Summary
SDD - AGE هو تقنية مفيدة للكشف وتوصيف اميلويد مثل البوليمرات في الخلايا. هنا علينا أن نظهر للتكيف الذي يجعل هذه التقنية قابلة للتطبيقات واسعة النطاق.
Abstract
ويرتبط مع العديد من تجميع اميلويد الأمراض misfolding البروتين وراء خصائص البريونات المعدية ، والتي هي conformationally الذاتي قالبي templating البروتينات التي يعتقد أن لها أدوار مفيدة في أقل الكائنات الحية. وقد Amyloids بالغ الصعوبة لدراسة بسبب عدم التجانس والصلابة الهيكلية. ومع ذلك ، فقد تم قرار من البوليمرات اميلويد على أساس حجم واللاانحلال المنظفات ممكن عن طريق تغيير طبيعة شبه منظفات - Agarose الكهربائي جل (SDD - AGE). هذا الأسلوب هو العثور على الاستخدام الواسع النطاق للكشف وتوصيف المتغيرات اميلويد بتكوين جزئي. هنا ، علينا أن نظهر للتكيف من هذه التقنية التي تسهل استخدامه في تطبيقات واسعة النطاق ، مثل شاشات البريونات للرواية والبروتينات amyloidogenic الأخرى. الجديد SDD - AGE يستخدم أسلوب نقل الشعرية لمزيد من الموثوقية وسهولة الاستخدام ، ويسمح استيعاب أي هلام الحجم. وبالتالي ، يمكن معالجة عدد كبير من العينات ، وأعدت من الخلايا البروتينات أو المنقى ، في الوقت نفسه عن وجود SDS - الملتزمون غير قابلة للذوبان البروتينات المفتاحية.
Protocol
الجزء 1 : تحضير هلام
- تجميع علبة صب جل. ويمكن استخدام المعدات القياسية للالكهربائي الحمض النووي الأفقي. لأعداد كبيرة من العينات ، ونحن نستعد سم 20 × 24 سم البلاطة مع ما يصل الى 50 أمشاط جيدا الأربعة. تأكد من لوح لايوجد خدوش ، وهذه يمكن أن تشوه صورة لطخة.
- ايجاد حل agarose 1.5 ٪ (متوسطة أو عالية القوة هلام ، تكافؤ فرص العمل قليلة) في تاي 1X. ينبغي أن تكون كافية لحجم غمر أسنان المشط تماما -- ستحتاج لتحميل عينة أكبر قدر ممكن لتعظيم الكشف. الميكروويف الخليط حتى يذوب تماما agarose.
- إضافة SDS بسرعة إلى 0.1 ٪ من الأسهم 10 ٪. دوامة إلى المزيج. إذا كانت بعض agarose يتصلب خلال هذه الخطوة ، redissolve باستخدام صفيحة ساخنة وتوخي الحذر لتجنب الغليان.
- من أجل الحل في درج الصب. استخدام المشط لأشعل النار من أي فقاعات ، لأنها يمكن أن تتداخل مع نقل في وقت لاحق.
- وقد وضعت بعد جيل ، وإزالة أمشاط ووضع الجل في خزان هلام. يغرق تماما في الجل 1X TAE تحتوي على 0.1 ٪ SDS.
الجزء 2 : تحضير عينات
- الإنتاجية العالية للتحليل lysates الخميرة ، ونحن نبدأ مع 2 مل الثقافات نمت بين عشية وضحاها مع الانفعالات السريعة في كتل 96 - جيدا. في هذه الحالة ، كل ثقافة هو overexpressing بروتين من الفائدة. عند تحليل البروتينات وفرة منخفضة ، يجب استخدام كميات أكبر ثقافة
- حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 2000 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- Resuspend الخلايا في جهاز الطرد المركزي والمياه مرة أخرى.
- Resuspend في حل 1 مل spheroplasting. احتضان لحوالي 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية (قد تؤكد كفاءة spheroplasting بواسطة الفحص المجهري).
- الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 800 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف.
