Summary
SDD-AGE היא טכניקה יעילה לגילוי ואפיון של עמילואיד פולימרים דמויי תאים. כאן אנו מדגימים עיבוד שעושה בטכניקה זו מקובל יישומים בקנה מידה גדול.
Abstract
צבירה עמילואיד קשורה רבים misfolding פתולוגיות חלבון בבסיס המאפיינים זיהומיות של פריונים, שהם conformationally עצמית בניית תבנית חלבונים, כי הם חשבו שיש תפקידים מועילים אורגניזמים נמוכה יותר. Amyloids היה קשה ללמוד לשמצה בשל שבחוסר שלהם הטרוגניות מבנית. עם זאת, החלטה של פולימרים עמילואיד על בסיס גודל שבחוסר אבקת כבר מתאפשרת על ידי חצי Denaturing דטרגנט-agarose ג'ל אלקטרופורזה (SDD-AGE). טכניקה זו היא למצוא שימוש נרחב לגילוי ואפיון של וריאנטים עמילואיד קונפורמציה. הנה, אנחנו מדגימים עיבוד של טכניקה זו המאפשרת את השימוש בו יישומים בקנה מידה גדול, כגון מסכי עבור פריונים הרומן amyloidogenic חלבונים אחרים. השיטה החדשה SDD-AGE משתמשת להעביר נימי של אמינות גדולה יותר וקלות השימוש, והוא מאפשר לכל ג'ל בגודל להיות לאכלס. לכן, מספר גדול של דגימות, שהוכן תאים או חלבונים מטוהרים, יכול להיות מעובד בו זמנית עבור נוכחות של SDS מסיס conformers של החלבונים המתויגים.
Protocol
חלק 1: הכנת ג'ל
- להרכיב את מגש הליהוק ג'ל. ציוד סטנדרטי עבור אלקטרופורזה DNA אופקי יכול לשמש. עבור מספר גדול של דגימות, אנו מכינים 20 ס"מ X 24 ס"מ לוח עם עד ארבעה 50-היטב מסרקים. ודא הלוח אין שריטות, כמו אלה יכולים לעוות את התמונה כתם.
- יצירת פתרון 1.5% agarose (בינונית או גבוהה ג'ל חוזק, EEO נמוך) ב 1X טה. הנפח צריך להיות מספיק כדי לצלול לחלוטין את השיניים מסרק - אתה רוצה לטעון מדגם ככל האפשר על מנת למקסם את הזיהוי. מיקרוגל התערובת עד agarose הוא נמס לגמרי.
- להוסיף במהירות SDS עד 0.1% מן המניות של 10%. מערבולת לערבב. אם agarose כמה מבצרת במהלך שלב זה, redissolve באמצעות צלחת חמה להיזהר רותחים.
- יוצקים את הפתרון למגש הליהוק. שימוש במסרק לרוקן את כל הבועות, כפי שהם יכולים מאוחר יותר להפריע ההעברה.
- לאחר ג'ל קבע, להסיר מסרקים והמקום הג'ל לתוך הטנק ג'ל. לחלוטין את ג'ל 1X טה לצלול המכיל 0.1% SDS.
חלק 2: הכנת דוגמאות
- ניתוח תפוקה גבוהה של lysates שמרים, אנחנו מתחילים עם 2-ml תרבויות גדל לילה טוב 96-חוסם עם תסיסה מהירה. במקרה זה, כל תרבות היא overexpressing חלבון של עניין. בניתוח חלבונים בשפע נמוך, תרבות כרכים גדולים יש להשתמש
- קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב RCF 2000 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- Resuspend תאים מים צנטריפוגות שוב.
- Resuspend בפתרון 1 מ"ל spheroplasting. דגירה של כ -30 דקות ב -30 ° C (אתה יכול לאשר את היעילות spheroplasting ידי מיקרוסקופית).
