Summary
Bu video, besleyici, hücre koşullarda ve ne kadar besleyici sürekli geçit hESC hücre koşulları, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümesini nasıl koruyacağınızı gösteriyor. HESC, Onay pluripotency immünofloresan mikroskobu ile besleyici, hücre koşullarda yetiştirilen da gösterilmiştir. 3 Bölüm 2
Abstract
Bu video MEF plakaları geçiş hESC nasıl fare embriyonik fibroblast besleyici hücre ücretsiz Matrigel plakaları (MEF) besleyici hücreler, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) nasıl büyümeye göstermektedir.
Protocol
hESC kültür günlük bakım
- hESC kültür ortamı, her 24 saatte bir değiştirilmesi gerekir. 4 ° C'de depolanan ES medya stok şişesi, gerekli (6 plaka başına ~ 20ml) çözüm miktarı 50ml şahin tüp içindeki yeri ve bir su banyosunda 37 ° C sıcak çıkarın. Medya ısındı sonra, nihai konsantrasyonu 10 ng 4 saklanan bFGF ° C ekleyin. 4 ° C, kullanımdan hemen sonra geri bFGF stok koy!
- 6 kuyucuğu çıkar ama medya 500μl ~. Girdap enkaz kaldırma için askıya alma kültürü çanak emin olun. BFGF hESC kültür ortamı iyice karıştırılır emin olun ve her bir kuyu için 6 plaka taze medya 3ml ekleyin. Inkübatör plaka geri koyun.
Matrigel üzerine MEFS Yarma hESC
Genellikle MEFS üzerinde hESC bir konfluent 6 plaka 6-kuyucuğu, kuyu, yarma, 4-5 gün sonra tekrar konfluent olma ile Matrigel üzerine 1:3 1:2 bölünmüş olabilir.
- Matrigel, MEF-klimalı ortam (CM) üzerine yarma hESC pluripotency korumak için kullanılır. MEF-klimalı ortamları önceden yapılır. Ilk gününde, 1.5 × 10 7 γ-ışınlanmış MEFS T75 bir balona numaralı seribaşı . Ikinci gününde, oda sıcaklığında 1 × PBS, pH 7.4 ile MEFS kez yıkanır ve sonra 5ng/ml bFGF ile desteklenmiş ES medya 15ml erlene eklenir. (NOT: MEFS daha küçük veya daha büyük şişeler içine kaplı olabilir ama, hücre yoğunluğu ve ES medya hacmi arasındaki oran sabit olmalıdır.) Balon başka bir 24 saat 37 ° C'de inkübe edilir. Üçüncü gününde, CM 15ml 5ng/ml bFGF ile desteklenmiş taze ES medya ile toplanır ve değiştirilir. Toplanan CM 4 ° C'de saklanır. MEFS bir kaplama MEF klimalı ortam oluşturmak için 15 × 7 = 105ml birbirini takip eden yedi gün içinde hasat edilir. Yedi gün sonra, tüm CM fraksiyonları birleştirilir, steril, filtreli, aliquoted ve -20 ° C'de saklanan 1 ay boyunca saklanabilir ve kullanılabilir açıklandığı gibi CM medya hazırladı.
- HESC bölme bir gün önce, 4 ° C gecede Çözülme Eppendorf tüpleri Matrigel alikotları koymak (bir kısım Matrigel, 76.2mg içerir ve bu bir adet 6-plaka için gerekli miktarı). Bölme gününde, bir adet 6-plaka çözülmüş Matrigel bir flakon buz üzerinde soğuk DMEM/F12 medya şişe ve 6ml koymak. Matrigel DMEM/F12 ortama aktarın ve iyice karıştırın. 6 plaka her iyi çözüm 1ml ekleyin. Swirl plaka yüzeyinde Matrigel dağıtmak ve bölme hESC önce en az 1 saat süreyle oda sıcaklığında Matrigel kaplı plaka kuluçkaya yatmaktadır.
- MEFS üzerinde hESC 1 × PBS, pH 7.4 ile bir kez yıkanır. Daha sonra sıcak kollajenaz IV (1mg/ml) 1ml 6-plaka her kuyuya ilave edilir ve plaka 37 inkübe ° C'de 5-10 dakika.
- Her kuyuya bFGF olmadan ES medya 1ml ekleyin. Tabak kapatın kök hücreler uçurmak için 1 ml pipet kullanın. 50ml şahin tüpe hESC ve ölü MEFS kümeleri içeren tüm medya toplayın. MEFS süpernatantı asılı kalırken hESC kümeleri tüpün alt kısmındaki bir granüle böylece hücrelerin büyük öbekler 5-10 dakika razı olsun. Süpernatantı atın ve 5 dakika boyunca 200 gr oda sıcaklığında santrifüj bFGF eksik ES medyayı kullanarak hESC pelet resuspending yıkayın.
- Matrigel plakalar üzerinde kök hücreler plaka için, ilk önce oda sıcaklığında DMEM/F12 (iyi ortalama 1 ml) ve ortalama 10 ng bFGF ile desteklenmiş CM 2.5ml ekleyerek Matrigel plakaları ile yıkayın. Yığınları düzgün ve boyut olarak küçük olana kadar 10 ng bFGF, pipet hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı birkaç kez ile desteklenmiş CM uygun bir hacim pelletini tekrar. Kısım Matrigel plaka üzerinde de ortalama 0.5 ml süspansiyon. Matrigel koloninin yoğunluğu MEFS olağan bölerek yoğunluğu kolonilerin daha yüksek olduğunu unutmayın. 37 ° C doku kültürü inkübatör tabak koyun.
- Matrigel üzerinde hESC korumak için, 10 ng bFGF ile desteklenmiş CM medya 4-5 gün kadar her 24 saatte bir değiştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu video nasıl geçit hESC MEF plakalardan besleyici, hücre Matrigel plakaları göstermektedir. Matrigel koloninin yoğunluğu MEFS olağan bölerek yoğunluğu kolonilerin daha yüksek olduğunu unutmayın. Ekim-4 ve SSEA-4, hESC pluripotency belirteçleri, immünofloresan boyaması ve mikroskobu veya flow sitometri besleyici-kültür koşullarında farklılaşmamış bir devlet hESC bakım onaylamak için ihtiyaç vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Teitell laboratuar İnsan embriyonik kök hücre çalışmaları California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) tohum hibe RS1-00313 tarafından desteklenmektedir. Geniş, UCLA, özellikle Dr. Amander Clark, Dr Jerome Zack ve verdikleri destek için çalışmalarımız UCLA Broad Enstitüsü Kök Hücre Çekirdek Tesis üyeleri Rejeneratif Tıp ve Kök Hücre Araştırma Merkezi üyelerine teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
