Summary
इस वीडियो यह दर्शाता है कि कैसे निमेटोड, सी. एलिगेंस में synaptic समारोह का अध्ययन करने के लिए पूरक तरीके में दो तंत्रिका उत्तेजक, aldicarb और pentylenetetrazole (PTZ), रोजगार के लिए. इस पूरक दृष्टिकोण भी modulating neuronal synchrony लिए evolutionarily संरक्षित तंत्र पर प्रकाश डाला करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और मिर्गी और बरामदगी के लिए निहितार्थ है.
Protocol
Aldicarb एक्सपोजर प्रतिमान
- पहले दिन पर, यह सुनिश्चित है कि कम से कम तीस प्रत्येक जीनोटाइप और प्रत्येक को दोहराने के की युवा वयस्क मंच कीड़े दूसरे दिन aldicarb assays के लिए उपलब्ध हो जाएगा. यह सबसे अच्छा है अगर एक experimenter ताजा एन जी एम प्लेटों पर पचास या अधिक L4 मंच कीड़े (सबसे अच्छा Nystatin के बिना) है, जो ई. होते हैं का चयन कोली (अधिमानतः OP50) एक खाद्य स्रोत के रूप में, और एक सुसंगत और अनुमोदक (20 ° 22 सी डिग्री सेल्सियस सबसे अच्छा है, हालांकि 25 डिग्री सेल्सियस ठीक है). तापमान पर 12-24 घंटे के लिए उन्हें विकसित
- दूसरे दिन पर, 70% इथेनॉल (EtOH) और 30% DDH 2 ओ के साथ aldicarb के 100 मिमी शेयर समाधान बनाने बिखरा हुआ है परिभाषित संस्करणों के साथ एन जी एम शून्य Nystatin प्लेटों पर aldicarb की उचित राशि के लिए वांछित aldicarb सांद्रता को प्राप्त करने के. हम लगातार चढ़ाना द्वारा 7.5 एमएल एन जी एम प्लेटों पर 0.5 मिमी aldicarb 100 मिमी aldicarb के 37.5 μL उपयोग. Aldicarb प्लेटें मोटे तौर पर कमरे के तापमान पर 30-60 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें. यह lids के दरार के लिए आवश्यक नहीं है. वैकल्पिक रूप से, aldicarb एन जी एम जोड़ा जा सकता है और 4 बजे ° एक सप्ताह के लिए सी संग्रहीत.
- ई. के सूखने की थाली के संगत संस्करणों के बाद प्रत्येक aldicarb थाली के केंद्र और कमरे के तापमान पर एक और 30-60 मिनट के लिए सूखी पर कोलाई (अधिमानतः OP50) . हम लगातार OP50 के 25 μL थाली है, जो एक पर्याप्त आकार के भोजन के लिए भीड़भाड़ के बिना एक छोटी सी जगह में केंद्रित कीड़े रखने के लॉन बनाता है.
- जब खाना लॉन सूखा है, एक aldicarb assays के साथ आगे बढ़ना हो सकता है. Aldicarb assays के व्यक्तिपरक प्रकृति के कारण, यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि प्रयोगों का प्रदर्शन किया "आँख बंद करके". प्राथमिक experimenter के एक सहयोगी assayed हो कीड़े के साथ मूल प्लेटें पुनः लेबल सकता है. इसी तरह, सहकर्मी कीड़े एक टाइमर शुरू करने से पहले मूल प्लेटें से ciphered aldicarb प्लेटों को तुरंत हस्तांतरण कर सकते हैं. यदि experimenter uncoordination के रूप में एक विशेषता phenotype के साथ कीड़े की एक विशेष तनाव की परख करने की क्रिया की आशंका है, तो वहाँ भी पूर्वाग्रह को कम करने के लिए एक समान phenotype के साथ एक नियंत्रण होना चाहिए. इसके अलावा, यह सबसे अच्छा है अगर experimenter एक जंगली प्रकार के तनाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मदद प्रयोगों को मानकीकृत करने के लिए समानांतर में एक प्रतिरोधी तनाव और एक अत्यंत अनुभुत तनाव, assays. experimenter के लिए प्रत्येक को दोहराने के लिए कीड़े के एक सुसंगत संख्या का विश्लेषण करने का प्रयास करना चाहिए. हम लगातार प्रत्येक को दोहराने के लिए एक एकल जीनोटाइप के तीस कीड़े विश्लेषण. हम भी कम से कम तीन पर प्रदर्शन एक प्रयोग के लिए replicates. एक अनुभवी experimenter एक समय में कम से कम छह उपभेदों का विश्लेषण करने में सक्षम होना चाहिए.
