Summary
هذا الفيديو يوضح كيفية الحفاظ على نمو خلايا المنشأ الجنينية البشرية (hESCs) في ظروف خالية من الخلايا المغذية وكيفية hESCs مرور مستمرة في تغذية الخلايا خالية من الشروط. تأكيد hESC تعدد القدرات التي تزرع في تغذية الخلايا خالية من الشروط التي المجهري المناعي ويتجلى أيضا. الجزء 3 من 3.
Abstract
هذا الفيديو يوضح كيفية الحفاظ على نمو خلايا المنشأ الجنينية البشرية (hESCs) في ظروف خالية من الخلايا المغذية وكيفية hESCs مرور مستمرة في تغذية الخلايا خالية من الشروط. تأكيد hESC تعدد القدرات التي تزرع في تغذية الخلايا خالية من الشروط التي المجهري المناعي ويتجلى أيضا.
Protocol
hESCs انفصالها عن Matrigel لMatrigel
عادة ما يمكن تقسيم متموجة 6 - جيدا على طبق من hESCs Matrigel 1:03 حتي 1:05 لوحة إلى أخرى Matrigel ، مع الآبار تصبح متكدسة مرة أخرى 4-5 أيام بعد انفصالها.
- وتعد لوحات CM Matrigel كما هو موضح أعلاه قبل تقسيم.
- في يوم من تقسيم ، ويغسل كل بئر لتقسيم مع 1 × PBS ، pH7.4 ، إضافة 1ml من Dispase 1mg/ml (تمييع الحل الأسهم 5mg/ml مع وسائل الاعلام DMEM/F12) إلى كل جيدا ، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- يغسل كل بئر ثلاث مرات مع 1 × PBS ، pH7.4 ، إضافة 1ml من وسائل الإعلام من دون وفاق bFGF ، واستخدام مكشطة الخلية لكشط قبالة المستعمرات قاع البئر ، وجمع hESCs علقت في أنبوب الصقر 50ml ، وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 200G لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- لوحة لإعادة hESCs Matrigel على لوحات ، وغسل أول لوحات Matrigel مع DMEM/F12 وإضافة 2.5ml من CM تستكمل مع bFGF 10ng/ml لكل بئر. Resuspend الكرية hESC في حجم مناسب لCM تستكمل مع bFGF 10ng/ml ، ماصة تعليق خلية صعودا وهبوطا ثلاث مرات. (ملاحظة : عند hESCs لتقسيم تأتي من لوحات Matrigel ، وكتل من السهل جدا لكسر ، وبالتالي ثلاث جولات من pipetting يكفي وأكثر pipetting قد تعطل الإفراط في المستعمرات وتجعل الخلايا واحدة). قسامة 0.5 مل من كتل تعليق في hESC كذلك من لوحة Matrigel 6 - جيدا لتحقيق في 3ml كذلك الحجم النهائي. وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية.
كشف علامات تعدد القدرات التي المجهري المناعي
يستخدم لفحص المجهري المناعي التعبير عن علامات hESC تعدد القدرات أكتوبر - 4 - 4 وSSEA خلال زراعة.
- نضح وسائل الاعلام من بئر واحدة تغسل مع 1 × PBS ، ودرجة الحموضة 7.4. إضافة 2ml من الفورمالديهايد بنسبة 3.7 ٪ إلى البئر لتحديد لمدة 10 دقيقة.
- التشطيف مع 1xPBS ، ودرجة الحموضة 7.4 ، إضافة الميثانول 2ml إلى البئر ومكان عقد الاجتماع -20 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- التشطيف مع 1xPBS ، ودرجة الحموضة 7.4 ، وكتلة مع 1ml من serume البقري بنسبة 0.2 ٪ الزلال (BSA) لمدة 5 دقائق.
- إضافة 1ml الضد من أكتوبر - 4 أو anti-h/mSSEA-4 (1:200 0.2 ٪ في تخفيف BSA) ، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة أو عند 4 درجات مئوية خلال الليل. (ملاحظة : لتلوين SSEA - 4 ، انتقل مباشرة إلى الخطوة 6)
- شطف ثلاث مرات مع 1xPBS ، ودرجة الحموضة 7.4 ، إضافة FITC أرنب ، مترافق مفتش (1:500 0.2 ٪ في تخفيف BSA) ، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- شطف 3 مرات مع 1xPBS ، ودرجة الحموضة 7.4 ، ووضع قطرة من حل تركيب (يمكن أن تحتوي على دابي إذا كان المطلوب التصور النووية) في مركز البئر. ساترة وضع على رأس هذه الخلايا ، وختم مع طلاء الأظافر ، وتقييم بواسطة المجهر المناعي.