- Resuspend spheroplasts مكعبات في 100 مل تحلل العازلة.
- تغطية كتلة مع الشريط ودوامة على سرعة عالية لمدة 2 دقيقة.
- بيليه الحطام الخلوي في 4000 RCF لمدة 2 دقيقة.
- إزالة بعناية طاف إلى حاوية جديدة ، على سبيل المثال ، وكذلك لوحة 96 - PCR.
- إذا رغبت في ذلك ، تحديد تركيز البروتين من lysates.
- إضافة 4X العازلة العينة إلى عينات لتوليد lysates 1X العازلة التي تحتوي على العينة. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تحميل هلام. إذا رغبت في ذلك ، حفظ نصف حجم العينة وأنها تغلي لSDS - PAGE التحليل. من أجل رصد مدى نقل في وقت لاحق ، وتشمل ما قبل الملطخة SDS - PAGE علامة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام علامة الوزن الجزيئي التي تتكون من البروتينات كبيرة جدا (على سبيل المثال ، والدجاج استخراج الصدرية) لتقدير أحجام المجمعات حلها.
- تشغيل في الجهد المنخفض (3 ≤ طول هلام V / سم) حتى تصل إلى الجبهة صبغ ~ 1 سم من نهاية الجل. وسوف يستغرق ذلك عدة ساعات. من المهم أن تظل جل بارد ، وإلا نشر منخفضة الوزن الجزيئي بروتين (على سبيل المثال ، مونومرات) يمكن أن تحد من الكشف عنها.
الجزء 3 : نقل
- قطع قطعة من النيتروسليلوز للأبعاد نفس الجل.
- 20 قطعة من قطع GB004 و 8 قطع من الورق النشاف GB002 ، للأبعاد نفس الجل. قطع قطعة إضافية من GB004 لاستخدامه بمثابة الفتيل ؛ جعله حوالي 20 سنتيمترا على نطاق أوسع من هلام.
- غمر النيتروسليلوز ، الفتيل ، و 4 قطع من GB002 في TBS 1X.
- في وعاء من البلاستيك وتجميع كومة من الأوراق على النحو التالي : 20 قطعة من GB004 الجافة ، ثم 4 قطع من GB002 الجافة ، ثم قطعة واحدة من قبل GB002 الرطب. النيتروسليلوز وضع على رأس هذا المكدس.
- شطف الجل على الدرج لفترة وجيزة في صب الماء لإزالة الزائدة العازلة على التوالي. ثم ، تبدأ بعناية لشريحة الجل قبالة الدرج إلى المكدس. في حين ينزلق الجل قبالة الدرج ، مع غشاء اخماد TBS حسب الضرورة. المخزن المؤقت إضافية تساعد على منع هذه الفقاعات من أن تصبح محاصرين تحت الجل. ماصة نقل يعمل بشكل جيد لهذا الغرض.
- بعد أن تم نقله الجل إلى المكدس ، تحقق بدقة عن الفقاعات. إذا أي وجود ، ورفع حافة جل وتطبيق العازلة حتى يمكن عمل فقاعات الخروج.
- وضع الثلاثة المتبقية قبل المبللة GB002 القطع على قمة هلام. ضمان الاتصال بين جميع طبقات شامل من قبل المتداول ماصة بحزم عبر الجزء العلوي من المكدس.
- الجناح المكدس نقل مع اثنين من الأدراج التي تحتوي على TBS مرتفعة. ثنى الفتيل قبل الرطب عبر مكدس بحيث يتم إما مغمورة نهاية الفتيل في TBS.
- تغطية المكدس نقل تجميعها مع علبة بلاستيكية إضافية تحمل الوزن الزائد (على سبيل المثال ، زجاجة 500 مل من الماء).
- السماح للنقل على المضي مدة لا تقل عن ثلاث ساعات ، أو بين عشية وضحاها.
- بعد نقل ، يمكن معالجتها من خلال الغشاء القياسية الغربية النشاف.
