Summary
SDD-AGE является полезным методом для обнаружения и характеризации амилоид-подобных полимеров в клетках. Здесь мы показываем, адаптации, что делает эту технику поддаются крупномасштабных приложений.
Abstract
Амилоида агрегации связано с многочисленными неправильного фолдинга белков и лежит в основе патологии инфекционных свойств прионы, которые являются конформационно самостоятельно шаблонов белки, которые, как считается, оказывают благотворное ролей в низших организмов. Амилоиды были трудны для изучения из-за их неразрешимости и структурные неоднородности. Тем не менее, разрешение амилоидных полимеров в зависимости от размера и моющих средств нерастворимость стало возможным по Полу-денатурирующих моюще-электрофореза в агарозном геле (SDD-AGE). Эта техника находит широкое применение для выявления и характеристики амилоидных конформационных вариантов. Здесь мы демонстрируем адаптации этой технологии, что облегчает его использование в крупномасштабных приложений, таких как экраны для романа прионы и других амилоидогенный белков. Новые SDD-AGE метод использует капиллярную передачи для большей надежности и простоты использования, и позволяет любому размеру гель быть размещены. Таким образом, большое количество образцов, полученных из клеток или очищенные белки, могут быть обработаны одновременно на наличие SDS-нерастворимых конформеров меченых белков.
Protocol
Часть 1: Подготовка гель
- Соберите лоток гель литья. Стандартное оборудование для горизонтального электрофореза ДНК могут быть использованы. Для большого количества образцов, мы готовим 20 см х 24 см плита с четырьмя 50-а гребни. Убедитесь, что плита не имеет царапин, так как они могут искажать пятно изображения.
- Создать 1,5% агарозном решение (средний или высокий гель-прочность, низкая РВЗ) в 1X TAE. Объем должен быть достаточно, чтобы полностью погрузить в воду гребень зубы - вы хотите загрузить столько образец, как можно максимально обнаружения. Микроволновая смесь, пока агарозном полностью не растворится.
- Быстро добавить SDS до 0,1% с 10% акций. Swirl перемешать. Если некоторые агарозном застывает на этом этапе, растворяться использованием горячей плите и будьте осторожны, чтобы избежать кипения.
- Залейте раствор в литье лоток. Используйте расческу разгребать любые пузыри, так как они в дальнейшем могут помешать передаче.
- После гель установил, удалить гребни и место гель в гель бак. Полностью погрузиться геля в 1X TAE, содержащем 0,1% SDS.
Часть 2: Подготовка образцов
- Для высокой пропускной анализ дрожжей лизатов, мы начинаем с 2-мл культуры выращивали в течение ночи с быстрым агитации в 96-и блоков. В этом случае, каждая культура гиперэкспрессией белка интересов. При анализе белков низкого изобилия, больших объемов культура должна быть использована
- Урожай клетки центрифугированием при 2000 RCF в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют клетки в воде и центрифуга снова.
- Ресуспендируют в 1 мл spheroplasting решение. Инкубируйте в течение примерно 30 минут при 30 ° С (Вы можете подтвердить spheroplasting эффективность микроскопия).
- Центрифуга при 800 RCF в течение 5 мин при комнатной температуре. Полностью удалить супернатант.
- Ресуспендируют гранулированный сферопластов в 100 мл буфера для лизиса.
- Крышка блока с лентой и вихря на высокой скорости в течение 2 мин.
- Гранул распада клеток при 4000 RCF в течение 2 мин.
- Осторожно удалите супернатант в новый контейнер, например, 96-луночного ПЦР пластины.
- При необходимости определения концентрации белка лизатов.
- Добавить 4X буфера образца образцы для получения лизатов содержащие 1X образец буфера. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Нагрузка геля. При желании, сохранить половину объема образца и варить на SDS-PAGE анализа. Для того, чтобы контролировать степень передачи позже, включают предварительно окрашенные SDS-PAGE маркером. Кроме того, маркер молекулярного веса, состоящие из очень большого белки (например, куриные грудной экстракта) может быть использована для оценки размеров решены комплексы.
- Выполнить при низком напряжении (≤ 3 В / см длины геля) до красителя перед достигает ~ 1 см от конца геля. Это займет несколько часов. Важно, что гель остается прохладным, в противном случае диффузии низкомолекулярных белков весом (например, мономеры) может ограничить их обнаружения.
Часть 3: Трансфер
- Отрежьте кусок нитроцеллюлозы к тому же размеры, как и гель.
- Сокращение на 20 частей GB004 и 8 частей GB002 промокательной бумаги, к тому же размеры, как и гель. Вырезать дополнительная часть GB004 для использования в качестве фитиля; сделать его примерно на 20 сантиметров шире, чем гель.
- Погрузите нитроцеллюлозы, фитиль и 4 части GB002 в 1X TBS.