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية إيصالات
وفاق وسائل الإعلام (وسائل الإعلام الخلايا الجذعية الجنينية) :
DMEM/F12 -- 400ml
مصل حال محل خروج المغلوب -- 100ML
غير الأحماض الأمينية الأساسية -- 5ml
200MM GlutaMax / BME الحل -- 5ml
البنسلين / الستربتوميسين -- 5ml
تخلط جيدا وتخزينها النهائي الإعلام الثقافة hESC في زجاجات 500ml في 4 درجات مئوية. جيد لمدة أقصاها أسبوعين.
MEF الثقافة وسائل الإعلام :
DMEM -- 1000ml
FBS -- 100ML
غير الأحماض الأمينية الأساسية -- 10ML
الجلوتامين -- 10ML
Penicllin / الستربتوميسين -- 10ML
تخلط جيدا وتخزينها النهائي الإعلام الثقافة MEF في 4 درجات مئوية.
200MM Glutamax / BME الحل :
Glutamax -- 100ML
β - المركابتويثانول (أسهم في حل 14.3M) -- 140 μ1
مزيج حلين جيدا ثم الأجزاء 10ML قسامة. تبقي في aliquots -20 درجة مئوية.
bFGF محلول (تركيز النهائي للسهم : 10 ميكروغرام / مل) :
bFGF (FGF2) -- 50 ميكروغرام
0،1 ٪ في جيش صرب البوسنة 1xPBS ، ودرجة الحموضة 7.4 -- 5ml
حل 50 ميكروغرام في bFGF 5ml BSA 0.1 ٪ لجعل 10 ميكروغرام / مل الأسهم. قسامة في 500 أجزاء ميكرولتر. المحل في -80 درجة مئوية.
رابعا كولاجيناز محلول (1mg/ml) :
كولاجيناز رابعا -- 50mg
DMEM/F12 الإعلام -- 50ml
إضافة إلى مسحوق الرابع كولاجيناز أنبوب الصقر 50ml. في غطاء محرك السيارة ، في مزيج من وسائل الإعلام 50ml DMEM/F12 العقيمة. دوامة الحل ل1 دقيقة <. للتأكد من حل مسحوق. في هود ، ويمر عبر فلتر 0.22 ميكرون إلى أنبوب جديد العقيمة الصقر 50ml. هذا الحل هو جيد لمدة أقصاها أسبوعين من 2 المخزنة في 4 درجات مئوية.
Dispase محلول (1mg/ml) :
Dispase 5mg/ml -- 2ml
وسائل الإعلام DMEM/F12 -- 8ml
قسامة Dispase 5mg/ml التجارية وتخزينها في حل -20 درجة مئوية. لتمييع dispase 1mg/ml DMEM/F12 به. يمكن الاحتفاظ هذا الحل : 1 أسبوع في 4 درجات مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه السلسلة من 3 فيديو يوضح كيفية زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) على الخلايا الليفية الماوس الخلايا الجنينية المغذية (MEF) (فيديو 1) ، وكيفية مرور لهم Matrigel خالية من الخلايا المغذية لوحات (فيديو 2) ، وكيفية المحافظة hESCs بواسطة الركض في تغذية Matrigel خالية من الخلايا الشروط (الفيديو 3). وأظهرت دراسات سابقة عديدة أن صيانة hESCs وقابلة للحياة يتطلب ثقافة غير متمايزة في الخلايا المغذية MEF المعطل. ومع ذلك ، لكثير من التجارب ، لا بد من السكان نقية من hESCs خالية من التلوث الخلايا المغذية. لتحقيق هذا الهدف ، لقد أثبتنا كيفية الانتقال من لوحات hESCs MEF المغذية لتغذية خالية من الخلايا لوحات Matrigel وكيفية الحفاظ على والمستعمرات باستمرار hESC المرور في تغذية ظروف خالية من الخلايا. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن لكمية صغيرة من الخلايا المغذية MEF التلوث لا تزال موجودة في ممر واحد على لوحة Matrigel ، ولكن هذا عادة ما يكون ملوثا من السهل تصور. في مرور اثنين وMatrigel بعده ، وعادة ما توجد أي تلوث MEF ، وترك السكان نقية من hESCs لإجراء التجارب. وهناك حاجة وتلطيخ المناعي الخلوي المجهري أو تدفق للعلامات hESC تعدد القدرات ، مثل أكتوبر وSSEA - 4 - 4 ، لتأكيد الحفاظ على hESCs في حالة غير متمايزة خلال الثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وتدعم الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الدراسات في المختبر Teitell بواسطة معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) منح البذور RS1 - 00313. نشكر أعضاء المركز واسع في الطب التجديدي ، وأبحاث الخلايا الجذعية في جامعة كاليفورنيا ، وخصوصا الدكتور Amander كلارك ، والدكتور جيروم زاك ، وأعضاء معهد الجذعية في جامعة كاليفورنيا واسع مرفق الخلية الأساسية لدعمهم لدراساتنا.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