- एक सुसंगत तरीके में प्रत्येक कीड़ा उकसाने एक प्लैटिनम तार के साथ द्वारा झोले के मारे हुए कीड़े की संख्या की गणना. हम लगातार हमारे सिर पर दो बार और दो बार पूंछ तीन घंटे की कुल के लिए हर 30 मिनट पर कीड़े ठेस. Pharyngeal पंप की समाप्ति भी पक्षाघात परिभाषित किया जा सकता है, लेकिन सिर्फ अगर experimenter सभी assays पर एक पक्षाघात के अनुरूप परिभाषा को रोजगार. इसके अलावा, यह ध्यान देने योग्य बात है कि कुछ कीड़े, विशेष रूप से उन है कि aldicarb करने के लिए प्रतिरोधी रहे हैं, बंद प्लेट क्रॉल करने का प्रयास कर सकते हैं लायक है. इस मामले में, experimenter aldicarb प्लेटें के आसपास palmitic एसिड, कीड़ा हरकत के लिए एक शारीरिक बाधा के अनुरूप राशि, फैल सकता है. हम 10 मिलीग्राम palmitic एसिड / एमएल EtOH के 25 μL फैल गया.
PTZ एक्सपोजर प्रतिमान
- पहले दिन पर, यह सुनिश्चित है कि कम से कम तीस प्रत्येक जीनोटाइप और प्रत्येक को दोहराने के की युवा वयस्क मंच कीड़े दूसरे दिन PTZ assays के लिए उपलब्ध हो जाएगा. यह सबसे अच्छा है अगर एक experimenter ताजा एन जी एम प्लेटों पर पचास या अधिक L4 मंच कीड़े (सबसे अच्छा Nystatin के बिना) है, जो ई. होते हैं का चयन कोली (अधिमानतः OP50) एक खाद्य स्रोत के रूप में, और एक सुसंगत और अनुमोदक (20 ° 22 सी डिग्री सेल्सियस सबसे अच्छा है, हालांकि 25 डिग्री सेल्सियस ठीक है). तापमान पर 12-24 घंटे के लिए उन्हें विकसित
- दूसरे दिन, एक 0.5 ग्राम / PTZ एमएल DDH PTZ 2 हे स्टॉक समाधान बनाते हैं. वांछित PTZ सांद्रता को प्राप्त करने के एन जी एम शून्य परिभाषित संस्करणों के साथ Nystatin प्लेटों पर PTZ की उचित मात्रा में बिखरा हुआ है. क्योंकि हम PTZ के लिए खुराक - प्रतिक्रिया assays पसंद करते हैं, हम प्लेट 7.5 एमएल एन जी एम प्लेटों पर PTZ की मात्रा बदलती. उदाहरण के लिए, एक थाली कर सकते हैं एक 7.5 एमएल एन जी एम थाली पर 37.5 PTZ शेयर समाधान के μL 5 मिग्रा / PTZ एमएल समाधान बनाने के लिए. PTZ प्लेटें कमरे के तापमान पर मोटे तौर पर 60-120 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें. यह lids के दरार के लिए आवश्यक नहीं है. वैकल्पिक रूप से, PTZ एन जी एम सीधे जोड़ा जा सकता है, लेकिन इसे तुरंत solidifying के बाद assays के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. PTZ की स्थिरता aldicarb की तुलना में काफी कम है. इसलिए, बड़े PTZ प्लेटों के साथ assays कम विश्वसनीय हैं. PTZ desiccator में -20 डिग्री सेल्सियस पर उपयोग करने से पहले एक सुखाने एजेंट के साथ संग्रहीत किया जाना चाहिए. हम PTZ लगभग दो महीने त्यागने के लिए स्थिरता सुनिश्चित करने के खोलने के बाद करना पसंद करते हैं.
