Primaria disociada Mesencéfalo culturas dopamina celulares de roedores recién nacidos

Summary

Primaria disociada del cerebro medio de cultivos celulares permiten la dopamina para el estudio de las características pre-sináptica de las neuronas dopaminérgicas. Pueden ser utilizados para monitorear en tiempo real la cinética de la liberación de dopamina y de la proteína / niveles de ARNm de los reguladores de la exocitosis de dopamina. Aquí te mostramos cómo generar estas culturas de los recién nacidos de roedores.

Abstract

La capacidad de crear cultivos celulares primarios de neuronas de la dopamina permite el estudio de las características pre-sináptica de las neuronas de dopamina en el aislamiento de la entrada general a partir de otras partes del cerebro. En nuestro laboratorio, usamos estas neuronas para evaluar la cinética de liberación de la dopamina con amperometría de fibra de carbono, así como los niveles de expresión de genes relacionados con la dopamina y las proteínas utilizando la PCR cuantitativa y la inmunocitoquímica. En este video, te mostramos cómo generar estas culturas de los recién nacidos de roedores.

El proceso consiste en varios pasos, incluyendo el revestimiento de los astrocitos corticales gliales, el condicionamiento de medios de cultivo celular neuronal por el sustrato gliales, la disección del cerebro medio, en los recién nacidos, la digestión, extracción y revestimiento de las neuronas de dopamina y la adición de factores neurotróficos a garantizar la supervivencia celular.

Las aplicaciones adecuadas para esta preparación incluye la electrofisiología, la inmunocitoquímica, PCR cuantitativa, la microscopía de vídeo (es decir, de la fusión vesicular en tiempo real con la membrana plasmática), los ensayos de viabilidad celular y otras pantallas toxicológicos.

Protocol

Preparación Antes de la Cultura

Nota: las células gliales ** debe ser recubierto con suficiente antelación para que tengan tiempo de proliferar y cubrir el fondo de los platos. Para los ratones con antecedentes genéticos atípicos o experimental, asegúrese de que para que coincida con las culturas gliales y neuronales en términos de genotipo.

Nota: ** 1-7 días antes de la disección, preparar el medio neuronal fresco y reemplazar el medio gliales en los platos con 2 ml.

Nota: ** El día antes de la disección, los siguientes elementos deben quedar bajo la luz UV durante la noche:

• 4 placas de disección
• 2 disociación viales con una barra de agitación magnética micro-
• 2 tapas vial (con dos agujeros pequeños en la parte superior)
• Hacia fuera anillos deslizantes (y abrigo en un 70% EtOH) - salir de la caja abierta también
• POR LO MENOS 2 cajas llenas de color amarillo consejos (10-200μl) pipeta
• 1 caja de color azul (100-1000μl) puntas de pipeta

Día de la Cultura

Nota: * Asegúrese de no tocar nada que quedó fuera por la radiación UV durante la noche!

Mantener un ambiente estéril debajo de la capilla es muy importante.

1) la preparación:

Nota: ** Ponga a un lado todos los ingredientes congelados para solución de papaína.

1. Pinzas limpias con un 70% EtOH. Cubra cada extremo con una punta de pipeta amarilla estéril. Se utiliza para colocar los anillos de estériles de diapositivas en su caja.
2. Plato caliente:
   1. Colocar una placa mini-magnetic/hot bajo el capó con un vaso de 1000 ml lleno de 500-600ml dH ₂ O y una gran barra de agitación magnética.
   2. Coloque un disco de espuma de poliestireno en el vaso justo por encima del nivel del agua.
   3. Deslice el termómetro en un pequeño agujero en el disco de espuma de poliestireno. Dial de calor debe ser ligeramente superior al 2 (para una temperatura de 34 ° C) y agitar el mando debe ser ~ 6.5.
3. PBS:
   1. Preparar PBS estéril y llenar los tubos de 15 ml estéril 15 con 4.6 ml (asegúrese de mantener estériles
      técnica).
   2. Colocar los tubos y el frasco en el hielo junto a la capilla.
4. Carbogen:
   1. Romper un stripette 5 ml de medio y empujar a través de un tapón de goma, de modo que la punta de la stripette sobresale el extremo ancho del tapón.
   2. Coloque el tapón de un frasco de 500 ml con 400-500ml O dH ₂ (extremo roto de stripette debe estar en la O DH _2).
   3. Conecte un tubo en la abertura lateral del matraz.
   4. Cortar la punta de una pipeta de punta amarilla y conectar este al final del tubo (con el lado cortado hacia fuera).
      