- צנטריפוגה ב RCF 800 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר לחלוטין supernatant.
- Resuspend spheroplasts pelleted במאגר 100 מ"ל תמוגה.
- מכסים את הבלוק עם קלטת מערבולת על מהירות גבוהה במשך 2 דקות.
- גלולה הסלולר פסולת בבית RCF 4000 דקות 2.
- מוציאים בזהירות supernatant למיכל חדש, למשל, גם צלחת 96-PCR.
- אם תרצה, תוכל לקבוע את הריכוז של חלבון lysates.
- הוסף חוצץ מדגם 4X את דגימות כדי ליצור lysates המכיל 1X חיץ המדגם. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- טען ג'ל. אם תרצה, תוכל לחסוך חצי נפח מדגם להרתיח אותו לניתוח SDS-PAGE. על מנת לנטר את מידת העברת מאוחר יותר, כוללים מראש מוכתם SDS-PAGE הסמן. בנוסף, סמן משקל מולקולרי המורכב של חלבונים גדולים מאוד (למשל, עוף הפקטוראלי לחלץ) יכול לשמש כדי להעריך גודל של מתחמי נפתרה.
- הפעלה במתח נמוך (3 ≤ V / ס"מ אורך ג'ל) עד הכניסה לצבוע מגיע ~ 1 ס"מ מהקצה של הג'ל. זה ייקח כמה שעות. חשוב הג'ל להישאר רגוע, אחרת דיפוזיה של חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך (לדוגמה, מונומרים) יכול להגביל את גילוי שלהם.
חלק 3: העברת
- חותכים פיסת nitrocellulose לממדי כמו הג'ל.
- חותכים 20 חתיכות של GB004 ו -8 פיסות נייר סופג GB002, לממדי כמו הג'ל. חותכים חתיכה נוספת של GB004 לשמש הפתיל; לעשות את זה על 20 סנטימטרים יותר מאשר הג'ל.
- לטבול את nitrocellulose, פתילה, ו 4 חתיכות של GB002 ב 1X כפות.
- במיכל פלסטיק, להרכיב את ערימת ניירות כדלקמן: 20 חתיכות של GB004 יבש, אז 4 חתיכות של GB002 יבש, אז חתיכה אחת של GB002 מראש רטוב. הנח את nitrocellulose על גבי זה בערימה.
- שוטפים את הג'ל על בקצרה את מגש הליהוק במים כדי להסיר את החיץ פועל עודף. ואז, בזהירות מתחילים להחליק את הג'ל את המגש על הערימה. אמנם החלקת ג'ל את המגש, לכבות את הממברנה עם כפות לפי הצורך. חיץ נוסף עוזר למנוע בועות מלהפוך לכודים תחת הג'ל. פיפטה להעביר עובד היטב למטרה זו.
- לאחר ג'ל הועברה מחסנית, לבדוק ביסודיות על בועות. אם יש כאלה, להרים את קצה הג'ל ולהחיל מחדש חוצץ עד בועות יכול להיות עבד החוצה.
- שמים את יתרת three מראש הרטובות GB002 חתיכות על גבי הג'ל. ודא קשר יסודי בין כל השכבות על ידי גלגול פיפטה בחוזקה לרוחב החלק העליון של המחסנית.
- הצלע מחסנית העברה עם שני מגשים גבוהות המכיל כפות. לכסות את הפתיל מראש רטוב על פני מחסנית כזו או סוף הפתיל הוא שקוע כפות.
- מכסים את הערימה העברת התאספו עם מגש פלסטיק נוספת נושאת משקל נוסף (למשל, בקבוק 500 מ"ל מים).
- אפשר להמשיך להעביר מינימום של שלוש שעות, או למשך הלילה.
- לאחר ההעברה, הקרום יכול להיות מעובד על ידי תקן המערבי סופג.