Spheroplasting الحل
1.2 D - M السوربيتول
0.5 مم MgCl 2
20 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 7.5
50 ملي BME (إضافة جديدة)
0.5 ملغ / مل Zymolyase 100T (إضافة جديدة)
coration : تسطير "؛ الاحتياطي تحلل>
100 ملي تريس 7.5
50 ملي كلوريد الصوديوم
10 ملي BME (إضافة جديدة)
مثبطات الأنزيم البروتيني (إضافة جديدة)
4X نموذج العازلة
2X TAE
20 ٪ الجلسرين
8 ٪ SDS
زرقة البروموفينول إلى تفضيل
Discussion
وكانت أول SDD - AGE بواسطة Kryndushkin آخرون 1 ، لدراسة SDS المقاوم للمجمعات [PSI +] بريون في الخميرة ، ولقد وجدت دراسة على نطاق واسع منذ استخدام كلا بريون وعدم بريون المجاميع 2-9. ومع ذلك ، نقل البروتينات إلى غشاء التالية الكهربائي في هلام agarose إشكالية ، ويمكن أن يؤدي في صورة مشوهة لطخة 5. بالإضافة إلى ذلك ، تقنية المغمورة electroblotting الأكثر استخداما يقدم القيود العملية لحجم الهلام ، وبالتالي عدد العينات التي يمكن معالجتها. وقد تناولنا هذه المشاكل من خلال توظيف نقل الشعرية النزولي 10 ، وهو إجراء بسيط والذي يستخدم كومة من الأوراق الجافة النشاف لنقل البروتينات من الهلام إلى غشاء النيتروسليلوز. نقل الشعرية يمنع تشويه ويسمح معالجة المواد الهلامية كبيرة بسهولة. هناك بضعة أشياء يجب مراعاتها قبل استخدام SDD - AGE. لعينات الخام (على سبيل المثال ، lysates) ، مناعي من بروتينات معينة أمر ضروري. SDD - AGE لا تفسد تماما مجمعات البروتين من الفائدة ، ولذلك فإن بروتين (ق) ليتم الكشف يجب أن تحمل علامة حاتمة خارج المنطقة amyloidogenic. عموما يمكن Lysates يكون مستعدا لأنها ستكون لSDS - PAGE عادية ، مع اثنين من الاختلافات الهامة. أولا ، يجب زيادة العناية التي يجب اتخاذها لمنع تدهور بواسطة التحلل البروتيني. تغيير طبيعة الظروف جزئيا المستخدمة هنا ليست كافية لتعطيل البروتياز ، ويمكن أيضا جعل البروتينات المستهدفة أكثر عرضة للتحلل البروتين. استخدام مثبطات الأنزيم البروتيني كوكتيل في تركيز كامل على الأقل شقين الموصى بها. ثانيا ، ينبغي تجنب التدفئة العينات. إذا كان هو المطلوب لمراقبة جميع مونومر سلبية ، على سبيل المثال للتأكد من أن ارتفاع الوزن الجزيئي الأنواع ليست بسبب التعديلات التساهمية ، والحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية يمكن استخدامها ، والتي سوف استعادة معظم amyloids موحودي للبروتين.
Acknowledgments
نشكر سايمون البرتي للمساعدة في تطوير هذا البروتوكول. وأيد هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد القومية للصحة (GM25874) ، ومعهد هوارد هيوز الطبي Investigatorship (لSL) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم منح التدريب predoctoral (لRH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zymolyase 100T | Seikagaku Corporation | 120493-1 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78429 | |
| Hybond-C extra nitrocellulose | Amersham | RPN303E | |
| GB004 blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 10427926 | |
| GB002 (3MM Chr) blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-917 | |
| Agarose (UltraPure) | Invitrogen | 15510-027 |
References
- Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).
- Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION. J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).
- Allen, K. D., et al. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+]. Genetics. 169, 1227-1242 (2005).
- Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation. The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).
- Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase. Current Genetics. 49, 21-29 (2006).
- Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids. J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).
- Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability. Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).
- Douglas, P. M., et al. Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).
- Nagy, B., Costello, R., Csako, G. Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping. Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).
