Summary
Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) no alimentador livre de células condições e como hESCs contínua passagem de alimentação livre de células condições. Confirmação de CTEh pluripotência cultivadas em alimentador livre de células ao microscópio de imunofluorescência condições também é demonstrada. Parte 3 de 3.
Abstract
Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) no alimentador livre de células condições e como hESCs contínua passagem de alimentação livre de células condições. Confirmação de CTEh pluripotência cultivadas em alimentador livre de células ao microscópio de imunofluorescência condições também é demonstrada.
Protocol
HESCs divisão de Matrigel para Matrigel
Normalmente, uma placa de 6 bem-confluentes de hESCs em Matrigel pode ser dividida 01:03 - 01:05 para outra placa Matrigel, com os poços se tornar confluentes novamente 4-5 dias após a divisão.
- CM e placas Matrigel estão preparados como descrito acima antes de se separarem.
- No dia da separação, lavar cada cavidade para dividir com 1 × PBS, pH7.4, adicionar 1 ml de 1mg/ml Dispase (solução diluída de ações 5mg/ml com DMEM/F12 media) a cada poço e incube a 37 ° C por 3 min.
- Lavar cada cavidade três vezes com 1 × PBS, pH7.4, adicionar 1 ml de ES mídia sem bFGF, use um raspador de células para raspar as colônias fora do fundo do poço, recolher o hESCs suspensas em um tubo falcon 50ml, e pellet por centrifugação a 200g por 5 min à temperatura ambiente.
- Para re-placa do hESCs em placas Matrigel, primeiro lavar as placas com Matrigel DMEM/F12 e adicionar 2,5 ml de CM suplementado com 10ng/ml bFGF por poço. Ressuspender o sedimento em CTEh um volume adequado de CM suplementado com 10ng/ml bFGF, pipetar a suspensão célula para cima e para baixo três vezes. (NOTA: Quando hESCs para dividir vêm de placas Matrigel, as touceiras são muito fáceis de quebrar, por isso três rodadas de pipetagem é suficiente e mais de pipetagem pode perturbar o over-colônias e fazer uma única célula.) Alíquota 0,5 ml de suspensão CTEh aglomerados por poço da placa Matrigel 6-bem para conseguir 3ml por poço como um volume final. Coloque a placa em um 37 ° C incubadora.
Detecção de marcadores pluripotência por microscopia de imunofluorescência
Microscopia de imunofluorescência é usado para examinar a expressão de marcadores de pluripotência CTEh Oct-4 e SSEA-4 durante o cultivo.
- Aspirar media de um bem e lave com 1 × PBS, pH 7.4. Adicionar 2 ml de formaldeído 3,7% para o bem de correção para 10 min.
- Enxágüe com 1xPBS, pH 7,4, adicionar 2 ml de metanol para o bem e coloque a -20 ° C por 2 min.
- Enxágüe com 1xPBS, pH 7,4, e bloquear com 1ml de 0,2% serume albumina bovina (BSA) por 5 min.
- Adicionar 1 ml de Oct-4 ou anti-h/mSSEA-4 anticorpos (diluição de 1:200 em 0,2% BSA), e incubar em temperatura ambiente por 1 hora ou a 4 ° C durante a noite. (NOTA: para SSEA-4 coloração, vá diretamente para a etapa 6)
- Enxaguar três vezes com 1xPBS, pH 7,4, acrescentar FITC-conjugado IgG de coelho (1:500 diluição em 0,2% BSA), e incubar em temperatura ambiente por 1 hora.
- Lave 3 vezes com 1xPBS, pH 7,4, e colocar uma gota de solução de montagem (pode conter DAPI se visualização nuclear é desejado) no centro do poço. Coloque lamela em cima das células, selo com unha polonês, e avaliar por microscopia de imunofluorescência.