- ई. के सूखने की थाली के संगत संस्करणों के बाद कोली (OP50 अधिमानतः)प्रत्येक PTZ थाली और कमरे के तापमान पर एक और 30-60 मिनट के लिए सूखी के केंद्र पर. हम लगातार OP50 के 25 μL थाली है, जो एक पर्याप्त आकार के भोजन के लिए भीड़भाड़ के बिना एक छोटी सी जगह में केंद्रित कीड़े रखने के लॉन बनाता है.
- जब खाना लॉन सूखा है, एक PTZ assays के साथ आगे बढ़ना हो सकता है. हालांकि PTZ assays कम aldicarb assays से व्यक्तिपरक हैं, यह अभी भी अत्यधिक की सिफारिश की है कि प्रयोगों का प्रदर्शन किया "आँख बंद करके". प्राथमिक experimenter के एक सहयोगी assayed हो कीड़े के साथ मूल प्लेटें पुनः लेबल सकता है. इसी तरह, सहकर्मी कीड़े एक टाइमर शुरू करने से पहले मूल प्लेटें से ciphered PTZ प्लेटों को तुरंत हस्तांतरण कर सकते हैं. यदि experimenter uncoordination के रूप में एक विशेषता phenotype के साथ कीड़े की एक विशेष तनाव की परख करने की क्रिया की आशंका है, तो वहाँ भी पूर्वाग्रह को कम करने के लिए एक समान phenotype के साथ एक नियंत्रण होना चाहिए. इसके अलावा, यह सबसे अच्छा है अगर experimenter एक जंगली प्रकार के तनाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पूर्वकाल या पूर्ण शरीर आक्षेप के साथ उपभेदों मदद प्रयोगों को मानकीकृत करने के लिए समानांतर में, assays. experimenter के लिए प्रत्येक को दोहराने के लिए कीड़े के एक सुसंगत संख्या का विश्लेषण करने का प्रयास करना चाहिए. हम लगातार प्रत्येक को दोहराने के लिए एक एकल जीनोटाइप के तीस कीड़े विश्लेषण. हम भी कम से कम तीन पर प्रदर्शन एक प्रयोग के लिए replicates. एक अनुभवी experimenter एक समय में कम से कम तीन उपभेदों का विश्लेषण करने में सक्षम होना चाहिए. फिर भी, और PTZ प्रेरित आम तौर पर जोखिम के 15-30 मिनट के बीच शिखर आक्षेप, और तब आवृत्ति तीव्रता attenuate के रूप में कीड़े झोले के मारे हुए हो या कुछ मामलों में, दवा के लिए acclimate.
- "मिरगी की तरह" कीड़े convulsing एक घंटे के एक कुल के लिए हर 30 मिनट की संख्या गिनो. पूर्वकाल आक्षेप, जो हम "सिर bobs" कॉल के साथ कीड़े की संख्या स्कोर, अलग से पूरे शरीर आक्षेप, पूरे शरीर पक्षाघात, जो हम कॉल "टॉनिक" या का एक संयोजन के साथ कीड़े की संख्या से यह सबसे अच्छा है BWM पक्षाघात के साथ पूर्वकाल आक्षेप है, जो हम "टॉनिक - अवमोटन 'कहते हैं. एक एकल जीनोटाइप के अधिकांश कीड़े ऐंठन की केवल एक तरह दिखा रहे हैं. हालांकि, टॉनिक - अवमोटन कीड़े अक्सर पूरी तरह से टॉनिक हो जाते हैं, तो एक 30 मिनट के पिछले परख जारी है, भले ही सभी कीड़े पहले से ही आक्षेप प्रदर्शन किया है चाहिए. इसके अलावा, यह ध्यान देने योग्य बात है कि कुछ कीड़े बंद प्लेट क्रॉल करने का प्रयास कर सकते हैं लायक है. इस मामले में, experimenter PTZ प्लेटों के आसपास palmitic एसिड की एक सुसंगत मात्रा में फैल सकता है. हम 10 मिलीग्राम palmitic एसिड / एमएल EtOH के 25 μL फैल गया.