      Conecte el tanque carbogen a la punta de la stripette 5 ml.
      
      
5. Prepare la papaína sol'n:
   1. * Utilizar una técnica estéril cuidado.
   2. Mezclar en un recipiente estéril de 50ml tubo.
6. Filtro papaína sol'n en el vial de disociación:
   1. Utilice una unidad de filtración Steriflip y traslado al vial de 25 ml a través de la disociación stripette (o colocar un nuevo filtro de jeringa de 0.2μm en la punta de un émbolo de la jeringa de 20 ml,
      Retire el émbolo y el uso de un stripette (25 ml) para transferir todos los sol'n papaína en la jeringa.
   2. Filtro en el vial de disociación).
   3. Tapar el vial, insertar una jeringa a través del agujero en la tapa y colocar un filtro estéril jeringa 0.2μm a la base de la jeringa.
   4. Conecte el carbogen al filtro y parafina en este lugar. Colocar el vial en la espuma de poliestireno disco / soporte.
      
      * La barra de agitación magnética micro-debe estar en movimiento.
      * El gas debe ser el hacer en el vial.
      * La temperatura debe estabilizarse en 34 ° C.
      
      
7. La disección de preparación:
   1. Lleve el microscopio de disección bajo el capó.
   2. Coloque todos los instrumentos de disección en papel de aluminio, rociado con un 70% EtOH, vierta el exceso y dejar debajo de la capilla que se seque.
8. Preparar el medio neuronal:
   1. Agregar 30 ml de medio fresco neuronal en la incubadora.
9. Diseñar una gran plaza de papel de aluminio y 12 cuadrados más pequeños. Deja las tijeras decapitación con el papel de aluminio. Llene una pequeña caja de espuma de poliestireno con agua helada y dejar todo fuera de la campana.
10. Preparación de la anestesia (ketamina 0.075ml y 0.075ml xzylazine).
11. Obtener al menos 12 cachorros (P0-P2) para 100 planchas. En los ratones, asegúrese de que hay una coincidencia genotipo para toda la camada. Si el genotipo es desconocido, células de la placa de cada cachorro en un plato aparte, mantener un registro exacto de los números del ratón y hacerlas coincidir con las placas de cultivo celular y asegurarse de que los antecedentes genéticos del sustrato gliales es uniforme a través de cultivos celulares.

2) La disección

1. Anestesiar el primer animal con una inyección intraperitoneal. Cuando el animal muestra sedación y no responde a la prueba de una cola-flick, lo puso en hielo durante 30 segundos (hasta hipotermia). Enjuague un pequeño cuadrado de papel de aluminio, DECAPbilitación tijeras, y la cabeza con un 70% EtOH.
2. Decapitar, permitir que la cabeza caiga sobre cuadrados de papel de aluminio y se mueven bajo el capó. Retire con cuidado el cerebro en un tubo de 15 ml de helado de PBS. Coloque el tubo de vuelta en el hielo mientras se quita el cerebro que viene.
3. Repita estos pasos hasta que primero hay tres cerebros en el hielo. Vierta todos los tres cerebros y PBS sobre el plato de primera disección bajo el microscopio. Retire la sección apropiada del cerebro (VTA) y el uso de una pipeta para poner los segmentos en la papaína sol'n. Iniciar un temporizador cuando los primeros segmentos ir pulg
4. Repita 3 pasos anteriores hasta que todos los cerebros están siendo digeridos en papaína. El promedio de tiempo para la digestión debe ser de 2 horas. Los primeros segmentos se han estado en alrededor de 1 hora por el tiempo de las últimas ir pulg
   
   Trate de dividir la diferencia.
   
