Summary
וידאו זה מדגים כיצד לשמר את הצמיחה של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) בתא ללא תנאים מזין וכיצד ברציפות hESCs מעבר במזין תא ללא תנאים. אישור hESC pluripotency גדל מזין תאים ללא תנאים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence באה לידי ביטוי גם. חלק 3 מתוך 3.
Abstract
וידאו זה מדגים כיצד לשמר את הצמיחה של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) בתא ללא תנאים מזין וכיצד ברציפות hESCs מעבר במזין תא ללא תנאים. אישור hESC pluripotency גדל מזין תאים ללא תנאים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence באה לידי ביטוי גם.
Protocol
פיצול hESCs מ Matrigel כדי Matrigel
בדרך כלל צלחת 6-ומחוברות היטב hESCs על Matrigel ניתן לפצל 1:03-01:05 עוד צלחת Matrigel, עם בארות להפוך ומחוברות שוב 4-5 ימים לאחר פיצול.
- CM וצלחות Matrigel מוכנים כמתואר לעיל לפני הפיצול.
- ביום של פיצול, לשטוף היטב עבור כל פיצול עם 1 × PBS, pH7.4, להוסיף 1ml של 1mg/ml Dispase (לדלל פתרון מניות 5mg/ml עם DMEM/F12 התקשורת) זה טוב, דגירה על 37 ° C במשך 3 דקות.
- לשטוף היטב כל שלוש פעמים עם 1 × PBS, pH7.4, להוסיף 1ml של ES התקשורת ללא bFGF, השתמש מגרד תא לגרד את מושבות בתחתית הבאר, לאסוף את hESCs מושעה בצינור בז 50 מ"ל, ו גלולה ידי צנטריפוגה 200 גרם ב 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- כדי בצלחת מחדש hESCs על צלחות Matrigel, תחילה לשטוף את הצלחות Matrigel עם DMEM/F12 ולהוסיף 2.5ml של CM בתוספת 10ng/ml bFGF לכל טוב. Resuspend hESC גלולה בהיקף מתאים של CM בתוספת 10ng/ml bFGF, פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה שלוש פעמים. (הערה: כאשר hESCs עבור פיצול באים צלחות Matrigel, גושים קל מאוד לשבור, ולכן שלושה סיבובים של pipetting מספיק ועוד pipetting עלול לשבש את יתר המושבות ולהפוך תאים בודדים). Aliquot 0.5 מ"ל של השעיה hESC גושים לכל גם הצלחת Matrigel 6-היטב כדי להשיג 3ml לכל גם נפח סופי. מניחים את צלחת 37 ° C חממה.
זיהוי סמנים pluripotency ידי מיקרוסקופית immunofluorescence
מיקרוסקופיה immunofluorescence משמש כדי לבחון את הביטוי של סמנים hESC pluripotency אוקטובר-4-4 ו SSEA במהלך culturing.
- לשאוב מדיה מאחד לשטוף היטב עם 1 × PBS, pH 7.4. הוסף 2ml של פורמלדהיד 3.7% ל גם לתקן עבור 10 דקות.
- לשטוף עם 1xPBS, pH 7.4, להוסיף מתנול 2ml אל הבאר מקום -20 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
- לשטוף עם 1xPBS, pH 7.4, ולחסום עם 1ml של serume שור 0.2% אלבומין (BSA) עבור 5 דקות.
- הוסף 1ml של נוגדן אוקטובר-4 או anti-h/mSSEA-4 (1:200 דילול ב -0.2% BSA), ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 או 4 ° C למשך הלילה. (הערה: עבור מכתים SSEA-4, לעבור ישירות לשלב 6)
- לשטוף שלוש פעמים עם 1xPBS, pH 7.4, להוסיף FITC-מצומדות ארנב IgG (1:500 דילול ב -0.2% BSA), ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
- לשטוף 3 פעמים עם 1xPBS, pH 7.4, ולשים ירידה של פתרון הרכבה (יכול להכיל DAPI אם להדמיה גרעינית הרצוי) במרכז היטב. שים coverslip על גבי התאים, חותם עם לק, ולהעריך על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence.
אדם בתאי גזע עובריים קבלות
ES התקשורת (תא גזע עובריים התקשורת):
DMEM/F12 - 400ml
נוק סרום תחליף - 100 מ"ל
שאינם חיוניים חומצות אמינו - 5 מ"ל
200mm GlutaMax / BME פתרון - 5 מ"ל
פניצילין / סטרפטומיצין - 5 מ"ל
מערבבים היטב ולאחסן הסופי תרבות מדיה hESC בבקבוקים 500ml ב 4 ° C. טוב לכל היותר שבועיים.
