врожденных и адаптивных иммунных взаимодействий, и может быть использован в качестве вакцины вектор. В этом видео, мы продемонстрировали шагов, чтобы изолировать костного мозга и дифференциации миелоидных дендритных клеток в пробирке. После периода культуры, эти клетки могут быть визуализированы микроскопически как в качестве приверженца клетки, которые часто обладают дендритов, и не прилипшие клетки раунде. РС может быть дополнительно обработан так, презентации антигена импульсными с антигеном или вынужденное для производства цитокинов и регуляция костимуляторных молекулы использованием цитокинов и / или платной-подобные рецепторы лигандов (см. обзор в Гильбоа, 2008 (2)).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
JB поддерживается studentships с естественным наукам и инженерным исследованиям Совета (NSERC). Поддержка данного проекта была предоставлена канадского института исследований в области здравоохранения, Грант СС-67066.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| recombinant murine GM-CSF | Reagent | Peptrotech | 315-03 |
References
- Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).
- Gilboa, E.