- В пластиковом контейнере, собрать кипу бумаг следующим образом: 20 штук сухих GB004, то 4 части сухой GB002, то одна часть предварительно мокрой GB002. Положите нитроцеллюлозы на вершине этого стека.
- Промойте гель на литье лоток кратко в воде, чтобы удалить лишнюю работает буфера. Затем, осторожно начинает скользить гель с лотка в стек. Передвигая гель от лотка, потушить мембраны с TBS по мере необходимости. Дополнительный буфер помогает предотвратить пузыри стать оказавшиеся под гелем. Передачи пипетки хорошо подходит для этой цели.
- После геля была перемещена в стек, тщательно проверить на пузыри. Если таковые имеются, поднимите край геле и повторно буфер, пока пузырьки могут быть выработаны.
- Положите оставшиеся три предварительно смачивается GB002 штук на верхнюю часть геля. Достаточная контактов между всеми слоями путем прокатки пипетки твердо в верхней части стека.
- Пашина передачи стек с двумя лотками содержащие повышенные TBS. Пелерина предварительно мокрой фитиль через стек, что либо конец фитиля погружают в TBS.
- Обложка собраны передачи стек дополнительный лоток пластмассового подшипника лишний вес (например, 500 мл бутылки воды).
- Разрешить передачу проводили в течение не менее трех часов, или на ночь.
- После передачи, мембраны могут быть обработаны стандартной западной промокательной.
Решение Spheroplasting
1,2 М Д-сорбитол
0,5 мМ MgCl 2
20 мМ Трис, рН 7,5
50 мМ BME (добавить свежие)
0,5 мг / мл Zymolyase 100T (добавить свежие)
coration: подчеркнуть; "> Лизис буфера
100 мМ Трис 7,5
50 мМ NaCl
10 мМ BME (добавить свежие)
ингибиторы протеаз (добавить свежие)
4X буфера Пример
2X ТАЕ
20% глицерина
8% SDS
бромфенола синий со своими предпочтениями
Discussion
SDD-AGE было впервые сообщено Kryndushkin и соавт. 1, для изучения SDS-устойчивые комплексы [PSI +] прионов в дрожжах, и с тех пор нашел широкое применение как изучение прионов и не прионных агрегатов 2-9. Тем не менее, передача белков мембраны следующие электрофореза в геле агарозы проблематично, и может привести к искажению изображения пятно 5. Кроме того, погруженные electroblotting техника наиболее часто используется вводит практические ограничения на размер геля и, следовательно, количество образцов, которые могут быть обработаны. Мы рассматривали эти проблемы, используя вниз капиллярной передачи 10, простая процедура, которая использует стек сухого промокательной бумаги передачи белков из геля на нитроцеллюлозные мембраны. Капиллярный перенос предотвращает искажения и позволяет крупным гели для обработки легко. Есть несколько вещей, чтобы рассмотреть, прежде чем использовать SDD-AGE. Для сырой образцы (например, лизатов), иммунодетекции специфических белков необходимо. SDD-AGE не в полной мере денатурации белковых комплексов интерес, поэтому белок (ы) для обнаружения должны нести эпитопа теги вне амилоидогенный регионе. Лизаты в общем случае может быть подготовлен как они были бы для нормального SDS-PAGE, с двумя важными отличиями. Во-первых, увеличилась необходимо соблюдать осторожность, чтобы предотвратить деградацию путем протеолиза. Частично денатурирующих условиях используется здесь не достаточно для инактивации протеиназы, а также может сделать белков-мишеней более восприимчивы к протеолиза. Используйте полный коктейль ингибиторов протеаз по крайней мере в два раза рекомендованной концентрации. Во-вторых, нагревание образцов следует избегать. Если все-мономера отрицательного контроля требуется, например, чтобы подтвердить, что высоким молекулярным весом виды не из-за ковалентные модификации, 10-минутной инкубации при 95 ° С может быть использован, который восстановит самые амилоиды на мономерные белки.
Acknowledgments
Мы благодарим Саймон Альберти за помощь в разработке этого протокола. Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья (GM25874), Медицинского института Говарда Хьюза Investigatorship (для SL) и Национального научного фонда грант predoctoral обучения (для RH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zymolyase 100T | Seikagaku Corporation | 120493-1 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78429 | |
| Hybond-C extra nitrocellulose | Amersham | RPN303E | |
| GB004 blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 10427926 | |
| GB002 (3MM Chr) blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-917 | |
| Agarose (UltraPure) | Invitrogen | 15510-027 |
References
- Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).
- Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION. J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).
- Allen, K. D., et al. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+]. Genetics. 169, 1227-1242 (2005).
- Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation. The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).
- Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase. Current Genetics. 49, 21-29 (2006).
- Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids. J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).
- Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability. Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).
- Douglas, P. M., et al. Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).
- Nagy, B., Costello, R., Csako, G. Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping. Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).
