Summary
Deze video laat zien hoe het handhaven van de groei van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de feeder cel-vrije omstandigheden en hoe je continu passage hESC' s in de feeder cel-vrije omstandigheden. Bevestiging van hESC pluripotentie gegroeid in feeder celvrije voorwaarden door immunofluorescentie microscopie is ook aangetoond. Deel 3 van 3.
Abstract
Deze video laat zien hoe het handhaven van de groei van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de feeder cel-vrije omstandigheden en hoe je continu passage hESC' s in de feeder cel-vrije omstandigheden. Bevestiging van hESC pluripotentie gegroeid in feeder celvrije voorwaarden door immunofluorescentie microscopie is ook aangetoond.
Protocol
Splitsen van hESC 's van Matrigel naar Matrigel
Meestal een confluente 6-well plaat van hESC 's op de Matrigel kunnen worden gesplitst 1u03-01u05 naar een andere Matrigel plaat, met de putten worden samenvloeiing weer 4-5 dagen na het splitsen.
- CM en Matrigel platen zijn bereid zoals hierboven beschreven voor de splitsing.
- Op de dag van splitsing, wast elk goed voor het splitsen met 1 x PBS, pH 7,4, voeg 1 ml 1mg/ml Dispase (verdunnen 5mg/ml voorraad oplossing met DMEM/F12 media) aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten.
- Was elke well drie keer met 1 x PBS, pH 7,4, 1 ml van ES media toevoegen zonder bFGF, gebruik dan een cel schraper om kolonies te schrapen uit de bodem van de put, het verzamelen van de geschorste hESC 's in een 50 ml falcon buis, en de pellet door centrifugeren bij 200g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Om opnieuw het bord van de hESC 's op Matrigel borden, Was eerst de Matrigel borden met DMEM/F12 en voeg 2,5 ml van CM aangevuld met 10ng/ml bFGF per putje. Resuspendeer de hESC pellet in een geschikt volume van CM aangevuld met 10ng/ml bFGF, pipet de celsuspensie op en neer drie keer. (OPMERKING: Wanneer hESC 's voor het splitsen komen uit Matrigel platen, de klonten zijn zeer gemakkelijk te breken, daarom drie rondes van het pipetteren is genoeg en meer pipetteren kan over-verstoren van de kolonies en maken enkele cellen.) Aliquot 0,5 ml van hESC klonten schorsing per goed van de 6-well Matrigel plaat 3 ml te bereiken per evenals een eindvolume. Plaats de plaat in een 37 ° C incubator.
Detectie van pluripotentie markers door immunofluorescentie microscopie
Immunofluorescentie microscopie wordt gebruikt om de expressie van hESC pluripotentie markers Oct-4 en SSEA-4 tijdens het kweken te onderzoeken.
- Aspireren media van een goed en was met 1 x PBS, pH 7,4. Voeg 2 ml van 3,7% formaldehyde naar de bron om vast gedurende 10 minuten.
- Spoelen met 1xPBS, pH 7,4, voeg 2 ml methanol aan de put en plaats bij -20 ° C gedurende 2 minuten.
- Spoelen met 1xPBS, pH 7,4, en blok met 1 ml van 0,2% bovine serume albumine (BSA) gedurende 5 minuten.
- Voeg 1 ml van oktober-4 of anti-h/mSSEA-4 antilichaam (1:200 verdunning in 0,2% BSA), en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of bij 4 ° C gedurende de nacht. (NB: voor SSEA-4 kleuring, ga direct naar stap 6)
- Spoel drie keer met 1xPBS, pH 7,4, voeg FITC-geconjugeerd konijn IgG (1:500 verdunning in 0,2% BSA), en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Spoel drie keer met 1xPBS, pH 7,4, en zet een daling van montage-oplossing (kunnen bevatten DAPI als nucleaire visualisatie is gewenst) in het midden van de put. Zet dekglaasje op de top van de cellen, afdichting met nagellak, en te evalueren door immunofluorescentie microscopie.