Spheroplasting פתרון
1.2 מ 'ד סורביטול
0.5 mM MgCl 2
20 מ"מ טריס, pH 7.5
BME 50 מ"מ (להוסיף טרי)
0.5 מ"ג / מ"ל Zymolyase 100T (להוסיף צח)
coration: להדגיש: "> תמוגה הצפת
100 מ"מ טריס 7.5
50 mM NaCl
10 mM BME (להוסיף צח)
מעכבי פרוטאז (להוסיף צח)
לדוגמא 4X הצפת
טה 2X
20% גליצרול
8% SDS
כחול bromophenol להעדפה
Discussion
SDD-AGE דווח לראשונה על ידי Kryndushkin et al. 1, ללמוד SDS עמידים קומפלקסים של [PSI +] הפריון של שמרים, ומצא כי השימוש הנרחב ללמוד הן הפריון ואת הפריון הלא אגרגטים 2-9. עם זאת, העברה של חלבונים כדי אלקטרופורזה קרום הבאים ג'ל agarose הוא בעייתי, והוא יכול להביא תמונה כתם מעוות 5. בנוסף, טכניקה electroblotting שקוע הנפוץ ביותר מציג מגבלות מעשיות בגודל של הג'ל ולכן מספר דגימות כי יכול להיות מעובד. אנחנו צריכים לטפל בבעיות אלה על ידי המעסיק להעביר נימי כלפי מטה 10, הליך פשוט אשר משתמשת ערמת ניירות סופג יבש להעברת חלבונים מן הג'ל על קרום nitrocellulose. העברת נימי מונע עיוות ומאפשר ג'לים גדול להיות מעובד בנקל. יש כמה דברים לשקול לפני השימוש SDD-AGE. לקבלת דוגמיות גולמי (למשל, lysates), immunodetection של חלבונים מסוימים הוא הכרחי. SDD-AGE אינו מלא לפגל קומפלקסים חלבונים של עניין, כל כך את החלבון (ים) כדי להתגלות חייב לשאת תג epitope מחוץ לאזור amyloidogenic. Lysates יכולים בדרך כלל להיות מוכנים כפי שהם היו להיות נורמלי SDS-PAGE, עם שני הבדלים חשובים. ראשית, הטיפול חייב להילקח מוגברת כדי למנוע השפלה ידי proteolysis. התנאים חלקית denaturing משמש כאן אינם מספיקים כדי להשבית פרוטאזות, והוא יכול גם לייצר חלבונים היעד רגישים יותר proteolysis. השתמש קוקטייל להשלים מעכבי פרוטאז בריכוז לפחות כפולה מומלץ. שנית, חימום הדגימות יש להימנע. אם פקד כל מונומר שלילי הרצויה, למשל כדי לאשר גבוהה מולקולרית משקל מינים שאינם בשל שינויים קוולנטיים, דגירה של 10 דקות בשעה 95 ° C יכול לשמש, אשר תשחזר ביותר amyloids לחלבון monomeric.
Acknowledgments
אנו מודים סיימון אלברטי לסיוע בפיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם מכון הבריאות הלאומי (GM25874), הווארד יוז רפואי Investigatorship המכון (ל SL), וכן הקרן הלאומית למדע מענק predoctoral הכשרה (עד ר"ה).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zymolyase 100T | Seikagaku Corporation | 120493-1 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78429 | |
| Hybond-C extra nitrocellulose | Amersham | RPN303E | |
| GB004 blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 10427926 | |
| GB002 (3MM Chr) blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-917 | |
| Agarose (UltraPure) | Invitrogen | 15510-027 |
References
- Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).
- Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION. J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).
- Allen, K. D., et al. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+]. Genetics. 169, 1227-1242 (2005).
- Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation. The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).
- Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase. Current Genetics. 49, 21-29 (2006).
- Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids. J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).
- Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability. Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).
- Douglas, P. M., et al. Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).
- Nagy, B., Costello, R., Csako, G. Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping. Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).
