Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Summary

Bu video fare kemik iliği myeloid dendritik hücrelerin ayırt etmek için prosedür göstermektedir. İzolasyon fare tibia ve femur, ve kemik iliği işleme göstermiştir. Hücre fenotipi ve CpG IL-12 üretimi takiben olgunlaşma gösteren farklılaşma öncesi ve sonrası hücre morfolojisi gösteren resimler ve rakamlar gösterilmektedir.

Abstract

Myeloid dendritik hücreler (DC) doğal ve adaptif immün mekanizmaları ve enfeksiyona karşı erken yanıt arasındaki etkileşimleri incelemek için sık sık kullanılır. Bu hücreler sunan en güçlü antijen olduğundan, DC'lere giderek antijen-spesifik immün yanıtlarının indüksiyonu çalışma bir aşı vektörü olarak kullanılan ediliyor. Bu video, biz, bir donör fare tibiaları ve femur hasat, kemik iliği işleme ve in vitro DC'ler ayırt prosedürü göstermektedir. Uyarılmasını takiben DC'ler değişim özellikleri: olgun DC'ler antijen sunumu ve etkileşim CD4 + ve CD8 + T hücreleri yeteneğine ise immatür dendritik hücreler, güçlü fagositlerdir. Bu değişiklik, fonksiyonel aktivite uyarılması ile hücre yüzey belirteçleri ve sitokin üretimi karşılık gelir. Birçok ajanlar olgun DC'ler, sitokinler ve toll-benzeri reseptör ligandlar dahil etmek için kullanılabilir. Bu video, CpG ya da sahte tedavi ile bir gecede uyarılmasını takiben, iki eş-uyarıcı moleküller, CD86 ve CD40, sitokin, IL-12 ekspresyonu akım sitometri karşılaştırmalar göstermektedir. Farklılaşma sonra, DC'ler daha bir aşı vektörü olarak kullanılmak üzere manipüle edilebilir ya da in vitro antijen-spesifik immün yanıt oluşturmak için peptid veya proteinleri kullanarak darbeli, ya da rekombinant viral vektörler kullanılarak transduced.

Protocol

Bu protokol, Lutz ve ark adapte ^edilmiştir. 1

Hasat ve kemik iliği işleme

1. Tibia ve femur İzolasyon: donör fare Euthanize ve% 70 etanol ile bacaklarda sprey. Künt forseps ile ilk ayak bileği sıkıca kavrayın ve tibia maruz deri ve altta yatan kas kesip başlar. Kemik hasar görmesini önlemek için, tibia, diz eklem sağlam bırakarak yavaş yavaş ve paralel kesmek.
   
   Femur temizlemek için, künt forseps tutarak diz eklemi hareketsiz. Kas uzak, keskin bir makas ve kavisli bir forseps bir çift ile temizleyin. Kalça ekleminin maruz kaldığı ve femur başı ve kalça eklemi arasındaki makas konabilir kadar yukarı doğru devam edin. Fosfat içine femur ve kalça eklemi ve yer arasındaki kesim tarafından kemikleri çıkarın buz tamponlu salin (PBS).
2. Kemik iliği Temizleme: makas ve kavisli bir forseps kullanarak kemiklerden Temizlik kalan kas. Her kemik epifizleri kesiniz ve merkezi boşluğu bulmak. PBS ile yüklü bir 10 ml şırınga ve 25G0.5 "iğne kullanarak, olmayan bir doku kaplı petri, kemik iliği yıkayın.
3. Kemik iliği İşleme: (hareket kazıma, yukarı ve aşağı tuşlarını kullanarak), bir tek hücre süspansiyonu haline kemik iliği ayırmak bir 1ml şırınga pistonu kauçuk sonuna kullanın . Kemik iliği, konik bir şahin tüp içinde toplamak ve rezidüel kemik iliği PBS ile yıkayın.

Dendritik hücreler Kültür

1. Bir hemasitometre DC medya ve sayısı DC öncüleri yeniden süspanse hücreleri (Şekil 1). Farklı boyutlarda hücreleri göreceksiniz DC öncüleri en büyük ve en parlak. Ayirt sadece bu hücreleri saymak. Iki femur ve iki tibiaları yabani tip C57BL / 6 fare (eski 6-8 hafta), 25-40 x 10 ⁶ toplam DC öncüleri arasında beklemek gerekir.
   
   
   
   Şekil 1
   
   
2. 2 x ⁵ 10 DC öncüleri / mL, 40 ng / mL rekombinant fare GM-CSF ile desteklenmiş DC medya yoğunluğu Kültür hücreleri . Levha hücreleri, doku kaplı olmayan polistiren petri tabak.

Medya (3 gün)

Medya yenilemek için 40 ng / ml GM-CSF ile desteklenmiş taze medya toplam hacminin yarısını ekleyin.

Bir medya üçüncü (günde 6) ve olgunlaşma değiştirin

Medya yenilemek için, medya toplam hacmin üçte biri dikkatlice çıkarın ve kültür 6 gün 40 ng / ml GM-CSF ile desteklenmiş taze DC medya ile bu sesi yerine.

İsterseniz, dendritik hücreler sitokinler veya toll-benzeri reseptör ligandlar kullanılarak olgunlaşması için teşvik edilebilir. Video, DC'ler 5 ng / ml CpG gecede stimülasyonu ile olgunlaştı.

Dendritik hücreler Harvest

DC kültür, komple (Şekil 2). Hücreler, süspansiyon ve gevşek plaka yapıştırılır hem de olacaktır. Yapıştırılabilen hücreleri, doku kültürü kazıyıcı ile çanak kazıma ve PBS ile durulama silinebilir. Hücrelerinin toplam sayısı, hafta süren kültür ve farklılaşma dönemi sırasında 5-8 kat artacak, bu nedenle, 1-1,6 x ¹⁰ 6 hücre / mL hasat bekliyoruz .

Şekil 2

Reaktifler

1. DC medya
   1. RPMI-1640 ile desteklenmiş medya:
   2. % 10 fetal sığır serumu
   3. 100 IU / ml penisilin
   4. 100 mg / ml streptomisin
   5. % 1 L-glutamin
   6. 0,1% 2-mercaptoethanol
   7. 1X non-esansiyel amino asitler
   8. 1x sodyum piruvat
      
2. GM-CSF Rekombinant fare
   1. rmGM-CSF (Peprotech inc, New Jersey, katalog no. 315-03)

Discussion

DC'ler doğal ve adaptif immün etkileşimlerin çalışmalar için yararlı olur ve bir aşı vektörü olarak istihdam edilebilir. Bu video, in vitro olarak izole etmek ve kemik iliği myeloid dendritik hücrelerin ayırt etmek için adımlar göstermiştir. Kültür dönemini takiben, bu hücrelerin mikroskobik hem olarak yapışık genellikle dendritler sahip hücreler, ve yapışmaz yuvarlak hücreler görüntülendi olabilir. DC'lerin antijen ile darbeli antijen sunumu için manipüle veya sitokin üretimi ve sitokinlerin ve / veya toll-benzeri reseptör ligandlar (inceleme için, bkz. Gilboa, 2008 (2)) kullanarak kostimülatör molekül upregülasyonu için uyarılmış olabilir.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
recombinant murine GM-CSF	Reagent	Peptrotech	315-03