Menselijke embryonale stamcellen ontvangsten
ES media (embryonale stamcellen media):
DMEM/F12 - 400ml
Knockout Serum Vervanger - 100ml
Niet-essentiële aminozuren - 5ml
200MM Glutamax / BME Oplossing - 5ml
Penicilline / streptomycine - 5ml
Meng goed en laatste hESC Cultuur Media in 500ml flesjes bewaren bij 4 ° C. Goed voor een maximum van twee weken.
MEF Cultuur Media:
DMEM - 1000ml
FBS - 100ml
Niet-essentiële aminozuren - 10ml
Glutamine - 10ml
Penicllin / Streptomycine - 10ml
Meng goed en bewaar laatste MEF Cultuur Media bij 4 ° C.
200MM Glutamax / BME Oplossing:
Glutamax - 100ml
β-mercapto-ethanol (Stock oplossing bij 14.3M) - 140 μ1
Meng twee oplossingen goed en vervolgens 10 ml aliquot porties. Houd porties bij -20 ° C.
bFGF Solution (uiteindelijke concentratie van voorraad: 10 microgram / ml):
bFGF (FGF2) - 50 ug
0,1% BSA in 1xPBS, pH 7,4 - 5 ml
Los 50 microgram bFGF in 5 ml 0,1% BSA aan een 10 ug / ml bouillon te maken. Aliquot in 500 pi porties. Bewaren bij -80 ° C.
Collagenase IV Solution (1mg/ml):
Collagenase IV - 50mg
DMEM/F12 Media - 50ml
Voeg de collagenase IV poeder om een 50 ml falcon buis. In de kap, mix in 50 ml van de steriele DMEM/F12 media. Vortex de oplossing voor <1 min. om te controleren of het poeder is opgelost. In de kap, passeren door een 0,22 urn filter in een nieuwe steriele 50 ml falcon buis. Deze oplossing is goed voor een maximaal 2 weken bewaard bij 4 ° C.
Dispase Solution (1mg/ml):
Dispase 5mg/ml - 2ml
DMEM/F12 Media - 8ml
Aliquot commerciële 5mg/ml Dispase oplossing en bewaar bij -20 ° C. Verdunnen dispase om 1mg/ml met behulp van DMEM/F12. Deze oplossing kan worden gehouden voor 1 week bij 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze reeks van drie video's laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen (video 1), hoe passage ze feeder cel-vrije platen (video 2) Matrigel, en hoe te onderhouden hESC 's door de passage in Matrigel feeder cel-vrije omstandigheden (video 3). Tal van eerdere studies toonden aan dat instandhouding van levensvatbare, ongedifferentieerde hESC 's vereist cultuur op geïnactiveerde MEF feeder-cellen. Echter, voor veel experimenten, is een zuivere populatie van hESC 's vrij van feeder-cel verontreiniging vereist. Om dit doel te bereiken, hebben we aangetoond hoe de passage hESC 's van MEF feeder platen om feeder celvrije Matrigel platen en hoe te onderhouden en continu passage hESC kolonies in feeder cel-vrije omstandigheden. Door het volgen van dit protocol, kan een kleine hoeveelheid van de MEF feeder cel besmetting nog steeds bestaan passage een op een Matrigel plaat, maar deze verontreiniging is meestal gemakkelijk te visualiseren. Op Matrigel passage twee en verder, is er geen MEF besmetting meestal te vinden, waardoor een zuivere populatie van hESC 's voor experimenten. Immunofluorescentiekleuring en microscopie of flowcytometrie voor hESC pluripotentie markers, zoals Oct-4 en SSEA-4, zijn nodig om het onderhoud van hESC 's in een ongedifferentieerde staat tijdens de cultuur te bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Menselijke embryonale stamcellen studies in de Teitell lab worden ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) Seed Grant RS1-00313. Wij danken de leden van de globale Centrum voor Regeneratieve Geneeskunde en Stamcelonderzoek aan de UCLA, in het bijzonder Dr Amander Clark, Dr Jerome Zack, en leden van de UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility voor hun steun aan onze studies.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