MEF התרבות מדיה:
DMEM - 1000ml
FBS - 100 מ"ל
שאינם חיוניים חומצות אמינו - 10 מ"ל
גלוטמין - 10 מ"ל
Penicllin / סטרפטומיצין - 10 מ"ל
מערבבים היטב ולאחסן הסופי תרבות מדיה MEF ב 4 ° C.
הפתרון 200mm Glutamax / BME:
Glutamax - 100 מ"ל
β-mercaptoethanol (פתרון במלאי ב 14.3M) - 140 μ1
מערבבים היטב שני פתרונות ואז 10ml מנות aliquot. שמור aliquots ב -20 ° C.
bFGF פתרון (הריכוז הסופי של המניה: 10 מיקרוגרם / מ"ל):
bFGF (FGF2) - 50 מיקרוגרם
0.1% ב BSA 1xPBS, pH 7.4 - 5 מ"ל
ממיסים 50 מיקרוגרם bFGF ב BSA 0.1% 5 מ"ל לעשות המניה 10 מיקרוגרם / מ"ל. Aliquot לתוך μl 500 חלקים. חנות ב -80 ° C.
Collagenase IV פתרון (1mg/ml):
Collagenase IV - 50 מ"ג
DMEM/F12 מדיה - 50 מ"ל
מוסיפים את אבקת IV collagenase לצינור בז 50 מ"ל. ב למכסה המנוע, לערבב 50 מ"ל של DMEM/F12 התקשורת סטרילית. הפתרון וורטקס דקות 1 <. כדי לוודא את אבקת מתמוסס. ב למכסה המנוע, לעבור 0.22 מיקרומטר לסנן לתוך צינור חדש סטרילי בז 50 מ"ל. פתרון זה הוא טוב לכל היותר 2 שבועות מאוחסנים 4 ° C.
Dispase פתרון (1mg/ml):
Dispase 5mg/ml - 2ml
DMEM/F12 מדיה - 8ml
Dispase מסחרי Aliquot 5mg/ml פתרון ולאחסן ב -20 ° C. מדולל dispase כדי 1mg/ml באמצעות DMEM/F12. פתרון זה יכולים להישמר במשך שבוע 1 ב 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זו סדרה של 3 סרטונים מדגים כיצד לגדול בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) על פיברובלסטים עכבר עובריים (MEF) תאים מזין (וידאו 1), כיצד מעבר להם Matrigel תא ללא מזין צלחות (וידאו 2), וכיצד לשמור על hESCs ידי passaging במזין Matrigel תא ללא תנאים (וידאו 3). מחקרים קודמים הראו כי רבים ותחזוקה של, hESCs קיימא מובחן דורש על התרבות תאים מזין מומת MEF. עם זאת, ניסויים רבים, אוכלוסיה טהורה של hESCs ללא זיהום תא מזין נדרשת. כדי להשיג מטרה זו, אנו הדגימו כיצד hESCs קטע מתוך צלחות MEF מזין מזין את התאים ללא צלחות Matrigel וכיצד לשמור ברציפות hESC מעבר מושבות מזין תנאי התא חינם. על ידי ביצוע בפרוטוקול זה, כמות קטנה של זיהום תא MEF מזין עדיין יכול להתקיים במעבר אחד על צלחת Matrigel, אך זיהום זה הוא בדרך כלל קל לדמיין. במעבר Matrigel שניים מעבר, זיהום MEF לא נמצא בדרך כלל, משאיר האוכלוסייה טהור של hESCs לניסויים. מכתים immunofluorescence ו cytometry מיקרוסקופית או זרימה עבור סמנים hESC pluripotency, כגון אוקטובר-4 ו SSEA-4, יש צורך לאשר אחזקת hESCs במצב מובחן במהלך התרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
האדם מחקרים בתאי גזע עובריים במעבדה Teitell נתמכים על ידי המכון לרפואה בקליפורניה הרגנרציה (CIRM) זרע מענק RS1-00313. אנו מודים לחברי המרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית ואת המחקר בתאי גזע ב-UCLA, במיוחד ד"ר Amander קלארק, ד"ר ג'רום זק, וחברי רחבה UCLA מכון מתקן נייד Core גזע על תמיכתם של מחקרים שלנו.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