   
5. * Durante la digestión:
   1. Asegúrese de que la temperatura en el baño es de 34 ° C.
   2. Los segmentos se pueden pegar a la barra de agitación en un primer momento, pero debe hacia fuera el paso del tiempo. Si no, toque el fondo del vial.

3) La trituración:

1. Con una pipeta de transferencia, la transferencia de los segmentos del cerebro a un tubo estéril 15 ml (tratar de evitar el exceso de sol'n papaína) y lavarlos 3 veces con 2 ml de medio calentado gliales de la incubadora. Después de poner los medios de comunicación gliales en el tubo, deje que los segmentos se asiente y luego extraiga cuidadosamente como sol'n tanto como sea posible sin molestar a los segmentos. Cambiar pipetas para evitar la contaminación!
   
   ** No guarde el sol'n que se elimina.
   
   
2. Con una pipeta de transferencia de nuevas trituraciones comienzan en 2 ml de los medios de comunicación gliales. Triturar 25 veces (en evitar que las burbujas de aire) y dejar que el tubo de sentarse por 3 minutos hasta que los segmentos no disociado resolver. Use una pipeta de transferencia para remover y guardar sol'n tanto como sea posible sin molestar a los segmentos en la parte inferior. Mantenga el sobrenadante en un nuevo (estéril) del tubo de 15m.
3. Repita el paso anterior con una pipeta y una pipeta 1000μl 200μl hasta que esté completamente disociados.
4. Triturar 10 veces con una pipeta de transferencia, o hasta que las células son completamente resuspendidas en sol'n.

4) Las células Plating

1. Con una punta de pipeta amarilla que cubre cada punta de las pinzas, cuidadosamente caída de un anillo de diapositivas como centrado en el cristal de la mejor manera posible dentro de cada plato.
2. Ponga 10μl de la solución de células en el hemocitómetro y contar. (Excluir las masas no deseado).
3. Multiplicar el número de células por 10. Este es el número de células / microlitro. Divide 1,000,000-1,500,000 (o densidad deseada) por este número. Este es el número de l añadir al plato.
4. Use la punta de la pipeta para deslizar los anillos en el centro de cada plato, así como agregar l apropiado / plato. Suavemente la placa y el interruptor de consejos para cada plato.
5. Agregar 100μl (de diluido) sol'n GDNF en el interior del anillo de la diapositiva de cada plato.
6. En este momento, el lugar de las bandejas en la incubadora y acerque el soporte neuronal en el cuarto frío.
7. Permiten a las células reposar toda la noche.
8. Al día siguiente: los anillos de eliminar (utilizando las nuevas puntas de pipeta estériles que cubren las puntas de unas pinzas para cada plato)
   

5) La inhibición mitótica: el día siguiente

1. Diluir alícuotas FDU de 1:10 acciones 1000X añadiendo 200μl acciones FDU al MEM 1,8 ml estéril.
2. Añadir 20μl diluida sol'n FDU en el anillo exterior de cada plato. Cambie la punta de la pipeta a menudo. Tapar y volver a la incubadora.
   
   * Molestar los platos tan poco como sea posible para los días próximos 7-10. Compruebe si hay platos infectados y eliminar cualquier infección platos ante los primeros signos de infección. Culturas están listos para las pruebas dentro de 3 semanas.