Humana recibos células-tronco embrionárias
ES mídia (media células-tronco embrionárias):
DMEM/F12 - 400ml
Knockout Serum Replacer - 100ml
Não-essenciais Aminoácidos - 5ml
200mM Solução Glutamax / BME - 5ml
Penicilina / estreptomicina - 5ml
Misture bem e guarde Meios de Cultura finais CTEh em garrafas de 500ml a 4 ° C. Bom para um máximo de duas semanas.
Cultura MEF Media:
DMEM - 1000ml
FBS - 100ml
Não-essenciais Aminoácidos - 10ml
Glutamina - 10ml
Penicllin Estreptomicina / - 10ml
Misture bem e guarde Meios de Cultura finais MEF a 4 ° C.
Solução Glutamax / BME 200mM:
Glutamax - 100ml
β-mercaptoetanol (solução stock de 14,3) - 140 μ1
Misture duas soluções bem e, em seguida, porções de 10ml alíquota. Manter alíquotas a -20 ° C.
bFGF Solution (concentração final de estoque: 10 microgramas / ml):
bFGF (FGF2) - 50 mg
BSA 0,1% em 1xPBS, pH 7,4 - 5ml
Dissolver 50 microgramas bFGF em BSA 0,1% 5ml para fazer um estoque mcg / ml 10. Alíquota em porções de 500 mL. Armazenar a -80 ° C.
Colagenase IV Solução (1mg/ml):
Colagenase IV - 50mg
DMEM/F12 Media - 50ml
Adicione o colagenase IV pó para um tubo falcon 50ml. Na capa, mix em 50ml de estéril DMEM/F12 mídia. Solução para o Vortex <1 min. para se certificar de que o pó esteja dissolvido. No capô, passam por um filtro de 0,22 mM em um novo tubo estéril falcon 50ml. Esta solução é boa para um máximo de duas semanas armazenadas a 4 ° C.
Dispase Solution (1mg/ml):
Dispase 5mg/ml - 2ml
Mídia DMEM/F12 - 8ml
Alíquota de solução de 5mg/ml Dispase comerciais e armazenar a -20 ° C. Diluir dispase a 1mg/ml usando DMEM/F12. Esta solução pode ser mantida por uma semana a 4 ° C.
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Discussion
Esta série de três vídeos demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em fibroblastos de rato células embrionárias (MEF) alimentador (vídeo 1), como passagem para os Matrigel livre de células alimentador de placas (vídeo 2), e como manter a hESCs por passaging em Matrigel alimentação livre de células condições (vídeo 3). Numerosos estudos anteriores mostraram que a manutenção de viabilidade, hESCs indiferenciado requer a cultura em células alimentadoras inativado MEF. No entanto, para muitas experiências, uma população de pura hESCs livre de contaminação de células de alimentação é necessária. Para atingir este objetivo, temos demonstrado como hESCs passagem de placas MEF para alimentador alimentador livre de células placas Matrigel e como manter e continuamente colônias passagem CTEh no alimentador condições livre de células. Ao seguir este protocolo, uma pequena quantidade de MEF contaminação de células alimentador ainda poderia existir em uma passagem em uma placa Matrigel, mas este contaminante é geralmente fácil de visualizar. Na passagem Matrigel dois e além, sem contaminação MEF é normalmente encontrado, deixando uma população de pura hESCs para experimentos. Imunofluorescência e citometria de fluxo para microscopia ou marcadores CTEh pluripotência, como Oct-4 e SSEA-4, são necessários para confirmar a manutenção de hESCs em um estado indiferenciado durante a cultura.
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Acknowledgments
Humana estudos de células-tronco embrionárias no laboratório Teitell são suportados por um Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa (CIRM), as sementes conceder RS1-00313. Agradecemos a membros do Centro de Medicina Regenerativa Broad e Investigação em Células Estaminais na Universidade da Califórnia, especialmente Dr. Amander Clark, Dr. Jerome Zack, e membros do Instituto Broad Stem UCLA Facility núcleo celular para o seu apoio de nossos estudos.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