Aldicarb और PTZ चयनित सी एलिगेंस Synaptic पारेषण म्यूटेंट के व्यवहार प्रतिक्रियाएँ
| उत्परिवर्ती नाम | Synaptic भूमिका | औषधि के बिना व्यवहार | Aldicarb करने के लिए व्यवहार रिस्पांस (जंगली प्रकार N2 तुलना में) | PTZ के लिए व्यवहार रिस्पांस |
|---|---|---|---|---|
| टॉम 1 (ok188) | synaptic प्रसारण को रोकता | बेबुनियाद | पक्षाघात की बढ़ी हुई दर | जंगली प्रकार से अप्रभेद्य |
| unc-43 (n498n1186) | जटिल | बेबुनियाद | पक्षाघात की बढ़ी हुई दर | पूर्ण शरीर आक्षेप |
| unc 25 (e156) | GABA संचरण को बढ़ावा देता है | बेबुनियाद | पक्षाघात की बढ़ी हुई दर | पूर्वकाल आक्षेप, पूरे शरीर पक्षाघात |
| SNB 1 (md247) | synaptic प्रसारण को बढ़ावा देता है | बेबुनियाद | पक्षाघात की कम दर | पूर्वकाल आक्षेप |
| unc-4 (e120) | ACH संचरण को बढ़ावा देता है | बेबुनियाद | पक्षाघात की कम दर | जंगली प्रकार से अप्रभेद्य |
दो तंत्रिका उत्तेजक, एक acetylcholinesterase अवरोध करनेवाला, aldicarb बुलाया, और एक GABA रिसेप्टर प्रतिपक्षी, pentylenetetrazole (PTZ) कहा जाता है, एक पूरक तरीके से सी एलिगेंस synaptic प्रसारण म्यूटेंट विशेषताएँ इस्तेमाल किया जा सकता है. अत्यधिक उत्तेजक (ACH) acetylcholine ACH संचरण की नकारात्मक नियामकों में हानिकारक परिवर्तन से कीड़ा शरीर दीवार neuromuscular जंक्शनों (NMJs) में जम जाता है (जैसे टॉम 1 unc-43) या निरोधात्मक GABA संचरण (जैसे, UNC-25) के सकारात्मक नियामकों. इसके विपरीत, कीड़ा NMJs पर उत्तेजक ACH स्तर सामान्य synaptic (उदाहरण के लिए, SNB-1) संचरण या ACH विशेष संचरण जीन (जैसे unc 4) के सकारात्मक नियामकों में हानिकारक परिवर्तन के द्वारा कम कर रहे हैं. जब जंगली प्रकार N2 कीड़े की तुलना में, NMJs पर ऊंचा उत्तेजक ACH संचरण के साथ उत्परिवर्ती कीड़े aldicarb प्रेरित पक्षाघात की बढ़ी दरों का प्रदर्शन, जबकि कम उत्तेजक ACH संचरण के साथ उत्परिवर्ती कीड़े aldicarb प्रेरित पक्षाघात की कम दरों का प्रदर्शन. हालांकि सी एलिगेंस शरीर दीवार की मांसपेशियों पर PTZ aldicarb विपरीत neuronal synchrony नहीं बाधित, PTZ भी सी. एलिगेंस सिर मांसपेशियों पर निरोधात्मक GABA antagonizes. एक परिणाम के रूप में, aldicarb संवेदनशीलता सही PTZ संवेदनशीलता की भविष्यवाणी नहीं कर सकते हैं. नकारात्मक या सकारात्मक regul में विशिष्ट दोष के साथ उत्परिवर्ती कीड़ेACH संचरण के व्यावहारिक जंगली प्रकार PTZ की उपस्थिति में N2 कीड़े से अप्रभेद्य हैं, जबकि सामान्य synaptic पारेषण या निरोधात्मक GABA संचरण एक्ज़िबिट मजबूत PTZ प्रेरित पूर्वकाल आक्षेप में विशिष्ट दोष के सकारात्मक विनियमन में दोष के साथ उत्परिवर्ती कीड़े. इसके अलावा, unc 43 नुकसान के समारोह म्यूटेंट PTZ की उपस्थिति में पूरे शरीर आक्षेप प्रदर्शन और संभावना अतिरिक्त synaptic प्रसारण असामान्यताएं, जो उनके अद्वितीय दवा प्रतिक्रियाओं के लिए योगदान है.