MEDIA / SOLUCIONES

Media neuronal

(Por 200 ml)

** Es mejor si la condición de que las células de los frascos de la noche antes de su uso para lavados / trituración

Ingrediente	Cantidad	Notas
BSA 5%	0,5 g	Fracción V
MEM líquido	94,0 ml	Sigma
DMEM líquido	80,0 ml	Sigma
F-12 líquido	20,0 ml	Sigma
Glucosa en un 45% de líquido	1,50 ml	Sigma solución
Glutamina 200 mM	0,5 ml	Alícuotas solución de Sigma
Diporzio Conc.	2,0 ml	Sigma solución
Líquido catalasa	0,1 ml
Ácido 0,5 quinurénico	200μl	En NaOH 1N
HCL 5N	50 l

1. Combine los ingredientes (BSA va último) en un 250l botella de plástico.
2. La etiqueta del filtro, y refrigere.

Ácido quinurénico
(FW = 189.2)
0,5 M = 94.6mg/ml
Hacer 8ml stock: 756.8mgKA/8ml NaOH 1N y una pipeta en alícuotas de 200μl ESTÉRIL

DiPorzio los medios de comunicación

A) DiPorzio Conc. Las poblaciones de:

NECESIDAD			Combinar			Alliquot
Aditivo	Solvente	Tubo	Cantidad	ml	ml / tubo	Conc.	Cantidad	# Aliq.
Insulina	20 mM HCl (1)	de plástico	Botella de 250 mg	10	1	25mg/ml	25mg	10
Transferrina	Hank		Botella de 500 mg	5	1	100mg/ml	100mg	5
SOD	Hank		Botella de 70 mg	14	1	5mg/ml	5mg	14
Putrescina	Hank		50mg	3	0.12	20mg/ml	2.4mg	21
Na 2 SeO 3	Hank		0.104mg	10	0.5	10μg/ml	5.2μg	20
T3	10 mM NaOH		2mg	10	0.1	0.20mg/ml	0mg	100
Progesterona	EtOH al 100%	Vidrio	12,5	10	0.05	1.25mg/ml	Use la pipeta
Cortisol	EtOH al 100%	Vidrio	20mg	10	0.02	2.00MG / ml	Use la pipeta

1. 20 mM HCl = 41.5μl conc. HCl/25ml.
2. Hacer la acción 1mg/ml y añadir 104μl de 10 ml.

B) DiPorzio de archivo multimedia:

Aditivo	Cantidad (ml)	Cantidad (ml) X2	Conc. final. mg / ml	Conc. final. Molaridad
Progesterona	0.05	0.1	0.06	200nm
Cortisol	0.02	0.04	0.04	125nM
BSS de Hank	6.21	12.42
Insulina	1	2	25
Na 2 SeO 3	0.5	1	0.01	30 nm
T3	0.1	0.2	0.02	30 nm
SOD	1	2	5
Putrescina	0.12	0.24	2.4	15nm
Transferrina	1	2	100

1. Use un tubo de polipropileno estéril 15 ml de añadir la progesterona y cortisol. Use una pipeta de aspiración y de vacío para acelerar la evaporación de EtOH (utilizar una stripette 5 ml por la mitad y coloque la mitad del camino en el tubo teniendo mucho cuidado de no aspirar el contenido EtOH Mantenga la pipeta firmemente en su lugar con Kimwipes y luego llevar la punta. hasta la marca 500μl situado en el lado del tubo.
2. Añadir las alícuotas siguientes en el orden en que aparecen en la tabla anterior.
3. Después de la adición de insulina, lo que hace que el sol'n nublado, agregar 20μl de 1N NaOH para neutralizar el pH. Sol'n debe ir desde el amarillo al rosa y claro de inmediato. Además, después de la adición de la transferrina, inmediatamente después, 20μl de NaOH 1N, para neutralizar el pH y prevenir la formación de precipitados.
4. Elaboración de 10 ml en una pipeta serológica y se dividen en alícuotas de 5 (un lote).
5. Tienda @ -20 ° C.
6. Puede hacer dos lotes a la vez.

La disociación de Medios

A. La papaína (de 1 vial):

** Prepare días de la siembra justo antes de la disección.

Ingrediente	Cantidad </ Strong>	(Notas) Conc. final.
Cisteína Agua	7.8mL	1 mM de cisteína
Papaína	Varía (* 190μl de la botella de 44.0mg/ml)	20 unidades / ml (400 unidades en total por valor de 20 ml de sol'n)
H & B conc.	2 ml
Carbogen	95% O2 + 5% de CO2
HCl 5N	10μl
0,5% de rojo fenol	20μl	0,001%
Kynurenate 0,5 M	10μl	(En 1N NaOH) 0,5 mM

1. Añadir al agua de la papaína primera cisteína.
2. Agregue el concentrado de H & B., Kynurenate, HCl, y el rojo fenol.
3. Filtro en el vial de disociación (como se describe en las instrucciones de puesta a punto) y conectarse a la carbogen.
   

B. H & B concentrado (100 ml de 5 veces):

Ingredientes	MW	Powder/50ml H 2 O	Conc. (M)	Combine (ml)	Conc. final. (MM)
NaCl	58.44	11,699 g	4	14.5	116
KCl	74.56	3,728 g	1	2.7	5.4
NaHCO3	84.01	4,2 g	1	13	26
NaH 2 PO 4 * H 2 O	137,99	6,90 g	1	1	2
MgSO4	120,38	6,019 g	1	0.5	1
EDTA (ED2-SS)	292	Sigma 5% (que 5g/100ml stock)	0.134	0,3722	0.5
Glucosa	180	Sigma 45%	2.5	5	25
TC H 2 O				62.93

1. Combine las cantidades de las soluciones madre.
2. Dividir en partes alícuotas de 4 ml.
3. Añadir alícuota al agua después de agregar cisteína papaína.
   

C. Agua cisteína (157.5ml de 1X):

Ingredientes	MW	Componentes Polvo (mg)	H 2 O (ml)	Conc. de archivo. (MM)	Combine (ml)	Conc. final. (MM)
CaCl2	147.2	736	10	500	0.6	1,9 mm
Cisteína	121.7	(1.5)	24	20 mm (0,02 M)	10	1,27 mm (0.88)
TC del agua					146.9

1. Hacer y mantener un stock de sol'n CaCl2 0,5 M a 4 ° C
2. Hacer un uso sol'n uno de cisteína y se combinan con otros ingredientes
3. Se dividen en alícuotas de 10 ml de 15,75 y se almacenan a 4 ° C
   

GDNF Preparación

1. Alícuota de preparación:
   1. Disolver estéril, liofilizado pellet de 5μg GDNF con 2.4mL de agua destilada estéril. La concentración de este GDNF sol'n = 2.08μg/mL.
   2. Distribuir el 2.08μg/mL GDNF sol'n en 76.9μl alícuotas en crioviales estériles. Este 160ng = por vial.
   3. Almacenar a -20 ° C.
2. Además de las culturas:
   1. Descongelar una alícuota de cada 8 platos.
   2. Diluir alícuota mediante la adición de los medios de comunicación neuronal 723.1μl / alícuota. Esto hará que una sol'n 160ng/800μl de GDNF.
   3. Agregar 100μl de este sol'n al 2 ml de medio en cada plato para una concentración final de 10ng GDNF por ml.
      

FDU Preparación

FDU-1000X sol'n de archivo:

Ingrediente	Cantidad	(Notas) Conc. final.
Uridina	247 mg	16,5 mg / ml
5-FDU (5-fluorodesoxiuridina)	100 mg (frasco)	6,7 mg / ml
TC del agua	15 ml

1. Hacer un poco más de 15 ml de 16,5 mg / ml uridina.
2. Añadir 15 ml uridina sol'n a la botella de 100 mg de FDU para 6,7 ​​mg / ml sol'n FDU.
3. Dividir en partes alícuotas 200μl y congelar a -20 ° C.

Diluir para su uso:

1. Inhibir el crecimiento de las células no neuronales. Diluir 1:10 1000X de valores mediante la adición de acciones 200μl a 1,8 ml de MEM.
2. Añadir 20μl FDU diluido en el anillo exterior de cada plato. Cambiar las puntas de pipeta con frecuencia. Tapar y volver a la incubadora.

Discussion

Los métodos descritos aquí permiten la resolución de multa de características morfológicas y neuroquímicas de las neuronas dopaminérgicas centrales que se que no esta disponible en un enfoque sistémico o en vivo.

Materials

Materials are included in the protocol text.