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Discussion
सी. के साथ aldicarb प्रदर्शन के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल एलिगेंस प्रयोगकर्ताओं ACH और synaptic प्रसारण में सामान्यीकृत घाटे के साथ संचरण म्यूटेंट में विशिष्ट घाटे के साथ म्यूटेंट के बीच भेद करने के लिए, के रूप में म्यूटेंट दोनों वर्गों aldicarb प्रतिरोध प्रदर्शन के लिए अनुमति नहीं है. इसी तरह, aldicarb निर्धारित करने के लिए अगर म्यूटेंट GABA संचरण या सामान्यकृत विफलताओं में विशिष्ट घाटे नकारात्मक ACH संचरण को विनियमित करने के लिए, के रूप में म्यूटेंट दोनों वर्गों aldicarb hypersensitivity प्रदर्शन नहीं किया जा इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारे PTZ जोखिम assays, जब aldicarb जोखिम assays से परिणामों के साथ संयुक्त है, से परिणाम के शोधकर्ताओं बेहतर synaptic प्रसारण म्यूटेंट विशेषताएँ करने की अनुमति देता है.
सी एलिगेंस synaptic प्रसारण म्यूटेंट पूरक aldicarb और PTZ जोखिम मानदंड द्वारा एक सरल तरीके में वर्गीकृत किया जा सकता है. Aldicarb PTZ प्रेरित पूर्वकाल आक्षेप के साथ प्रतिरोधी म्यूटेंट की संभावना सामान्य synaptic समारोह में कमी कर रहे हैं. विपरीत, aldicarb PTZ प्रेरित पूर्वकाल आक्षेप बिना प्रतिरोधी म्यूटेंट की संभावना ACH संचरण में विशेष रूप से कमी है. Aldicarb अतिसंवेदनशीलता, जो PTZ प्रेरित पूर्वकाल आक्षेप प्रदर्शन नहीं करते के साथ म्यूटेंट, संभावना नकारात्मक ACH संचरण को विनियमित करने के लिए असफल. अंत में, aldicarb hypersensitivity के साथ म्यूटेंट, जो एक्ज़िबिट PTZ प्रेरित पूर्वकाल आक्षेप की संभावना कमी GABA हैं.
aldicarb जोखिम की उपयोगिता भी अपनी आत्मीयता से कमजोर है, अलग प्रयोगकर्ताओं अक्सर पक्षाघात की परिभाषा अलग है के रूप में. एक एकल experimenter तकनीक भी उतार चढ़ाव हो सकते हैं. इसके अलावा, aldicarb उजागर कीड़े उकसाने के विविध बलों के जवाब में अलग चाल. एक झोले के मारे हुए कीड़ा और एक संवेदनशील कीड़ा के बीच अंतर के रूप में एक मामूली सिर या पूंछ चिकोटी के रूप में सूक्ष्म जा सकता है. सी. की बेहतर लक्षण वर्णन के लिए aldicarb assays के पूरक के अलावा एलिगेंस synaptic संचरण म्यूटेंट, PTZ भी aldicarb करने के लिए hypersensitivity के साथ synaptic प्रसारण म्यूटेंट, विशेष रूप से उन म्यूटेंट को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रयोगकर्ता, जो PTZ जोखिम का उपयोग बस पूर्वकाल आक्षेप के लिए देखो, हो सकता है aldicarb प्रेरित पक्षाघात में सूक्ष्म अंतर के बजाय>
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Acknowledgments
हम सभी काल्डवेल लैब के सदस्यों के सहकारी भावना को स्वीकार चाहते हैं. एक तुलसी ऑफ डाइम्स के मार्च और एक कैरियर पुरस्कार के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से GAC से O'Connor विद्वान पुरस्कार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक अंडर ग्रेजुएट रिसर्च विज्ञान कार्यक्रम हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट से अलबामा के विश्वविद्यालय के लिए अनुदान, neuronal excitability और वित्त पोषित है काल्डवेल लैब में मिर्गी अनुसंधान.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Aldicarb | Reagent | Supelco, Sigma-Aldrich | PS734 | Purchasable from Sigma |
| Pentylenetetrazole | Reagent | Sigma-Aldrich | P6500 |
References
- Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay. Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).
- Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans. Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).
